CN104262503A - 一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺 - Google Patents

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李岩
周艺
杨凤琼
叶泽波
唐浩
秦春梅
曾琳玲
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Abstract

本发明属于天然化合物提取技术领域，公开了一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺。所述提取及分级提纯工艺首先采用特定条件下的“水提醇沉”工艺得到质量良好的粗多糖，然后将粗多糖通过乙醇三级提纯分级，得到三种性状良好的云芝糖肽，极大的丰富了云芝糖肽的种类和规格；另外本发明的整个工艺过程不使用有毒有机溶剂，程序简单，适合工业化生产。

Description

一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺
技术领域
本发明属于天然化合物提取技术领域，具体涉及一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺。
背景技术
云芝[Polysticus versicolor(L.)Fr]，又名彩纹云芝、杂色云芝、多色云芝、白边黑云芝等，民间称其为千层蘑，云芝蘑，云蘑，木鸡，树蛾等，日本称其为瓦茸。隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、多孔菌科(Polyporales)、栓菌属(Trametes)。云芝是一种世界性分布的真菌，尤其在北半球的原始森林中，过熟林中较为常见，在我国主要产于东北各省的林区。
云芝的化学成分研究主要是以云芝子实体和菌丝体为原料，目前其化学成分的研究多集中于多糖的研究。云芝子实体主要含多糖、蛋白质、鞣质、氨基酸、有机酸、酚类、内脂类、氰甙、生物碱等成分，其中的多糖含量较高。在这些成分中研究的较多的是一种多糖类，分子量在1.3×106Da以上。粗提物呈黑褐色，经DEAE纤维柱处理后的样品呈白色至淡黄白色，分子量为1.2×106Da左右，经氧化脱色后，分子量仍达到1.0×106Da以上。
现有技术中多采用简单的“水提醇沉”的方式对云芝糖肽进行提取，如在专利200710032475.9和201210478886.1中即描述了这种方法，但其纯化过程需要使用到氯仿和正丁醇等有毒有机溶剂，而且得到的云芝糖肽规格单一，产物分子量分布不均。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，包括以下操作步骤：
(1)取干燥云芝碎片，用10～15倍质量的去离子水在95～100℃条件下煮提8～10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/6～1/2，加入浓缩液3～5倍体积的95％乙醇混合均匀，静置沉淀后离心，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到一级多糖；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到二级多糖；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到三级多糖。
步骤(1)中所述的滤液浓缩优选浓缩至原体积的1/2，所述95％乙醇加入量为浓缩液体积的4倍，所述静置沉淀是指在25℃密闭条件下静置24h。
步骤(1)中所述的离心是指在3000r/min的条件下离心20min。
通过本发明的工艺及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明采用分级提纯工艺，得到了3种不同质量规格的云芝糖肽产物，其在外观、溶解性、分子量分布、糖含量及蛋白含量上均具有一定的区别，丰富了市场上糖肽产品的种类；另外通过分级提纯工艺能够将有效物糖肽提取而出，减少了有效物糖肽随提取液的流失；
(2)本发明采用分级提纯工艺不采用有毒有机溶剂，而且提纯工艺简单，便于工业化生产；
(3)本发明通过优化粗多糖制取过程中浓缩液的体积、静置沉淀的温度和95％乙醇加入量，明显提高了粗多糖中的多糖含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，具体操作步骤如下：
(1)取干燥云芝碎片300g，用3000g去离子水在95～100℃条件下煮提10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇混合均匀，在25℃密闭条件下静置24h后在3000r/min的条件下离心20min，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖18.3g，收率为6.1％；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到难溶于水的棕褐色颗粒状一级多糖9.8g；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的棕色颗粒状二级多糖1.39g；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的白色粉末状三级多糖0.91g。
采用苯酚-硫酸法(徐志祥，李刚，李宝健，苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的条件研究【J】.中国食用菌，2000，22(3)：6-8)，以葡聚糖绘制标准曲线，测定本实施例一级多糖、二级多糖和三级多糖的糖含量；采用凯氏定氮法测定本实施例一级多糖、二级多糖和三级多糖的蛋白含量，测定结果如表1所示：
表1三种多糖糖含量及蛋白含量
由上表及三种多糖的外观及溶解性结果可看出，采用乙醇分级提纯，沉淀出多糖的糖含量增加并不明显，但糖的性状明显变好；糖中的蛋白含量呈递增趋势，根据三种多糖的溶解性及含量分析可推断出粗多糖中大分子量成分含量较高。
实施例2
本实施例的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，具体操作步骤如下：
