CN116574768A - 一种一锅酶法制备l-5-mthf的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物合成领域，公开了一种一锅酶法制备L‑5‑MTHF的方法。本发明提供方法通过往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，使叶酸在二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化下，发生不对称加氢反应，得到中间体化合物L‑四氢叶酸，后经四氢叶酸甲基转移酶(DmdA)催化得到具有光学纯的L‑5‑MTHF。本发明一锅酶法可以避免中间产物分离的步骤，同时，产生的中间体现时转化为产物L‑5‑MTHF，即产即用，避免了产物抑制的问题。本发明方法制备L‑5‑MTHF具有高产率，有极大的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成领域，尤其涉及一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法。
背景技术
L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是食物源天然叶酸的主要形式，也是人体血浆和血液循环中发现的唯一叶酸形式，被用于组织间的叶酸转运。L-5-MTHF可在体内循环中直接被吸收和利用，不需要额外的代谢步骤，比合成叶酸具有更高的生物利用度。此外，最近的研究表明，L-5-MTHF是唯一可以渗透通过血脑屏障的叶酸类药物，具有防治阿尔茨海默病的作用，同时也可以作为广谱抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂。所以，L-5-MTHF是最具生物活性和功能的叶酸形式。美国、日本和欧洲已经批准将L-5-MTHF作为一种食品添加剂添加到各种食品中，这也使得L-5-MTHF的市场需求量剧增。
L-5-MTHF含有两个手性碳原子，特别是C5和C6之间的双键加氢时，容易形成旋光异构体，包括6R-5-MTHF(即D-5-MTHF)和6S-5-MTHF(即L-5-MTHF)。其中(6S)构型的L-5-MTHF是自然存在的唯一形式，具有良好的药效，而6R构型的D-5-MTHF不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。
L-5-MTHF的合成主要以叶酸为前体，包括化学法、酶-化学法、微生物发酵法等。
化学合成方法是现有工业生产中合成L-5-MTHF使用较为普遍的方法。化学合成方法有催化加氢法、硼氢化钠还原法、连二亚硫酸钠还原法和二氢叶酸还原酶法等。如硼氢化钠还原法，该方法使用NaBH4作为还原剂，将叶酸还原生成THF消旋体混合物，然后分离进行甲基化获得L-5-MTHF。硼氢化钠还原法具有的缺点是：①NaBH4具有强烈刺激性，极易燃烧，有安全隐患；②产物是外消旋混合物，分离困难；③生产步骤较多，生产较烦琐。
再如申请公布号为CN114874216A的中国专利提供了一种L-5-甲基四氢叶酸的制备方法，也是通过化学法合成L-5-MTHF。该专利合成L-5-甲基四氢叶酸的技术方案为：以叶酸为原料，还原制得中间体6-(R,S)-四氢叶酸；然后将6-(R,S)-四氢叶酸经过手性拆分，制得中间体6-S-四氢叶酸盐；最后将中间体6-S-四氢叶酸盐在缓冲液中经过甲基化反应制得L-5-甲基四氢叶酸。该专利提供方法将手性拆分提前在第二步，但仍然无法避免颇具难度的手性拆分步骤，另外，该方法步骤也较为繁杂，在工业应用中生产成本较高。
现有技术中，也有通过微生物发酵法制备L-5-MTHF。该方法是依赖于能够在胞内积累较高浓度的叶酸和L-5-MTHF的微生物，通过发酵制备获得L-5-MTHF。一般通过自然界筛选、诱变育种和基因工程育种等方法获得高产菌株。但是，由于叶酸类化合物属于胞内代谢的辅酶因子，存在多重的动态平衡调节，所以，其胞内积累的浓度十分有限。已有报道的微生物菌株以及经过基因组改造的菌株，发酵生产L-5-MTHF的水平都低于1.3mg/L。
现有技术中，还有通过酶法和化学法结合的方式制备L-5-MTHF。酶-化学法是依赖二氢叶酸还原酶(DHFR)法的活性，将二氢叶酸(DHF)还原成6S构型的四氢叶酸(6S-THF)，随后采用化学法进行转甲基反应。但在酶催化体系中，首先存在的问题是DHFR的活性受到产物6S-THF的抑制调节，其转化率受到一定限制，其次，6S-THF稳定性差，极易造成损失，若再进一步分离提取用于下一步的化学法甲基化反应，其产物得率低。
为了解决上述现有技术中的问题，本发明团队致力于开发出一种产率高、生产步骤简单、安全温和的方法制备L-5-甲基四氢叶酸。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法。本发明提供方法为全酶法催化转化的方法，条件温和安全，同时，本发明方法采用一锅法制备工艺，步骤简单，并避免了中间产物分离问题及酶催化体系的产物抑制问题。本发明提供的一锅酶法制备L-5-甲基四氢叶酸的工艺，具有高产率的特点，具有极大的应用价值和市场前景。
本发明的具体技术方案为：
本发明提供了一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，包括以下步骤：
往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，催化反应，得到L-5-MTHF。
