发明内容
本发明提供了一种固态发酵凝结芽孢杆菌提高苯乳酸产量,从而获取富含苯乳酸的固态发 酵饲料的一种方法。
本发明实现目的的技术方案如下:
凝结芽孢杆菌液体种子接入固态培养基中进行固态发酵培养,固态培养基的基本成分为豆粕,米糠,麦芽浸粉和水分组成,所述固态培养基中加入苯丙酮酸或者苯丙氨酸,来提高苯乳酸的产量;固态发酵55-65h,发酵温度为33-38℃,发酵室内的相对湿度控制在75-80%,发酵期间每隔12h翻匀一次。固态发酵培养后获得固态发酵饲料。
固态培养基组分为水分,豆粕,米糠,麦芽浸粉;所述固态培养基中各组分的的添加量如下:水分,豆粕,米糠,麦芽浸粉分别为500-700g/kg,200-250g/kg,50-100g/kg,20-50g/kg。
固态发酵培养基接种量范围为5-15%,接种量为10%时苯乳酸产量最大。苯丙酮酸的添加浓度为2-3g/kg;苯丙氨酸的添加量为2.5-3.5g/kg时;
苯丙酮酸的最适添加浓度为2.7g/kg,苯乳酸产量最大为815mg/kg,此时的转化率为98.7%;
苯丙氨酸的添加量为3g/kg时,苯乳酸产量为752mg/kg,此时转化率为94.9%。
优选的固态培养基组分和添加量如下:水分的添加量为600g/kg。豆粕225g/kg,米糠75g/kg时,麦芽浸粉30g/kg。
本发明所述凝结芽孢杆菌的名称为TQ33,分类名称Bacillus coagulans,保藏编号为:CGMCC No.5233保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述凝结芽孢杆菌的种子液培养基的组成(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0,初始pH7.2-7.4。
种子液的培养条件:温度37±1℃,转速为200r.min-1,培养时间18h。
本发明使用生理盐水(超纯水配制)提取苯乳酸,将固态发酵样品和超纯水以1:4的比例混合,在4℃冰箱里放置4h后提取上清液,离心过膜后,利用高效液相测量苯乳酸的含量。
本发明所用的HPLC的条件
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈90:10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
苯丙酮酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈93:7(v/v),进样量为10μL,流速为0.4mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
苯丙氨酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈95:5(v/v),进样量为10μL,流速为0.2mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
有益效果:
本发明利用凝结芽孢杆菌固态发酵,通过底物的添加提高苯乳酸的产量,最终获取富含苯乳酸的饲料。这是首次通过固态发酵来提高苯乳酸产量,并且将获取的苯乳酸直接应用到发酵制剂中,省去了苯乳酸提取,分离等的下游处理工艺,既提高了这种饲料的利用价值,也不会增加这种固态发酵饲料的成本。
利用固态培养基发酵凝结芽孢杆菌获得的固态制剂本身就具有益生菌的效果,添加在饲料里面,具有提高动物的免疫力,促进动物生长等益生功能,在养殖业具有广阔的应用价值。固态制剂中苯乳酸产量的提高增强了凝结芽孢杆菌的益生功能,提高了这种固态制剂的利用价值,使这种固态制剂拥有更广泛的应用价值。
本发明的有益效果还在于通过凝结芽孢杆菌固态发酵提高了苯乳酸的产量,通过固态培养基的优化以及底物的添加确定了固态发酵饲料中苯乳酸的最终产量为815mg/kg。凝结芽孢杆菌是一种益生菌,利用其固态发酵所得到的制剂具有益生菌的多重功效。苯乳酸是一种新型的抑菌物质,具有增强动物免疫力,提高畜禽肉质,降低家畜体内的大肠杆菌数量等功能。固态发酵中苯乳酸含量的提高,使凝结芽孢杆菌能更好的发挥益生功能,从而进一步提高了这种固态发酵饲料的利用价值,这样的固态制剂在畜禽养殖业中具有更高的应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明使用的菌种为凝结芽孢杆菌TQ33,分类名称Bacillus coagulans,保藏编号为: CGMCC No.5233,保藏日期:2011年9月9日,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
斜面培养基、种子培养基
斜面培养基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏5.0、葡萄糖12.0、琼脂20.0初始pH7.0-7.2。
种子培养基(g/L):蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0,初始pH7.2-7.4。
固态培养基
最终确定的固态培养基是由豆粕225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉30g/kg和水600g/kg苯丙酮酸2.7g/kg或者苯丙氨酸3.0g/kg组成;培养基混匀分装后115℃灭菌20min。
实施例1
1菌种活化
挑取甘油管里面的菌体→平板培养24h→挑取菌体,接入斜面,培养24后,4℃冰箱保存。
2种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入种子液,37±1℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
