CN117965571A - 一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用 - Google Patents
一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用。所述代谢改造包括：以枯草芽孢杆菌为宿主菌，过表达如SEQ ID No:1所示的NMN合成基因pncB，敲除如SEQ ID No:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA及如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN，以及过表达如SEQ ID No:4所示的NMN转运蛋白；经代谢改造后的基因工程菌能够利用内源的烟酰胺代谢途径，在发酵培养中自主合成烟酰胺单核苷酸。本发明通过枯草芽孢杆菌内源的烟酰胺代谢途径合成NMN，以及对微生物发酵生长优化，提供了一种可持续、经济高效的NMN生产方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶工程及微生物发酵领域，更具体地涉及一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种重要的生物活性分子，在细胞能量代谢和抗衰老领域具有广泛的应用前景。近年来，人们发现其具备多种生物功能，对心脑疾病、老年退行疾病、神经退行疾病、延缓衰老等有治疗作用。目前，中国营养健康产业规模已经超过7 000亿元，成为仅次于美国的第二大市场。最新研究表明：口服NMN导致NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)回升，可使与人类接近的生物模型体系寿命延长30％以上。还有研究也证明了NMN与衰老相关疾病具有显著相关性。因此，NMN成为抗衰老保健品、化妆品等领域的热点产品。NMN现有的国内市场容量约为10吨左右，且正处于高速增长期，未来有可能达到百吨级以上规模。
NMN的生产方法对于满足市场需求和推动相关研究具有重要意义。然而，现有的NMN生产方法不完全是生物发酵法，目前的工业生产包括了化学催化技术，其所用试剂及生产后的排放均对环境及食品的安全性造成一定的影响，也带来包括低产量、高成本和不可持续性等问题。因此，寻找一种高效、经济可行的NMN生产方法成为目前的研究热点。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种常见的细菌，具有广泛的应用潜力。该菌株在工业生产中被广泛使用，具有良好的生长特性和遗传可操作性。同时，枯草芽孢杆菌还是一种食品安全菌，使其广泛被应用于食品药品生产领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用，从而解决现有技术缺乏一种高效、经济可行的烟酰胺单核苷酸生产方法的问题。
为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种NMN合成基因pncB，所述NMN合成基因pncB来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
NMN合成酶，该酶原被注释为烟酸磷酸转移酶，以烟酰胺为底物反应时无需转氨酶参与，可将烟酰胺直接通过发酵生产为NMN。所述NMN合成酶的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，可使用高效的T7启动子对该酶进行过表达。
根据本发明的第二方面，提供一种经代谢改造的基因工程菌，通过过表达如SEQIDNo:1所示的NMN合成基因pncB，获得一种经代谢改造的基因工程菌，所述基因工程菌能够利用内源的烟酰胺代谢途径，在发酵培养中自主合成烟酰胺单核苷酸。
所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌、棒状杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、链霉菌、酵母菌。
根据本发明的第三方面，提供一种经代谢改造的基因工程菌，所述代谢改造包括：以枯草芽孢杆菌为出发菌株，过表达如SEQ ID No:1所示的来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的NMN合成基因pncB，敲除如SEQ ID No:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA及如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN，以及过表达如SEQ ID No:4所示的NMN转运蛋白；所述经代谢改造后的基因工程菌能够利用内源的烟酰胺代谢途径，在发酵培养中自主合成烟酰胺单核苷酸，并且不表达利用和降解NMN的酶，使细胞能够高效积累NMN。
