CN101864369A

CN101864369A - 一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌及其应用

Info

Publication number: CN101864369A
Application number: CN 201010185083
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 谷巍; 张志焱; 杨立华; 程秀芳; 刘虹
Original assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Current assignee: Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd; TAI'AN BEST FARM BEST FOOD AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101864369B

Abstract

本发明公开了一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌，该菌株命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。其菌学特征如下：细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；麦芽汁固体培养，菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、蔗糖和棉子糖；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵。本发明的产朊假丝酵母具备较强的富硒能力，且稳定性好，可以用于硒酵母生产，是一株极具研究开发价值的菌株。

Description

一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌，属于生物技术领域。

背景技术

硒是人体和动物必需的微量营养元素之一，是动物体内谷胱甘肽过氧化酶的活性成分，这种酶能清除动物细胞呼吸代谢中产生的过氧化物与羟自由基，维护生物膜的完整性，从而具有提高机体免疫力，有保护肝脏和抗衰老作用。人体缺硒会导致免疫力的下降，严重时会导致“克山病”和“大骨节病”的发生。动物硒缺乏会导致多种疾病的发生，如肌肉营养不良，鸡肝脏坏死、营养性脑软化症，仔猪桑椹心，幼驹腹泻、胰纤维化和胎盘滞留等。

人们在研究补硒时，常把硒的化合物分成有机硒和无机硒两大类，有机硒的生物活性较高，能够有效地在体内同化，且毒性比无机硒小，又利于在生物体内吸收，是一种比较理想的微量元素营养强化剂。

硒酵母是以酵母为载体，将无机硒转化为有机硒的发酵产品，酵母细胞培养在含硒的培养基中，经过一系列生化过程将胞外的碳源、氮源、磷源及硒源等吸收到生物体内进行生长繁殖，同时无机硒也被转化到有机大分子上，形成具有较高生物活性和较低毒性的有机硒。硒酵母产品用于防治疾病和作为饲料添加剂有着广泛的应用前景。

目前，市场上虽有硒酵母出售，但其成本偏高，如湖北安琪酵母股份有限公司出售的动物用福邦酵母硒喷干粉硒含量1000ppm每公斤售价65元，硒含量2000ppm每公斤售价100元以上，保健品用酵母硒(硒含量2000mg/kg)每公斤售价280元。究其原因，是没有好的菌种，导致生产成本偏高，因此，急需筛选和培育一种具有较强富硒能力的菌种。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌，及该菌在生产制备硒酵母中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株具有较强有机硒耐受、富集和转化能力的酵母菌，该菌株命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。

本发明的酵母菌的菌学特征如下：所述产朊假丝酵母细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为3.5μm～4.5μm×7.0μm～13.0μm，以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；麦芽汁固体培养，菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、蔗糖和棉子糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖；能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度30℃，最适生长pH为6.0。

本发明的酵母菌的的培养条件、检测存活性条为：

培养基：采用麦芽汁培养基进行培养及存活性检测，培养基主要成分是麦芽汁加生长必需营养元素，即麦芽汁中加入2％葡萄糖、1％NH₄H₂PO₄、0.0001％CaCl₂、0.3％KH₂PO₄、0.0001％MnSO₄、0.1％Na₂HPO₄、0.1％MgSO₄7H₂O、0.05％蛋白胨、0.0001％FeSO₄、0.0001％ZnSO₄、0.1％泡敌(所述百分含量均为质量份数)，调pH至6.0。所述麦芽汁是通过以下方法配制的：取一份麦芽粉，加5倍重量份水，65℃水浴保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全，波美度8.0以上，即得麦芽汁。培养条件：pH 6.0，温度37℃，好氧。

本发明的酵母菌是从常规产朊假丝酵母中通过菌种耐硒驯化试验筛选出来的，经试验测试表明，本发明的产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM CCTCC M 2010090，具备较强的富硒能力，且稳定性好，可以用于硒酵母生产，是一株极具研究开发价值的菌株。

生产硒酵母时，采用常规工艺生产即可，或采取以下工艺：

一种利用产朊假丝酵母生产制备硒酵母的工艺，步骤为：将培养基置于发酵罐中，灭菌，空消：121℃，30min；实消：夹层加温，115℃，30min，完成实消；待培养基温度降至30℃时，接种，接种量1％～3％；接种后30℃培养发酵，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，通气量600m³/h；发酵过程中添加无菌亚硒硝酸钠溶液；发酵26h；发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为硒酵母成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得硒酵母成品。