(1)取干燥云芝碎片300g，用3000g去离子水在95～100℃条件下煮提10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/3，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇混合均匀，在25℃密闭条件下静置24h后在3000r/min的条件下离心20min，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖17g，收率为5.67％；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到难溶于水的棕褐色颗粒状一级多糖7.5g；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的棕色颗粒状二级多糖1.2g；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的白色粉末状三级多糖0.8g。
实施例3
本实施例的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，具体操作步骤如下：
(1)取干燥云芝碎片300g，用3000g去离子水在95～100℃条件下煮提10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/6，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇混合均匀，在25℃密闭条件下静置24h后在3000r/min的条件下离心20min，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖15g，收率为5％；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到难溶于水的棕褐色颗粒状一级多糖5.2g；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的棕色颗粒状二级多糖1.1g；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的白色粉末状三级多糖0.78g。
实施例4
本实施例的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，具体操作步骤如下：
(1)取干燥云芝碎片300g，用3000g去离子水在95～100℃条件下煮提10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇混合均匀，在10℃密闭条件下静置24h后在3000r/min的条件下离心20min，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖16g，收率为5.33％；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到难溶于水的棕褐色颗粒状一级多糖7.7g；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的棕色颗粒状二级多糖1.15g；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的白色粉末状三级多糖0.79g。
实施例5
本实施例的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，具体操作步骤如下：
(1)取干燥云芝碎片300g，用3000g去离子水在95～100℃条件下煮提10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/2，加入浓缩液4倍体积的95％乙醇混合均匀，在60℃密闭条件下静置24h后在3000r/min的条件下离心20min，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖17.3g，收率为5.77％；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到难溶于水的棕褐色颗粒状一级多糖8.6g；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的棕色颗粒状二级多糖1.23g；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到易溶于水的白色粉末状三级多糖0.83g。
采用苯酚-硫酸法(徐志祥，李刚，李宝健，苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的条件研究【J】.中国食用菌，2000，22(3)：6-8)，以葡聚糖绘制标准曲线，测定实施例1～5中粗多糖的糖含量，结果如表2所示：
表2实施例1～5中粗多糖的糖含量
从上表结果可以看出，粗多糖制取过程中滤液的浓缩程度，即乙醇提取前的药液浓度对粗多糖中的糖含量具有极显著的影响，乙醇提取时的温度对粗多糖中的糖含量具有显著的影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，其特征在于：所述工艺包括以下操作步骤：
(1)取干燥云芝碎片，用10～15倍质量的去离子水在95～100℃条件下煮提8～10h，过滤，滤液浓缩至原体积的1/6～1/2，加入浓缩液3～5倍体积的95％乙醇混合均匀，静置沉淀后离心，取沉淀物在常温下干燥，得粗多糖；
(2)将步骤(1)得到的粗多糖配制成质量浓度为5％的水溶液，然后加入水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到一级多糖；
(3)将步骤(2)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到二级多糖；
(4)将步骤(3)得到的上清液再加入原水溶液1倍体积的无水乙醇混合均匀，静置沉淀，过滤得到沉淀物和上清液，沉淀物真空干燥得到三级多糖。
2.根据权利要求1所述的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，其特征在于：步骤(1)中所述的滤液浓缩是指浓缩至原体积的1/2；所述95％乙醇的加入量为浓缩液体积的4倍；所述静置沉淀是指在25℃密闭条件下静置24h。
3.根据权利要求1所述的一种云芝糖肽的提取及分级提纯工艺，其特征在于：步骤(1)中所述的离心是指在3000r/min的条件下离心20min。
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