根据本发明的第四方面，提供一种经代谢改造的基因工程菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：S1：构建一种NMN合成酶表达质粒；S2：构建一种不能降解和利用NMN的基因工程菌，使细胞能够积累NMN；S3：在步骤S2构建的基因工程菌的基础上，构建一种过表达NMN转运蛋白以提高NMN发酵分泌量的基因工程菌；S4：将步骤S1中构建的NMN合成酶表达质粒转化到步骤S3构建的基因工程菌中，即可获得一种可发酵生产烟酰胺单核苷酸的基因工程菌。
本发明对枯草芽孢杆菌中羧酸脱羧和转氨酶(CinA)及二磷酸酶YfkN开展了基因敲除，因CinA可将NMN脱胺变为NAMN(烟酸单核苷酸)、YfkN可去除NAMN的磷酸基团生成NR(烟酰胺核糖)，相关的NMN内源代谢基因的序列分别如SEQ ID No:2及SEQ ID No:3所示。
本发明还通过增加NMN转运蛋白的表达水平，成功地提高了NMN从细胞内转运到细胞外的效率。通过优化转运蛋白的表达水平和转运效率，NMN的积累量显著增加，从而提高了NMN的产量。NMN转运蛋白的序列如SEQ ID No:4所示。
优选地，所述步骤S1包括：将如SEQ ID No:1所示的来自枯草芽孢杆菌的NMN合成基因pncB插入到载体质粒中，构建得到NMN合成酶表达质粒。
作为优选实施方案，所述NMN合成酶的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
根据本发明的一个优选方案，所述步骤S2包括：以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组为模板，敲除如SEQ ID No:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA以及如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN。
根据本发明的一个优选方案，所述步骤S2包括以下子步骤：S21：以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板，分别用引物扩增CinA位点上游同源臂U-pgsA、红霉素抗性片段ermC、CinA位点下游同源臂D-recA；S22：对U-pgsA、ermC、以及D-recA这三个片段开展融合PCR，获得融合片段M1，再将该融合片段M1转化到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中获得敲除SEQID No:2所示基因的重组枯草芽孢杆菌N1；S23：以重组枯草芽孢杆菌N1基因组为模板，分别用引物扩增yfkN位点上游同源臂U-yfkL、红霉素抗性片段ermC、yfkN位点下游同源臂D-hypO；S24：对U-yfkL、ermC、D-hypO这三个片段开展融合PCR，获得融合片段M2，再将该融合片段M2转化到重组枯草芽孢杆菌N1中获得敲除SEQ ID No:3所示基因的重组枯草芽孢杆菌N2。
根据本发明的一个优选方案，所述步骤S3包括以下子步骤：S31：以枯草芽孢杆菌N2基因组为模板，分别用引物扩增CinA位点上游同源臂U-pgsA，用引物扩增红霉素抗性片段ermC，以及用引物扩增pnuC位点下游同源臂D-recA；并以合成的pnuC的DNA片段为模板，用引物扩增获得pnuC；S32：对U-pgsA、ermC、D-recA以及PnuC这四个片段开展融合PCR，获得融合片段M3，再将该融合片段M3转化到重组枯草芽孢杆菌N2中，获得重组枯草芽孢杆菌164M。
所述步骤S4包括：将步骤S1构建的NMN合成酶表达质粒转化到重组枯草芽孢杆菌164M中，即可获得一种可发酵生产烟酰胺单核苷酸的重组枯草芽孢杆菌164N。
根据本发明的第五方面，提供一种利用所述基因工程菌在发酵生产NMN中的应用。
根据本发明的第六方面，提供一种利用所述基因工程菌发酵生产NMN的方法，向初始培养基中添加5～20g/L烟酰胺，发酵培养所述基因工程菌，在发酵过程中向培养基中添加补充碳源，实现烟酰胺单核苷酸的发酵生产。
根据本发明的一个优选方案，所述初始培养基为LB培养基，所述补充碳源优选为0～20g/L甘油和10～30g/L葡萄糖，最优选为5g/L甘油和20g/L葡萄糖。
本发明提供了一种利用新的NMN合成代谢路径的重组微生物生产NMN的方案，利用NAD从头合成途径由中间产物磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和外源添加底物NAM一步催化生成NMN。NAM的原料成本低廉，规模化生产工艺成熟；本发明利用枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵来实现，与利用酵母的现有技术相比，流程简单，发酵周期短。
本发明的关键发明点主要在于，首次发现一种可以提高NMN产量的关键酶NMN合成基因pncB，所述NMN合成基因pncB来自枯草芽孢杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。另一发明点在于，首次利用食品安全微生物实现了NMN的发酵生产，同时还通过代谢工程找到了提高NMN积累的降解酶，显著提高了NMN的产量和纯度，并可以降低生产成本。此外，该方法还具有易于操作、扩展性强等特点，为大规模工业生产提供了进一步优化的技术基础。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明制备NMN发酵工艺简单、耗时短、成本低，生产流程无污染，易于操作，所呈现的微生物宿主细胞及技术方法，可实现NMN的绿色生物制造，本发明中的微生物菌株不合成脂多糖，为食品安全菌，发酵合成的产品可推动NMN在医药、保健品和相关领域的应用。