3固态发酵
1)固态培养基组成:水分500g/kg,麦芽浸粉10g/kg,豆粕200g/kg,米糠200g/kg,混合均匀后分装,115℃灭菌20min。
2)固态培养基的培养:按照固态培养基重量的5%接入种子液,37±1℃,相对湿度80%左右培养,分别在0、3、6、12、24、36、48、60、72h取样。
3)确定不同时间的菌体数以及pH变化:将不同时间所取样品装入三角瓶中(三角瓶装有生理盐水和玻璃珠)后,在摇床摇匀大约1h,吸取上清液移到试管(每根试管9ml生理盐水)中进行梯度稀释;稀释好的液体,移到平板中与培养基混匀后37±1℃培养;另外,稀释好的菌液,在80℃中水浴10min,测其的芽孢数;另外,利用pH仪测量三角瓶中样品稀释液,记录其数值。
4)苯乳酸的提取:将不时间的发酵样品与生理盐水以1:4的比例混匀,在4℃冰箱里静止4h后,提取上清液,离心过膜。
4苯乳酸浓度的检测
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相1mM H2SO4:乙腈90:10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:从绘出的固态发酵生长曲线以及pH变化(附图2)可以看出,凝结芽孢杆菌 在固态培养基中培养48h左右达到稳定期,48h以后菌体量变化不大;发酵过程中,pH的变化先下降,36h时pH最低,此后固态培养基的pH开始上升。从绘制的苯乳酸取样时间(附图3)可以看出:苯乳酸在对数期就开始产生,但是36h之前产量很少,并且不同时间的产量差异也小,36h后苯乳酸的产量开始升高,在60h苯乳酸的积累量达到最大为121mg/kg。
实施例2
1种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入到种子液中,37℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
2固态发酵
1)固态发酵培养基的组成:固态培养基中的水分添加量分别为500g/kg,550g/kg,600g/kg,700g/kg;麦芽浸粉,豆粕与米糠添加量分别为10g/kg,200g/kg,200g/kg,混匀以后115℃灭菌20min。
2)固态发酵:按照固态培养基重量的5%接入种子液,37±1℃,相对湿度80%左右培养,60h取样;样品与生理盐水以1:4的比例混合,4℃冰箱里静止4h,提取上清液,离心过膜。
3苯乳酸含量的测量
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相1mM H2SO4:乙腈90:10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:由附图4可以看出,固态培养基中水分添加量为600g/kg时,苯乳酸产量最高,由此确定固态培养基中水分的添加量为600g/kg。
实施例3
1种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入到种子液中,37℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
2固态发酵
1)固态发酵培养基组成:固态发酵培养基中水分的添加量为600g/kg,麦芽浸粉为10g/kg,豆粕,米糠的添加量分别为150g/kg,150g/kg;200g/kg,100g/kg;100g/kg,200g/kg;225g/kg,75g/kg;75g/kg,225g/kg。
2)固态发酵:按照固态培养基重量的5%接入种子液,37±1℃相对湿度80%左右培养,60h取样;样品与生理盐水1:4的比例混合后4℃冰箱里静止4h,提取上清液,离心过膜。
3苯乳酸含量的测定
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈90: 10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:根据结果绘制的图(附图5)可以看出,豆粕的含量对苯乳酸的产量有很大影响,豆粕225g/kg,米糠75g/kg时,苯乳酸的产量最大。
实施例4
1种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入到种子液中,37℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
2固态发酵
1)固态培养基的组成:固态发酵培养基中水分的添加量为600g/kg,豆粕225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉添加量分别为10g/kg,20g/kg,30g/kg,40g/kg,混匀后分装,115℃灭菌20min。
2)固态培养基的培养:按照固态培养基重量的5%接入种子液,37±1℃,相对湿度80%左右培养,60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合,混匀后4℃冰箱里静止4h提取苯乳酸,过膜。
3苯乳酸含量的检测
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈90:10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:(附图6)可以看出,随着麦芽浸粉添加量的增加,苯乳酸的产量逐渐增加,当麦芽浸粉的添加量为30g/kg时,苯乳酸产量最大,超过此添加量浓度时,苯乳酸产量降低。
实施例5