一种利用产朊假丝酵母生产制备硒酵母的工艺，具体步骤如下：

(1)制备液体种子：采用5000mL三角瓶，培养基装量1000mL/5000mL三角瓶，115℃灭菌20min，冷却后接种，接种量1％～3％，在30℃摇床200rpm培养24h即为摇瓶液体种子培养基；

(2)种子罐发酵：采用50L种子罐，培养基装量为30L；实消温度115℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种，接种量1％～3％，培养温度28～30℃，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，培养16h，转入发酵罐培养；

(3)发酵罐培养：采用0.5T发酵罐，培养基装量为350L；实消温度115℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种，接种量1％～3％，培养温度28～30℃，罐压0.05MPa，通气量600m³/h；发酵过程中添加无菌亚硒硝酸钠溶液；发酵26h；

(4)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为硒酵母成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得硒酵母成品。

所述培养基即为前述的麦芽汁培养基。

所述添加的无菌亚硒硝酸钠溶液中硒的质量分数为10％。

所述添加的无菌亚硒硝酸钠溶液的方式为：在酵母菌生物量(鲜)达15％以上时第一次添加硒，添加量为10ppm(以硒计)；第一次添加4h后第二次添加硒，添加量为20ppm(以硒计)；再过4h后第三次添加硒，添加量为100ppm(以硒计)；第三次加硒4h后放罐。

或者：采用分次流加法，第一次加硒是在发酵后16h，硒添加量为10ppm(以硒计)；第二次加硒在发酵后20h，硒添加量为20ppm(以硒计)；最后一次加硒在发酵后22h，硒添加量为100ppm(以硒计)，发酵26h放罐。

附图说明

本发明提供的酵母菌命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。

图1为产朊假丝酵母的细胞形态示意图；

图2为产朊假丝酵母实验室小罐发酵生长曲线；

图3为发酵罐硒酵母生长曲线；

图4为富硒酵母样品示意图；

图5为实施例6的生产工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1菌种的筛选

目前，生物富硒的方法主要是微生物转化法。用于富硒的微生物有食用菌类、酵母类和益生菌类等。文献中介绍的普遍采用的菌种为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，产朊假丝酵母(Candida utilis)是根据公司内部专家委员会论证后的建议而采用的高生物量酵母。同时，啤酒酵母和产朊假丝酵母是卫生部规定可用于保健食品的真菌菌种(见2005年颁布的《真菌类保健食品申报与审评规定》)。故确定产朊假丝酵母和啤酒酵母为后备筛选菌种。主要考察菌种的富硒、耐受能力及其生物量转化能力。

1菌种筛选

1.1试验设备

水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、高速离心机、UV2000分光光度计。

1.2材料与方法

1.2.1材料

菌种：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；产朊假丝酵母(Candida utilis)，山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院保藏。

培养基：采用麦芽汁培养基。取一份麦芽粉加5份水，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5mL的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。

1.2.2方法

培养基装量100mL/500mL三角瓶，接种量10％，做两个平行，摇床200rpm 30℃培养，在30h加入50ppm硒(加入试剂为亚硒酸钠，浓度以硒计，下同)，48h停止发酵，60℃烘干至恒重，测生物量及硒含量。

1.3结果与讨论

表1酿酒酵母与产朊假丝酵母生物量与富硒能力对比

结论：如上表1所示，产朊假丝酵母生物量在麦芽汁培养基中明显大于酿酒酵母，其生物量比酿酒酵母提高68.0％；且富硒能力强，其菌体中硒的含量较酿酒酵母提高40.2％。故富硒酵母生产选用产朊假丝酵母。

2菌种耐硒驯化

2.1材料与方法

2.1.1菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis)，山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院保藏。

2.1.2方法

将产朊假丝酵母出发菌株逐级接入到含硒10ppm、15ppm、20ppm、25ppm......至100ppm的麦芽汁斜面培养基中，培养温度30℃培养时间48h，观察菌体生长情况。

挑取含硒50ppm斜面上菌体少量，接入250mL玻璃珠生理盐水中，在摇床上震荡30min，用无菌吸管吸取适量上述菌悬液于培养皿中，倒入少量麦芽汁琼脂培养基，摇匀，30℃培养约36h至有单个菌落长出。挑取生长快、边缘整齐、菌体较一致的单个菌落，传于麦芽汁斜面培养基中。培养48h后，接入麦芽汁液体三角瓶培养基中，装量50mL/500mL三角瓶，在30℃摇床200rpm培养48h后离心并洗涤3遍，60℃烘干至恒重，测生物量(作两平行)。