综上所述，本发明提供了一种经代谢改造的基因工程菌及其在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用，本发明利用枯草芽孢杆菌的优势和特性，开发了一种高效绿色的NMN生产方法，通过枯草芽孢杆菌内源的烟酰胺代谢途径合成NMN，NMN降解代谢途径的调控，以及对微生物发酵生长优化，实现NMN在菌株发酵培养过程中的积累，提高了其发酵量，可用于NMN的绿色生物合成。总之，本发明提供了一种可持续、经济高效的NMN生产方法，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中所构建的NMN合成酶重组质粒的示意图；
图2为实施例2中重组枯草芽孢杆菌生产菌株M1的构建示意图；
图3为实施例3中发酵生产NMN的流程示意图；
图4为实施例4中枯草芽孢杆菌工程菌摇瓶发酵生产NMN的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中未注明具体条件的操作，按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。以下各实施例中使用的生物材料来源如下：
枯草芽孢杆菌ATCC 6051a为美国模式培养物收藏库(American type culturecollection)的模式菌株，6051a为其收藏号，可从美国ATCC保藏中心购买获得。质粒pMK4购自美国芽孢遗传库保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，保藏号为ECE16P。BL21-DE3大肠杆菌菌株购自Thermo Fisher Scientific，货号：EC0114。所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例中的缩写符号说明：
NMN：烟酰胺单核苷酸
HPLC：高效液相色谱
NAM：烟酰胺
NR：烟酰胺核糖
实施例1：NMN合成酶表达质粒的构建
本实施例部分所使用的引物序列(SEQ ID No:5-8)及用途如下表1所示。
表1
| 名称 | 序列(5'-3') | 用途 |
| pMK4F | ccgtactctaacacggtatatcctcctt | 扩增NMN合成基因pncB |
| pMK4R | agcttgaggaagaataactgctaacaaagcccgaa | 扩增NMN合成基因pncB |
| pncBF | gaaaggaggatataccgtgttagagtac | 扩增NMN合成基因pncB |
| pncBR | ttcgggctttgttagcagttattcttc | 扩增NMN合成基因pncB |
pMK4F和pMK4R，pncBF和pncBR，用于扩增SEQ ID No:1，并将其插入至pMK4-T7载体，pMK4-T7的构建另见发明专利CN112226451A。
来自枯草芽孢杆菌的NMN合成基因pncB经过以枯草芽孢杆菌自身为模板，以pncBF、pncBR为上下游引物，经过Pcr纯化后获得，再经过PCR克隆，pncB克隆至pMK4-T7，该表达质粒包括筛选标记，复制起始点，多克隆位点以及与宿主细胞相适应的启动子元件见图1。目的基因的扩增体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL(10μM)相应的扩增引物，0.5μL模板，19.5μL去离子水。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火55℃15S，延伸72℃2min，循环数30。PCR产物直接转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞。使用Axygen质粒小提试剂盒提取质粒，提质粒方法参照产品说明书，即可得到NMN合成酶的表达质粒pMK4-pncB，其含有的编码NMN合成酶的DNA片段序列如SEQ ID No:1所示。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌N3的构建
本实施例部分所使用的引物序列SEQ ID No:9-25及用途如下表2所示。
表2
重组枯草芽孢杆菌N3是在枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上敲除如SEQ IDNo:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA和如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN，以及过表达如SEQ ID No:4所示的NMN转运蛋白而来。
2.1敲除SEQ ID No:2所示基因的重组枯草芽孢杆菌N1的具体构建方法如下：
