CN113693163A - 一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程制造领域,公开了一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,包括凝结芽孢杆菌种子液制备、凝结芽孢杆菌菌液制备、混合物制备、固体发酵、检测分装等步骤。本发明的制备工艺简单,成本较低,容易操作;阳起石为常用的中药炮制矿物药物,来源广泛;本发明获得的新型抗菌肽饲料添加剂,是一种促生长、绿色环保饲料添加剂,成本低廉,应用广泛,有很高的推广和应用价值,有利于在畜牧养殖行业推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程制造领域,具体涉及一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法。
背景技术
2020年7月1日后,饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。饲料禁止使用促生长类抗生素,对绿色健康养殖提出了更高的任务要求。新型的畜禽养殖绿色饲料添加剂成了畜牧行业科研工作者研究的热点。
由微生物代谢合成的小分子蛋白或多肽物质(抗菌肽)具有抑制或杀灭多种致病菌和腐败菌的能力,并且具有安全、无毒、高效等特点,被认为是天然的生物防腐剂和良好的抗生素替代物,在食品领域和畜牧行业具有广阔的应用前景。但现有技术中含有抗菌肽的饲料添加剂制备工艺复杂,成本较高,无法满足日常的使用需求,因此,亟需要一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,来满足动物的饲养。
发明内容
本发明的目的就在于解决上述技术问题,提供一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法。
为达到上述目的,本发明是按照以下技术方案实施的:
一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,包括以下步骤,
S1凝结芽孢杆菌种子液制备,将凝结芽孢杆菌接种于种子培养基内,在30-40℃温度下培养36-60h后,获得凝结芽孢杆菌种子液;
S2凝结芽孢杆菌菌液制备,将步骤S1获得的凝结芽孢杆菌种子液,以5-10%的接种量接种于种子培养基内,在30-40℃温度下培养24-36h后,得到凝结芽孢杆菌菌液;
S3混合物制备,将5-10重量份的阳起石、90-95重量份的固体发酵辅料放入到固体发酵罐中进行高压蒸汽灭菌,冷却后得到混合物;
S4固体发酵,将凝结芽孢杆菌菌液与混合物在固体发酵罐中充分搅拌混合,进行固体发酵,当固体发酵罐内的物料pH值小于4.0,抗菌肽的含量≥10g/kg,停止发酵,得到含有抗菌肽的发酵混合物;
S5检测分装,将步骤S4获得的发酵混合物,检测分装,得到新型抗菌肽饲料添加剂成品。
优选的,步骤S1、S2中,每1000g种子培养基包括以下各组分:蛋白胨5-15g,葡萄糖2-5g,豆饼粉10-20g,可溶性玉米淀粉8-20g,硫酸锰0.2-0.5g,氯化钠2-8g,维生素B120.002-0.005g,其余为水。
优选的,所述凝结芽孢杆菌来源CICC,菌株编号为CICC20138。
优选的,所述凝结芽孢杆菌种子液的菌体浓度为1×107-1×108CFU/ml。
优选的,所述步骤S1的培养过程的pH值为6.5-7.0;所述步骤S2的培养过程的pH值为6.5-7.0。
优选的,所述步骤S3中,高压蒸汽灭菌的温度为121℃,灭菌时间为15min。
优选的,所述步骤S3中,固体发酵辅料包括以下质量百分比的各组分:20%葡萄糖、40%豆饼粉、40%玉米芯粉。
优选的,所述步骤S4中,固体发酵的发酵温度为30-45℃,发酵时间为60-96h。
优选的,所述步骤S4中,凝结芽孢杆菌菌液与混合物的质量比为1:3-5。
优选的,所述步骤S4中获得抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物。