1种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入到种子液中,37℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
2固态发酵
1)固态发酵培养基组成:水分添加量为600g/kg,豆粕225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉30g/kg,混匀后灭菌。
2)固态发酵:分别按照固态培养基重量的为5%,8%,10%,12%接种;固态发酵培养基37±1℃,相对湿度80%左右培养;60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合,混匀后4℃冰箱里静止4h提取上清液,过膜。
3苯乳酸含量的检测
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈90:10 (v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:通过(附图7)可以看出,接种量为10%的时候,苯乳酸的产量最大为137mg/kg。
实施例6
1种子液培养
挑取斜面菌体2环,接入到种子液中,37℃,200r.min-1通风培养,18h后转接到固态培养基。
2固态发酵
1)固态培养基成分:水分添加量600g/kg,豆粕225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉30g/kg;另外,培养基中分别补加苯丙酮酸(g/kg)0.45、0.9、1.4、1.8、2.7、4.5混匀后115℃灭菌。
2)固态培养基成分:水分添加量600g/kg,豆粕225g/kg,米糠75g/kg,麦芽浸粉30g/kg;另外,培养基中分别补加苯丙氨酸(g/kg)0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.5混匀后115℃灭菌。
3)固态培养基的培养:两种培养都按照固态培养基重量的10%接入种子液,培养基37±1℃,相对湿度80%左右培养,60h后取样与生理盐水以1:4的比例混合,混匀后4℃冰箱里静止4h提取苯乳酸,过膜。
3苯乳酸含量的检测以及苯丙氨酸,苯丙酮酸剩余含量的检测
苯乳酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相1mM H2SO4:乙腈为90:10(v/v),进样量为10μL,流速为0.7mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
苯丙酮酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈为93:7(v/v),进样量为10μL,流速为0.4mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
苯丙氨酸检测的液相条件:Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱,流动相为1mM H2SO4:乙腈为95:5(v/v),进样量为10μL,流速为0.2mL/min,柱温为30℃,检测波长210nm。
结果表明:(附图8和9)可以看出苯丙酮酸和苯丙氨酸的添加有效的提高了苯乳酸的产量,但不同的是菌体对苯丙氨酸的利用比较好,其添加量为2.7g/kg时苯乳酸产量可达815mg/kg,是未添加底物时苯乳酸产量的6倍,此时苯丙酮酸的转化率也最大,为98.7%;而对于苯丙氨酸来说,其添加量为3g/kg时,苯乳酸产量最大为752mg/kg,是未添加底物苯乳酸产量的5.5倍,转化率最大为94.9%。
实施例7凝结芽孢杆菌固态发酵饲料对高产蛋鸡产蛋性能的影响
1.将最终获得的固态发酵饲料进行动物试验,选取34周龄健康商品代海兰褐蛋鸡600随机分为5个处理组,每个处理组120只鸡,每3只鸡为1重复,即每处理组可以获得40个重复观察数据。
2.试验进行49天,采用的基础日粮组成以及营养成分见表1。
表1基础日粮配方及营养水平
试验包括了一个饲喂基础粮食的对照组和添加了不同量的凝结芽孢杆菌固态发酵饲料,添加量见表2。
表2试验设计
3.试验鸡采用阶梯式笼养,自然通风,自由采食和饮水。免疫和驱虫程序按鸡场常规同步进行。及时收集槽外损失料放回槽内,随时观察、记录鸡只采食和健康状况。试验期间每日按重复组记录产蛋数、蛋重、采食量和死淘鸡数,试验结束计算产蛋率、平均蛋重、料蛋比和死淘率。用SAS统计软件对试验数据进行统计分析。
表3不同处理组蛋率、平均蛋重、料蛋比和死淘率试验结果
注:同一列数据肩注不同小写字母表示差异显著(p<0.05),不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。
结果(表3)表明,基础日粮添加了凝结芽孢杆菌固态发酵饲料的试验组的产蛋率要高于对照组,尤其是处理4,即饲料添加量为0.15%时与对照组差异最明显。实验组平均蛋重也高于对照组,但是与对照组差异不明显;而料蛋比和死淘率与对照组相比,也明显降低,差异显著(P<0.05)。
本发明研发了固态发酵凝结芽孢杆菌提高苯乳酸的工艺,最终通过苯丙氨酸或苯丙酮酸的添加都大大提高苯乳酸的产量。动物试验证明了这种固态发酵饲料的添加对于产蛋鸡的积极效果以及安全性,说明了这种饲料在养殖业中的应用价值。固态发酵凝结芽孢杆菌获得的固态制剂具有多重益生功能,而苯乳酸具有增强动物免疫力,提高畜禽肉质,降低家畜体内大肠杆菌的数量等功能,苯乳酸产量的提高进一步增强了凝结芽孢杆菌的益生功能,富含苯乳酸的固态制剂拥有更广的应用价值。