本发明采用一锅酶法制备工艺制备L-5-甲基四氢叶酸。在本发明方法中，体系中的底物化合物(Ⅱ)，即叶酸，首先在二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化下，发生不对称加氢反应，得到中间体化合物(Ⅲ)，即L-四氢叶酸6S-THF，后经四氢叶酸甲基转移酶(DmdA)催化得到具有光学纯的L-5-MTHF。本发明一锅酶法可以避免中间产物分离的步骤，本方法中，产生的中间体6S-THF现时转化为产物L-5-MTHF，即产即用，并消除了产物抑制的缺点，本发明方法以10g/L的叶酸为底物进行催化反应10h，底物的转化率大于90％，可实现酶法的高效制备L-5-MTHF。本发明合成工艺在公开文献中，尚未见报道。工艺路线如下所示：
上述二氢叶酸还原酶为源于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的XcaDHFR(SEQ IDNO.2，NCBI登录号为WP_011036024.1)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)的LasDHFR(SEQ ID NO.4，NCBI登录号WP_014568348.1)、嗜碱耐盐性芽孢杆菌(Bacillus halodurans C-125)的BhaDHFR(SEQ ID NO.6，NCBI登录号为WP_010899586.1)和人源(Homo sapiens)的双突变体hDHFR-35K64F(SEQ ID NO.8，NCBI登录号为3N0H_A)。二氢叶酸还原酶XcaDHFR、LasDHFR、BhaDHFR和hDHFR-35K64F基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示，编码氨基酸序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示。
将二氢叶酸还原酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7分别将其克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)，构建相应的重组大肠杆菌工程菌，表达纯化得到二氢叶酸还原酶。需要说明的是，二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示序列具有>80％的同源性，均应纳入本发明的保护范围。
上述四氢叶酸甲基转移酶为源于海洋微生物(Pelagabacter ubique)的二甲基巯基丙酸(Dimethylsulfoniopropionate，DMSP)依赖性脱甲基酶DmdA(SEQ ID NO.10，NCBI登录号为WP_011281570.1)，编码该四氢叶酸甲基转移酶氨基酸序列SEQ ID NO.10的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
将四氢叶酸甲基转移酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.9克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)，构建相应的重组大肠杆菌工程菌，表达纯化得到四氢叶酸甲基转移酶。需要说明的是，四氢叶酸甲基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.10所示序列具有>80％的同源性，均应纳入本发明的保护范围。
作为本发明的优选，所用二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示序列具有≥90％的同源性，更优选地，为具有≥95％的同源性。
作为本发明的优选，所用四氢叶酸甲基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.10所示序列具有≥90％的同源性，更优选地，为具有≥95％的同源性。
作为本发明的优选，催化反应系统中加入二甲基巯基丙酸(DMSP)作为甲基供体底物。优选地，催化反应系统中还加入NAD(P)依赖的脱氢酶及底物。
本发明一锅酶法催化叶酸转化为L-5-甲基四氢叶酸的酶系统中，需要以NAD+或NADP+为辅酶底物，即以NAD(P)依赖的脱氢酶及其底物为辅酶循环系统。以NAD(P)依赖的脱氢酶及其底物为辅酶循环系统，可使制备L-5-甲基四氢叶酸具有较高的产率。
优选地，脱氢酶选自醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶与甲酸脱氢酶。底物选自异丙醇、葡萄糖与甲酸。
作为本发明的优选，催化反应的温度为25～40℃，催化反应的pH为7.0～9.0。在温度为25～40℃、pH为7.0～9.0的反应环境中，可使叶酸转化生成L-5-甲基四氢叶酸具有较高的产率。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明提供方法以全酶法催化叶酸转化合成L-5-甲基四氢叶酸，条件温和，避免了现有技术中普遍使用的化学法合成L-5-甲基四氢叶酸的安全隐患。
(2)本发明提供方法使用一锅煮的工艺，避免了酶-化学法合成工艺中的中间产物分离步骤，在本方法中，产生的中间体及时转化为产物L-5-甲基四氢叶酸，即产即用，并解决了酶-化学法中产物抑制的问题。
(3)本发明提供方法相比现有微生物发酵法制备L-5-甲基四氢叶酸，工艺简单，转化产率高。
附图说明
图1为本发明的一种重组质粒pET28a-XcaDHFR的结构示意图；