本发明采用原子吸收光谱法(AAS)和选择性离子电子(ISE)相结合的方法确定抗菌肽含量。具体为:经过检测样品中总的金属含量和溶液中自由金属离子的含量,两者之间的差值为凝固素螯合阳起石复合物的含量,即为本发明中的抗菌肽的含量。
凝固素螯合阳起石复合物,其具有抗菌肽的活性,能够在动物肠道中定植,促进肠绒毛再生,抑制病原菌生产的功效,对畜禽肠道健康有极好的保护作用。由于本发明的抗菌肽是小分子多肽活性物质,更容易让畜禽吸收和利用,达到预防腹泻等疾病的功效。
本发明的作用原理:
凝固素是凝结芽孢杆菌经过发酵产生的代谢产物,能选择性的促进肠道双歧杆菌等有益菌的生长繁殖,并对肠道致病菌的生长繁殖有很强的拮抗、抑制作用。此外,凝结芽孢杆菌能分泌乳酸,为肠道菌群平衡提供微酸环境。凝固素是一种新型的抗菌肽分子。
阳起石(Actinolitum),是一种单斜晶系硅酸盐类矿物透闪石,主要含水硅酸铁镁钙[Ca2(Mg·Fe)5(Si4O11)2(OH)2]。其晶体呈简单的长柱状、针状,有时呈毛发状,常呈细放射状、纤维状的集合体。白色或浅灰色。玻璃光泽,纤维状集合体具丝绢光泽。硬度5.5-6。性脆,针状,毛发状晶体易折断。相对密度2.9-3.0。阳起石含有较高的Ca、Mg、Fe等元素,可以作为螯合蛋白多肽的天然原料,此外阳起石也是中药炮制中常用的一种矿物药。
本发明将凝结芽孢杆菌和矿物中药阳起石综合应用于动物饲料添加剂领域,将凝结芽孢杆菌的特定产物凝固素与阳起石混合,通过凝结芽孢杆菌生物工程发酵技术螯合成附加值高的抗菌肽(凝固素螯合阳起石复合物),为畜牧业绿色养殖提供保障。
本发明利用凝结芽孢杆菌液体发酵产生的凝固素,将凝固素、阳起石、固体发酵料在凝结芽孢杆菌固态发酵的环境下,发生螯合作用,形成新的抗菌肽凝固素螯合阳起石复合物。此抗菌肽(凝固素螯合阳起石复合物)具有凝固素,能够定植在畜禽肠道中,能够抑菌;能够减少肠道病源微生物,促进肠道健康,实现健康养殖。本发明获得的新型抗菌肽饲料添加剂,是一种促生长、绿色环保饲料添加剂,成本低廉,应用广泛,有很高的推广和应用价值,有利于在畜牧养殖行业推广。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1)本发明的制备工艺简单,成本较低,容易操作;阳起石为常用的中药炮制矿物药物,来源广泛;
2)本发明采用固体发酵的形式进行螯合作用,将凝结芽孢杆菌液体发酵产生的凝固素与阳起石、固体发酵辅料在固体发酵中,催化凝固素与阳起石形成的新型抗菌肽;该新型抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物;该抗菌肽更容易让畜禽肠道吸收并定植在肠道中,抑制病原菌滋生,改善肠道健康;提高了凝结芽孢杆菌和阳起石在畜禽养殖业中的综合利用价值。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1
如图1所示,一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,包括以下步骤,
S1凝结芽孢杆菌种子液制备,将凝结芽孢杆菌接种于种子培养基内,在30℃温度和pH值为6.5的条件下培养36h后,获得凝结芽孢杆菌种子液;所述凝结芽孢杆菌种子液的菌体浓度为2.3×107CFU/ml;
S2凝结芽孢杆菌菌液制备,将步骤S1获得的凝结芽孢杆菌种子液,以5%的接种量接种于种子培养基内,在30℃温度和pH值为6.5的条件下下发酵培养24h后,得到凝结芽孢杆菌菌液;凝结芽孢杆菌菌液菌体浓度为1.9×107CFU/ml;
S3混合物制备,将5重量份的阳起石、95重量份的固体发酵辅料放入到固体发酵罐中进行高压蒸汽灭菌,冷却后得到混合物;高压蒸汽灭菌的温度为121℃,灭菌时间为15min。
S4固体发酵,将凝结芽孢杆菌菌液与混合物在固体发酵罐中充分搅拌混合,进行固体发酵,当固体发酵罐内的物料pH为3.8,抗菌肽的含量为12.3g/kg,停止发酵,得到含有抗菌肽的发酵混合物;凝结芽孢杆菌菌液与混合物的质量比为1:3;固体发酵的发酵温度为30℃,发酵时间为60h。
S5检测分装,将步骤S4获得的发酵混合物,检测分装,得到新型抗菌肽饲料添加剂成品。