首先通过融合PCR制备线性DNA片段，它由3个单独的片段构成，这3个片段分别是U-pgsA、ermC、以及D-recA。首先，以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板，分别用引物CinAF及CinAR扩增CinA位点上游同源臂U-pgsA，用引物comErmF1及comErmR1扩增红霉素抗性片段ermC。用引物CinA2F及CinA2R扩增CinA位点下游同源臂D-recA。使用2×PhantaMaster Mix扩增上述3个DNA片段，PCR体系为25μL2×Phanta Master Mix，2.5μL F端引物(10μM)，2.5μL R端引物(10μM)，0.5μL模板，19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃1-3min，循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收。对上述3个片段U-pgsA、ermC以及D-recA开展融合PCR，方法如下：PCR反应配置体系为10μL 2×Phanta Master Mix，3个片段U-pgsA、ermC以及D-recA各200ng，添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火60℃15sec，延伸72℃3min，循环数10；再进行二轮融合PCR，反应配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL的CinAF(10μM)，2.5μL CinA2R(10μM)，1μL第一轮PCR反应产物，19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃3min，循环数30，从而获得融合片段M1。再将获得的融合片段M1转化到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中，并均匀涂在含有10μg/mL红霉素抗性平板上，置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，阳性转化子为成功将SEQ ID No:2替换为红霉素抗性基因erm的重组枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组上的菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2×Phanta Master Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的转化子即为成功整合的转化子，即重组枯草芽孢杆菌N1。
2.2敲除SEQ ID No:3所示基因的重组枯草芽孢杆菌N2的具体构建方法如下：
首先制备线性DNA片段，它由3个单独的片段经过融合PCR获得，这3个片段分别是U-yfkL、ermC、以及D-hypO。首先，以N1基因组为模板，分别用引物yfkNF及yfkNR扩增yfkN位点上游同源臂U-yfkL，用引物comErmF2及comErmR2扩增红霉素抗性片段ermC。用引物yfkN2F及yfkN2R扩增yfkN位点下游同源臂D-hypO。使用2×Phanta Master Mix扩增上述3个DNA片段，PCR体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL F端引物(10μM)，2.5μL R端引物(10μM)，0.5μL模板，19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃2min，循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTMDpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 12测定DNA片段的浓度。使用融合PCR的方法将上述3个片段U-yfkL、ermC、D-hypO融合，融合PCR的方法如下：PCR反应配置体系为10μL 2×Phanta MasterMix，3个片段各200ng，添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火60℃15sec，延伸72℃3min，循环数10；再进行二轮融合PCR，反应配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL yfkNF(10μM)，2.5μLyfkN2R(10μM)，1μL第一轮PCR反应产物，19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃3min，循环数30，从而获得融合片段M2。再将获得的融合片段M2转化到枯草芽孢杆菌N1中，并均匀涂在含有10μg/mL红霉素抗性平板上，置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，阳性转化子为成功将SEQ ID No:3替换为红霉素抗性基因erm的重组枯草芽孢杆菌菌落。以所挑取的阳性转化子菌株为模板，用2×Phanta Master Mix扩增整合的片段，PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。对测序结果经比对无误的转化子即为成功整合的转化子，即重组枯草芽孢杆菌N2。