图2为本发明的一种重组质粒pET21a-hDHFR-35K64F的结构示意图；
图3为本发明实施例2中二氢叶酸还原酶表达的SDS-PAGE分析图；
图4为本发明实施例2中底物叶酸的HPLC分析图谱；
图5为本发明实施例2中DHFR催化叶酸转化的HPLC分析图谱；
图6为本发明的一种重组质粒pET28a-DmdA的结构示意图；
图7为本发明实施例4中四氢叶酸甲基转移酶表达的SDS-PAGE分析图；
图8为本发明实施例4中DmdA催化L-四氢叶酸甲基化的HPLC分析图谱；
图9为本发明实施例9中催化叶酸制备L-5-MTHF反应10h时的HPLC分析图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例中，所使用的LB培养基为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0。发酵培养基质量终浓度组成为：酵母粉12g/L、蛋白胨15g/L、甘油10g/L、Na2HPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L，溶剂为去离子水，pH6.8～7.0。
实施例1构建二氢叶酸还原酶的重组大肠杆菌工程菌
查阅文献并检索NCBI数据库，确定了40个候选的二氢叶酸还原酶，其可能对底物叶酸C5和C6间的双键具有不对称加氢的催化活性。根据40个候选酶对应的基因序列，如表1所示设计上下游引物，对应的来源菌种名称见表2。选取pET-28a(+)为重组表达载体，将扩增的基因插入到NdeⅠ和BamHⅠ为酶切位点之间，构建不同菌株来源的二氢叶酸还原酶重组质粒。
此外，对重组质粒pET28a-EcoDHFR进行点突变，构建大肠杆菌来源的二氢叶酸还原酶突变体EcoDHFR ANLYF。人源二氢叶酸还原酶双突变株的构建方式为：将其对应的氨基酸序列送给基因合成公司(苏州金唯智生物科技有限公司)，人工合成基因(SEQ ID NO.7)，克隆到表达载体pET21a的NdeI与BamHI之间，获得重组质粒pET21a-hDHFR-35K64F。如图1为重组质粒pET28a-XcaDHFR的结构示意图，图2为重组质粒pET21a-hDHFR-35K64F的结构示意图。
表1DHFR重组质粒引物序列表
将各个酶来源基因的重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：取50ng的重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。取50μL菌液，均匀涂布在含有相应抗性(50mg/L卡那霉素/100mg/L氨苄青霉素)的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。挑取菌落PCR为阳性的克隆，经过划线纯化和摇床培养，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到验证正确的阳性克隆子，获得各个酶的重组大肠杆菌，用于后续酶的表达和酶催化活性分析。
实施例2二氢叶酸还原酶的诱导表达和酶活性分析
将实施例1制备的表达不同菌株来源的二氢叶酸还原酶的重组大肠杆菌工程菌接种在含有相应抗性(50mg/L卡那霉素/100mg/L氨苄青霉素)的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含有相应抗性(50mg/L卡那霉素/100mg/L氨苄青霉素)的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养3h，待菌体的OD600到0.6～0.8时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵10h，获得湿菌体的含量为5g/L的发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
取上述粗酶，用于SDS-PAGE电泳分析，确定二氢叶酸还原酶的诱导表达情况，结果如图3所示。
二氢叶酸还原酶对底物叶酸的催化活性分析：在上述二氢叶酸还原酶的粗酶液中，先后加入终浓度为1.0mM NADP+、3％异丙醇、25mM Vc、6mM DTT和1.0g/L的叶酸，将上述反应液置于20mL的圆底烧瓶中，磁力搅拌，37℃反应8h。在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：254nm(叶酸)和290nm(L-四氢叶酸)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。底物叶酸的HPLC图谱如图4所示，保留时间为10.003min；二氢叶酸还原酶催化叶酸进行不对称加氢反应生成产物L-四氢叶酸，其催化过程的HPLC图谱如图5所示，产物L-四氢叶酸的保留时间为5.039min。
各重组大肠杆菌工程菌的催化活性结果如表2所示，进一步进行比较分析，根据其酶活大小，从中确定了4株活性最高的二氢叶酸还原酶重组菌株工程菌为优选菌株，包括大肠杆菌XcaDHFR、LasDHFR、BhaDHFR和hDHFR-35K64F。