本实施例步骤S1、S2中,每1000g种子培养基包括以下各组分:蛋白胨5g,葡萄糖2g,豆饼粉10g,可溶性玉米淀粉8g,硫酸锰0.2g,氯化钠2g,维生素B12 0.002g,其余为水。
本实施例中,凝结芽孢杆菌来源CICC,菌株编号为CICC20138。
本实施例步骤S3中,固体发酵辅料包括以下质量百分比的各组分:20%葡萄糖、40%豆饼粉、40%玉米芯粉。
本实施例中,步骤S4中获得抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物。
本发明采用原子吸收光谱法(AAS)和选择性离子电子(ISE)相结合的方法确定抗菌肽(凝固素螯合阳起石复合物)含量。具体为:经过检测样品中总的金属含量和溶液中自由金属离子的含量,两者之间的差值为凝固素螯合阳起石复合物的含量,即为本发明中的抗菌肽的含量。
实施例2
一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,包括以下步骤,
S1凝结芽孢杆菌种子液制备,将凝结芽孢杆菌接种于种子培养基内,在35℃温度和pH值为6.8条件下培养48h后,获得凝结芽孢杆菌种子液;所述凝结芽孢杆菌种子液的菌体浓度为3.5×107CFU/ml;
S2凝结芽孢杆菌菌液制备,将步骤S1获得的凝结芽孢杆菌种子液,以7%的接种量接种于种子培养基内,在35℃温度和pH值为6.8条件下培养30h后,得到凝结芽孢杆菌菌液;凝结芽孢杆菌菌液菌体浓度为3.2×107CFU/ml;
S3混合物制备,将7重量份的阳起石、93重量份的固体发酵辅料放入到固体发酵罐中进行高压蒸汽灭菌,冷却后得到混合物;高压蒸汽灭菌的温度为121℃,灭菌时间为15min。
S4固体发酵,将凝结芽孢杆菌菌液与混合物在固体发酵罐中充分搅拌混合,进行固体发酵,当固体发酵罐内的物料pH为3.5,抗菌肽的含量为11.4g/kg,停止发酵,得到含有抗菌肽的发酵混合物;凝结芽孢杆菌菌液与混合物的质量比为1:4;固体发酵的发酵温度为37℃,发酵时间为72h。
S5检测分装,将步骤S4获得的发酵混合物,检测分装,得到新型抗菌肽饲料添加剂成品。
本实施例步骤S1、S2中,每1000g种子培养基包括以下各组分:蛋白胨10g,葡萄糖4g,豆饼粉15g,可溶性玉米淀粉14g,硫酸锰0.4g,氯化钠6g,维生素B12 0.004g,其余为水。
本实施例中,凝结芽孢杆菌来源CICC,菌株编号为CICC20138。
本实施例步骤S3中,固体发酵辅料包括以下质量百分比的各组分:20%葡萄糖、40%豆饼粉、40%玉米芯粉。
本实施例中,步骤S4中获得抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物。
本发明采用原子吸收光谱法(AAS)和选择性离子电子(ISE)相结合的方法确定抗菌肽(凝固素螯合阳起石复合物)含量。具体为:经过检测样品中总的金属含量和溶液中自由金属离子的含量,两者之间的差值为凝固素螯合阳起石复合物的含量,即为本发明中的抗菌肽的含量。
实施例3
一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,包括以下步骤,
S1凝结芽孢杆菌种子液制备,将凝结芽孢杆菌接种于种子培养基内,在30℃温度和pH值为7.0条件下培养36h后,获得凝结芽孢杆菌种子液;所述凝结芽孢杆菌种子液的菌体浓度为4.6×107CFU/ml;
S2凝结芽孢杆菌菌液制备,将步骤S1获得的凝结芽孢杆菌种子液,以10%的接种量接种于种子培养基内,在40℃温度和pH值为7.0条件下培养36h后,得到凝结芽孢杆菌菌液;凝结芽孢杆菌菌液菌体浓度为4.5×107CFU/ml;
S3混合物制备,将10重量份的阳起石、90重量份的固体发酵辅料放入到固体发酵罐中进行高压蒸汽灭菌,冷却后得到混合物;高压蒸汽灭菌的温度为121℃,灭菌时间为15min。
S4固体发酵,将凝结芽孢杆菌菌液与混合物在固体发酵罐中充分搅拌混合,进行固体发酵,当固体发酵罐内的物料pH值为3.4,抗菌肽的含量为13.1g/kg,停止发酵,得到含有抗菌肽的发酵混合物;凝结芽孢杆菌菌液与混合物的质量比为1:5;固体发酵的发酵温度为45℃,发酵时间为96h。