2.3过表达SEQ ID No:4所示基因(选取位点为敲除SEQ ID No:2的原位点)的重组枯草芽孢杆菌N3的具体构建方法如下：
首先制备线性DNA片段，SEQ ID No:4由4个单独的片段经过融合PCR获得，这4个片段分别是U-pgsA、ermC、PnuC以及D-recA。PnuC为基因合成片段。首先，以枯草芽孢杆菌N2基因组为模板，分别用引物CinAF及CinAR扩增U-pgsA，用引物comErmF1及comErmR3扩增ermC以及用引物pnuC2F及pnuC2R扩增D-recA；以由生工合成的pnuC的DNA片段为模板，用pnuCF及pnuCR为引物，扩增后获得pnuC DNA片段。再使用2×Phanta Master Mix扩增上述4个DNA片段，PCR体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μLF端引物(10μM)，2.5μLR端引物(10μM)，0.5μL模板，19.5μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃1-3min，循环数30。上述PCR产物使用QuickCutTM Dpn I进行消模板处理，操作方法参照商品说明书，然后用AxyPrep PCR清洁试剂盒进行纯化回收，回收方法按说明书操作，使用Nanodrop 12测定DNA片段的浓度。使用融合PCR的方法将上述4个片段U-pgsA、ermC、PnuC以及D-recA融合，融合PCR的方法如下：PCR反应配置体系为10μL 2×PhantaMaster Mix，4个片段各200ng，添加ddH2O至体系为20μL。进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火60℃15sec，延伸72℃3min，循环数10；再进行二轮融合PCR，反应配置体系为25μL 2×Phanta Master Mix，2.5μL正向引物CinAF(10μM)和2.5μL反向引物pnuC2R(10μM)，1μL第一轮PCR反应产物，19μL ddH2O。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15sec，退火55℃15sec，延伸72℃3min，循环数30，从而获得融合片段M3。再将获得的融合片段M3转化到枯草芽孢杆菌N2中，并均匀涂在含有10μg/mL红霉素抗性平板上，置于37℃恒温箱培养过夜。通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，阳性转化子为成功整合PnuC到枯草芽孢杆菌N2的基因组上的菌落，即重组枯草芽孢杆菌N3。
实施例3：重组质粒转化宿主细胞及摇瓶发酵产NMN
将实施例1中获得的NMN合成酶表达质粒转化到实施例2制备的宿主细胞重组枯草芽孢杆菌N3中，即可获得重组枯草芽孢杆菌164N。其过程如图3所示。
具体地，将100ng重组质粒加入到500μL重组枯草芽孢杆菌164F感受态细胞中，在37℃孵育2h，随后将细胞悬液涂在对应抗性平板上，置于37℃恒温箱培养过夜，通过菌落PCR鉴定所长出的转化子，并完成测序验证。
发酵培养基选择为LB培养基，组分为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉和10g/LNaCl。将制备的重组枯草芽孢杆菌164N在LB固体平板上划线活化，然后挑取单菌落培养在装有3mL LB培养基的试管，在37℃恒温培养箱中200rpm震荡过夜培养。取培养物0.5mL接种到装有50mL新鲜LB培养基的500mL摇瓶中，继续在37℃恒温振荡培养箱中200rpm培养。在细胞生长6h后，添加20g/L甘油作为碳源并同时加入10g/L的烟酰胺于培养基中，同时通过液相检测NMN生产情况。方法如下：使用4.6x 250mm的色谱柱，该柱由Thermo Fisher Scientific公司提供。在分析过程中，温度设定为30℃，以确保分离效果和稳定性。流动相是由20mM的乙酸铵和乙腈按95:5的体积比混合而成，流速设置为1.0mL/min。结果显示：图4中的a为重组枯草芽孢杆菌N2所生产的NMN，其产量为202.91mg/L；图4中的b为重组枯草芽孢杆菌N3在以甘油和烟酰胺为原料进行补料发酵后的产量，为335.67mg/L，二者相比野生型枯草芽孢杆菌均在一定程度上提高了NMN的产量。
实施例4：重组枯草芽孢杆菌164N生产NMN培养基的优选