其中，来源于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的XcaDHFR的二氢叶酸还原酶氨基酸序列见SEQ ID NO.2，编码基因的核苷酸序列加见SEQ ID NO.1；来源于唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的LasDHFR的二氢叶酸还原酶氨基酸序列见SEQ IDNO.4，编码基因的核苷酸序列加见SEQ ID NO.3；来源于嗜碱耐盐性芽孢杆菌(Bacillushalodurans C-125)的BhaDHFR的二氢叶酸还原酶氨基酸序列见SEQ ID NO.6，编码基因的核苷酸序列加见SEQ IDNO.5；来源于人源(Homo sapiens)的双突变体hDHFR-35K64F的二氢叶酸还原酶氨基酸序列见SEQ ID NO.8，编码基因的核苷酸序列加见SEQ ID NO.7。
表2二氢叶酸还原酶重组菌株催化活性比较
实施例3构建四氢叶酸甲基转移酶的重组大肠杆菌工程菌
查阅文献并检索NCBI数据库，确定了一个四氢叶酸甲基转移酶，其可能具有将6S-四氢叶酸(化合物Ⅲ)转化为L-5-甲基四氢叶酸(化合物Ⅰ)的转甲基化活性。将其基因经人工合成(SEQ ID NO.9)，克隆到表达载体pET28a的NcoI与BamHI之间，获得四氢叶酸甲基转移酶的重组质粒pET28a-DmdA。重组质粒pET28a-DmdA的结构示意图如图6所示。其中，编码基因SEQ ID NO.9所表达的四氢叶酸甲基转移酶的氨基酸序列见SEQ ID NO.10。
将该酶基因的重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：取50ng的重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。取50μL菌液，均匀涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。挑取菌落PCR为阳性的克隆，经过划线纯化和摇床培养，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到验证正确的阳性克隆子，获得该酶的重组大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-DmdA)，简称为E.coli DmdA，用于后续酶的表达和酶催化活性分析。
实施例4四氢叶酸甲基转移酶的诱导表达和酶活性分析
将实施例3制备的重组大肠杆菌工程菌E.coli DmdA接种在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养3h，待菌体的OD600到0.6～0.8时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵10h，获得湿菌体的含量为5g/L的发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
取上述粗酶，用于SDS-PAGE电泳分析，确定四氢叶酸甲基转移酶的诱导表达情况，结果如图7所示。
四氢叶酸甲基转移酶对L-四氢叶酸的催化活性分析：在上述四氢叶酸甲基转移酶的粗酶液中，先后加入终浓度为10mM的DMSP、25mM Vc、6mM DTT、1.0g/L的L-四氢叶酸，将上述反应液置于20mL的圆底烧瓶中，磁力搅拌，37℃反应1h。在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：290nm；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。其催化过程的HPLC图谱如图8所示，产物L-5-甲基四氢叶酸的保留时间为16.353min。
实施例5构建用于辅酶循环系统的重组大肠杆菌工程菌
根据二氢叶酸还原酶的催化作用机理，需要辅酶NAD(P)H因子的。为了提高一锅酶法制备L-5-甲基四氢叶酸的催化反应效率，采用NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统用于该催化反应体系。3种可用于本发明的NAD(P)+/NAD(P)H辅酶循环系统如表3所示，从中选择短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的醇脱氢酶lbADH作为后续实施例的辅酶循环系统。
醇脱氢酶lbADH粗酶液按如下方法制备：取出实验室甘油管冷冻保藏的含lbADH酶的重组大肠杆菌工程菌E.coli IEF-lbADH(CN112143764A)，经过含有50mg/L卡那霉素LB平板划线活化。挑取单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
表3辅酶循环系统
| 酶名称 | 来源 | NCBI登录号 | 底物 | 副产物 |
| 醇脱氢酶lbADH | 短乳杆菌 | WP_011668302 | 异丙醇 | 丙酮 |
| 葡萄糖脱氢酶bsGDH | 枯草芽孢杆菌 | NP_388275.1 | 葡萄糖 | 葡萄糖酸 |
| 甲酸脱氢酶psFDH | 假单胞菌 | P33160.3 | 甲酸 | CO2 |
将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养3h，待菌体的OD600到0.6～0.8时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵10h，获得湿菌体的含量为5g/L的发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
实施例6 3L罐发酵制备二氢叶酸还原酶的粗酶液
按照实施例1活化重组大肠杆菌XcaDHFR、LasDHFR、BhaDHFR和hDHFR-35K64F分别接种在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