S5检测分装,将步骤S4获得的发酵混合物,检测分装,得到新型抗菌肽饲料添加剂成品。
本实施例步骤S1、S2中,每1000g种子培养基包括以下各组分:蛋白胨15g,葡萄糖5g,豆饼粉20g,可溶性玉米淀粉20g,硫酸锰0.5g,氯化钠8g,维生素B12 0.005g,其余为水。
本实施例中,凝结芽孢杆菌来源CICC,菌株编号为CICC20138。
本实施例步骤S3中,固体发酵辅料包括以下质量百分比的各组分:20%葡萄糖、40%豆饼粉、40%玉米芯粉。
本实施例中,步骤S4中获得抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物。
本发明采用原子吸收光谱法(AAS)和选择性离子电子(ISE)相结合的方法确定抗菌肽(凝固素螯合阳起石复合物)含量。具体为:经过检测样品中总的金属含量和溶液中自由金属离子的含量,两者之间的差值为凝固素螯合阳起石复合物的含量,即为本发明中的抗菌肽的含量。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制,凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:包括以下步骤,
S1凝结芽孢杆菌种子液制备,将凝结芽孢杆菌接种于种子培养基内,在30-40℃温度下培养36-60h后,获得凝结芽孢杆菌种子液;
S2凝结芽孢杆菌菌液制备,将步骤S1获得的凝结芽孢杆菌种子液,以5-10%的接种量接种于种子培养基内,在30-40℃温度下培养24-36h后,得到凝结芽孢杆菌菌液;
S3混合物制备,将5-10重量份的阳起石、90-95重量份的固体发酵辅料放入到固体发酵罐中进行高压蒸汽灭菌,冷却后得到混合物;
S4固体发酵,将凝结芽孢杆菌菌液与混合物在固体发酵罐中充分搅拌混合,进行固体发酵,当固体发酵罐内的物料pH值小于4.0,抗菌肽的含量≥10g/kg,停止发酵,得到含有抗菌肽的发酵混合物;
S5检测分装,将步骤S4获得的发酵混合物,检测分装,得到新型抗菌肽饲料添加剂成品。
2.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:步骤S1、S2中,每1000g种子培养基包括以下各组分:蛋白胨5-15g,葡萄糖2-5g,豆饼粉10-20g,可溶性玉米淀粉8-20g,硫酸锰0.2-0.5g,氯化钠2-8g,维生素B12 0.002-0.005g,其余为水。
3.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述凝结芽孢杆菌来源CICC,菌株编号为CICC20138。
4.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述凝结芽孢杆菌种子液的菌体浓度为1×107-1×108CFU/ml。
5.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S1的培养过程的pH值为6.5-7.0;所述步骤S2的培养过程的pH值为6.5-7.0。
6.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S3中,高压蒸汽灭菌的温度为121℃,灭菌时间为15min。
7.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S3中,固体发酵辅料包括以下质量百分比的各组分:20%葡萄糖、40%豆饼粉、40%玉米芯粉。
8.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S4中,固体发酵的发酵温度为30-45℃,发酵时间为60-96h。
9.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S4中,凝结芽孢杆菌菌液与混合物的质量比为1:3-5。
10.根据权利要求1所述的一种采用固体发酵制备新型抗菌肽饲料添加剂的方法,其特征在于:所述步骤S4中获得抗菌肽为凝固素螯合阳起石复合物。
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