以重组枯草芽孢杆菌164N菌种为例发酵产NMN，发酵的初始培养基为添加了10g/L烟酰胺的LB培养基，常规碳源包括葡萄糖和甘油等。为了确定碳源偏好性，我们利用枯草芽孢杆菌164N培养进行碳源的优化测试，在发酵过程中的第6小时向培养基中添加补充碳源。在发酵过程中，添加的碳源浓度为0～10g/L甘油以及10～30g/L葡萄糖不等，发酵过程中监测产物NMN的积累量和细胞密度(OD600)。根据图4中的c的实验结果显示，当补充的碳源为5g/L甘油混加20g/L葡萄糖时，在50mL摇瓶中，外源性NMN的积累在发酵过程中的96小时显著增加至1.21g/L，NMN产量达到最高。结合实施例3和实施例4，说明了以葡萄糖和甘油为碳源，NMN的产量得到大幅提升。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种NMN合成基因pncB，其特征在于，所述NMN合成基因pncB来自枯草芽孢杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种经代谢改造的基因工程菌，其特征在于，通过过表达如SEQ ID No:1所示的NMN合成基因pncB，获得一种经代谢改造的基因工程菌，所述基因工程菌能够利用内源的烟酰胺代谢途径，在发酵培养中自主合成烟酰胺单核苷酸。
3.一种经代谢改造的基因工程菌，其特征在于，所述代谢改造包括：以枯草芽孢杆菌为出发菌株，过表达如SEQ ID No:1所示的来自枯草芽孢杆菌的NMN合成基因pncB，敲除如SEQID No:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA及如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN，以及过表达如SEQ ID No:4所示的NMN转运蛋白；所述经代谢改造后的基因工程菌能够利用内源的烟酰胺代谢途径，在发酵培养中自主合成烟酰胺单核苷酸，并且不表达利用和降解NMN的酶，使细胞能够高效积累NMN。
4.一种如权利要求3所述的经代谢改造的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1：构建一种NMN合成酶表达质粒；
S2：构建一种不能降解和利用NMN的基因工程菌；
S3：在步骤S2构建的基因工程菌的基础上，构建一种过表达NMN转运蛋白以提高NMN发酵分泌量的基因工程菌；
S4：将步骤S1中构建的NMN合成酶表达质粒转化到步骤S3构建的基因工程菌中，即可获得一种可发酵生产烟酰胺单核苷酸的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1包括：将如SEQ ID No:1所示的来自枯草芽孢杆菌的NMN合成基因pncB插入到载体质粒中，构建得到NMN合成酶表达质粒；
所述步骤S2包括：以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的基因组为模板，敲除如SEQ ID No:2所示的羧酸脱羧和转氨酶基因CinA以及如SEQ ID No:3所示的二磷酸酶基因YfkN。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下子步骤：
S21：以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板，分别用引物扩增CinA位点上游同源臂U-pgsA、红霉素抗性片段ermC、CinA位点下游同源臂D-recA；
S22：对U-pgsA、ermC、以及D-recA这三个片段开展融合PCR，获得融合片段M1，再将该融合片段M1转化到枯草芽孢杆菌ATCC 6051a中获得敲除SEQ ID No:2所示基因的重组枯草芽孢杆菌N1；
S23：以重组枯草芽孢杆菌N1基因组为模板，分别用引物扩增yfkN位点上游同源臂U-yfkL、红霉素抗性片段ermC、yfkN位点下游同源臂D-hypO；
S24：对U-yfkL、ermC、D-hypO这三个片段开展融合PCR，获得融合片段M2，再将该融合片段M2转化到重组枯草芽孢杆菌N1中获得敲除SEQ ID No:3所示基因的重组枯草芽孢杆菌N2。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下子步骤：
S31：以枯草芽孢杆菌N2基因组为模板，分别用引物扩增CinA位点上游同源臂U-pgsA、红霉素抗性片段ermC、扩增pnuC位点下游同源臂D-recA；并以合成的pnuC片段为模板，用引物扩增获得pnuC；
S32：对U-pgsA、ermC、D-recA以及PnuC这四个片段开展融合PCR，获得融合片段M3，再将该融合片段M3转化到重组枯草芽孢杆菌N2中，获得重组枯草芽孢杆菌N3。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S4包括：将步骤S1构建的NMN合成酶表达质粒转化到重组枯草芽孢杆菌N3中，即可获得一种可发酵生产烟酰胺单核苷酸的重组枯草芽孢杆菌164N。
9.一种利用如权利要求2～3中任意一项所述的基因工程菌在发酵生产NMN中的应用。
10.一种利用如权利要求2～3中任意一项所述的基因工程菌发酵生产NMN的方法，其特征在于，向初始培养基中添加5～20g/L烟酰胺，发酵培养如权利要求2～3中任意一项所述的基因工程菌，在发酵过程中向培养基中添加补充碳源，实现烟酰胺单核苷酸的发酵生产。
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