3L发酵罐中发酵制备XcaDHFR、LasDHFR、BhaDHFR和hDHFR-35K64F的发酵液：将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含有相应抗性(50mg/L卡那霉素/100mg/L氨苄青霉素)的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养4h，加入终浓度为10g/Lα-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵16h，获得湿菌体含量为30g/L的发酵液，记为DHFR发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到DHFR粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
实施例7 3L罐发酵制备四氢叶酸甲基转移酶的粗酶液
按照实施例3活化重组大肠杆菌DmdA，接种在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
3L发酵罐中发酵制备DmdA的发酵液：将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养4h，加入终浓度为10g/Lα-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵16h，获得湿菌体含量为30g/L的发酵液，记为DmdA发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到DmdA粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
实施例8 3L罐发酵制备lbADH的粗酶液
按照实施例5活化重组大肠杆菌lbADH，接种在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
3L发酵罐中发酵制备lbADH的发酵液：将新鲜活化的重组大肠杆菌E.coli-lbADH接种在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。
3L发酵罐中发酵制备lbADH的发酵液：将新鲜培养的种子液以体积浓度2％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养4h，加入终浓度为10g/Lα-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵16h，获得湿菌体含量为30g/L的发酵液，记为lbADH发酵液。
离心发酵液，用pH7.5，400mM HEPES缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到用于辅酶循环的粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。
实施例9XcaDHFR、lbADH与DmdA发酵液混合制备L-5-甲基四氢叶酸
一锅酶法制备L-5-MTHF的催化工艺如下：
将实施例6方法制备的XcaDHFR发酵液离心，取湿菌体细胞20.0g；实施例8方法制备的lbADH发酵液离心，取湿菌体细胞10.0g；实施例7方法制备的DmdA发酵液离心，取湿菌体细胞30.0g，将三种湿菌体细胞重新悬浮于150mL的pH7.5，400mM HEPES缓冲液缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入终浓度为1.0mM NADP+、3％异丙醇、25mM Vc、6mM DTT、10mMDMSP和10.0g/L的叶酸，用去离子水补足200ml，再次调整pH为7.5。反应体系在37℃水浴锅中，磁力搅拌催化反应12h，取反应液用于HPLC分析，结果如图9所示，表明底物化合物II叶酸和化合物ⅢL-四氢叶酸还有部分未转化，其最终转化率为80％。
取样HPLC分析方法如下：在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：254nm和290nm；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
实施例10LasDHFR、lbADH与DmdA发酵液混合制备L-5-甲基四氢叶酸将实施例6方法制备的LasDHFR发酵液离心，取湿菌体细胞20.0g；实施例8方法制备的lbADH发酵液离心，取湿菌体细胞10.0g；实施例7方法制备的DmdA发酵液离心，取湿菌体细胞30.0g，将三种湿菌体细胞重新悬浮于150mL的pH7.5，400mM HEPES缓冲液缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入终浓度为1.0mM NADP+、3％异丙醇、25mM Vc、6mM DTT、10mM DMSP和10.0g/L的叶酸(化合物Ⅱ)，用去离子水补足200ml，再次调整pH为7.5。反应体系在37℃水浴锅中，磁力搅拌催化反应12h，取反应液用于HPLC分析，结果表明底物化合物II叶酸已全部转化且化合物ⅢL-四氢叶酸不可测，即转化率大于99％。
取样HPLC分析方法如下：在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：254nm和290nm；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
实施例11BhaDHFR、lbADH与DmdA发酵液混合制备L-5-甲基四氢叶酸将实施例6方法制备的BhaDHFR发酵液离心，取湿菌体细胞20.0g；实施例8方法制备的lbADH发酵液离心，取湿菌体细胞10.0g；实施例7方法制备的DmdA发酵液离心，取湿菌体细胞30.0g，将三种湿菌体细胞重新悬浮于150mL的pH7.5，400mM HEPES缓冲液缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入终浓度为1.0mM NADP+、3％异丙醇、25mM Vc、6mM DTT、10mM DMSP和10.0g/L的叶酸(化合物Ⅱ)，用去离子水补足200ml，再次调整pH为7.5。反应体系在37℃水浴锅中，磁力搅拌催化反应10h，取反应液用于HPLC分析，结果表明底物化合物II叶酸还有部分未转化，化合物ⅢL-四氢叶酸不可测，其最终转化率为85％。
取样HPLC分析方法如下：在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：254nm和290nm；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
实施例12hDHFR-35K64F、lbADH与DmdA发酵液混合制备L-5-甲基四氢叶酸将实施例6方法制备的hDHFR-35K64F发酵液离心，取湿菌体细胞20.0g；实施例8方法制备的lbADH发酵液离心，取湿菌体细胞10.0g；实施例7方法制备的DmdA发酵液离心，取湿菌体细胞30.0g，将三种湿菌体细胞重新悬浮于150mL的pH7.5，400mM HEPES缓冲液缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入终浓度为1.0mM NADP+、3％异丙醇、25mM Vc、6mM DTT、10mM DMSP和10.0g/L的叶酸(化合物Ⅱ)，用去离子水补足200ml，再次调整pH为7.5。反应体系在37℃水浴锅中，磁力搅拌催化反应10h，取反应液用于HPLC分析，结果表明底物化合物II叶酸不可测，化合物ⅢL-四氢叶酸还有部分未转化，其转化率最终为93％。
取样HPLC分析方法如下：在磁力搅拌的条件下，取样500μL反应液于500μL的5％氨水中，10000×g离心5min，取上清用于液相色谱分析。液相色谱分析方法：色谱柱：C18柱；检测波长：254nm和290nm；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.3)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
分析评价由实施例9-12反应液的HPLC分析可知，采用重组大肠杆菌LasDHFR或hDHFR-35K64F，经10～12h催化，可转换生成产物L-5-甲基四氢叶酸浓度大于9.0g/L，即转化率大于90％。采用本发明一锅法制备L-5-甲基四氢叶酸产率高，有极大的应用价值和市场前景。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：包括以下步骤：
往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，催化反应，得到L-5-MTHF。
2.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有>80％的同源性。
3.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.4所示序列具有>80％的同源性。
4.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.6所示序列具有>80％的同源性。
5.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列具有>80％的同源性。
6.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述四氢叶酸甲基转移酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.10所示序列具有>80％的同源性。
7.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述催化反应加入甲基供体、NAD(P)依赖的脱氢酶及辅酶底物中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述甲基供体为二甲基巯基丙酸。
9.如权利要求7所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：脱氢酶选自醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶与甲酸脱氢酶，所述辅酶底物选自异丙醇、葡萄糖与甲酸。
10.如权利要求1所述的一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法，其特征在于：所述催化反应的温度为25～40℃，所述催化反应的pH为7.0～9.0。
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