筛选出富硒能力强的菌株经传代，并与出发菌株对比，观察其遗传稳定性。

2.2结果与讨论

产朊假丝酵母在含50ppm硒的麦芽汁斜面培养基中表现出生长被抑制，菌苔变薄，镜检菌体有部分变大。随硒浓度的增加被抑制程度增加，如表2、表3所示。

表2产朊假丝酵母富硒驯化初筛结果

表3产朊假丝酵母富硒驯化初筛菌株与出发菌株比较结果

对上述结果，做T检验分析，T＝7.3，P＝0.005＜0.05，95％置信区间为(213.7，543.6)。结果表明，富硒驯化对于提高产朊假丝酵母的硒含量具有显著意义，15号菌株在生物量及发酵性状方面均最为突出。

驯化筛选后的产朊假丝酵母15号生物量和出发菌株基本一样，但富硒能力提高72.9％，且稳定性好，可以用于硒酵母生产。该菌株命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。其细胞形态示意图如图1所示。

实施例2培养基的筛选

1材料与方法

1.1材料

菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。

初筛用培养基：察氏培养基、PDA培养基、麦芽汁培养基、豆芽汁培养基。

复选用培养基：

(1)初筛选出的培养基

(2)在初筛出的培养基中加入酵母菌生长所需要的必需元素，即加入2％葡萄糖、1％NH₄H₂PO₄、0.0001％CaCl₂、0.3％KH₂PO₄、0.0001％MnSO₄、0.1％Na₂HPO₄、0.1％MgSO₄·7H₂O、0.05％蛋白胨、0.0001％FeSO₄、0.0001％ZnSO₄、0.1％泡敌，调pH至6.0。

1.2方法

在三角瓶中发酵作比较试验，装量50mL/500mL三角瓶，接种量8％，作两个平行，30℃摇床200rpm培养48h，60℃烘干至恒重，测生物量。

2结果与讨论

产朊假丝酵母在初筛培养基中培养，数据见表4。

表4产朊假丝酵母培养基初筛试验结果

对表4结果做单样本T检验分析，差值95％置信区间为(-11.59，5.59)，P＝2.7＞0.05，故说明样本差异无显著性意义。由于产朊假丝酵母在麦芽汁和豆芽汁培养基中生物量较高，综合考虑成本等因素，基础培养基采用麦芽汁培养基为宜。

表5产朊假丝酵母在复选培养基中的生物量比较

如表5所示，对结果做单因素方差分析，F＝29.9，P＝0.019＜0.05，说明麦芽汁培养基(1)，麦芽汁培养基加必需元素(2)之间存在显著性差异。由于麦芽汁加酵母菌生长的必需营养元素后有利于酵母菌的生长，故产朊假丝酵母在培养基(2)的生物量明显高于培养基(1)，所以试验采用在麦芽汁加酵母菌生长的必需营养元素的培养基作为小罐发酵用培养基。

实施例3不同硒添加时间效果试验

为考察在菌株生长不同时期添加亚硒酸钠对菌株生长及富硒的影响，本试验选择了在发酵初始(0h)、对数生长期(22h)及成熟期(30h)这3个时间点向发酵液添加亚硒酸钠，至培养液中硒浓度为20μg/mL，46h结束培养。试验结果见表6。

表6不同硒添加方式对菌株生长及富硒情况的影响

由表6可知，初始培养基中添加硒所得菌株的生物量最低，只有2.89g/100mL，这表明发酵液中20μg/mL硒浓度在一定程度上还是会抑制菌株的生长。比较培养过程中加入无机硒的方式，在其对数生长期加硒比在后期加硒更好。从所获得的酵母总硒含量测定来看，添加时间对硒的转化能力是有影响的。最佳方式为对数生长期(22h)加入硒，其次是成熟期(30h)添加硒，而在培养初始添加硒所得的干酵母中含硒量最低。试验结果表明，在菌株培养22h时添加硒效果最佳，生物量3.56g/100mL。所以在后续试验确定在菌株对数期开始进行无机硒的添加，有利于获取较高的富硒酵母生物量。

实施例4实验室发酵罐小试

1仪器设备

实验室7L机械搅拌发酵罐、电热恒温摇床、离心机、分光光度计、电热板、通风橱。

2材料与方法

2.1材料

菌种：驯化得到的15号产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。

培养基：麦芽汁加酵母菌生长的必需营养元素，即上述培养基(2)。

2.2方法

液体种子制作：采用500mL三角瓶，装量100mL/500mL三角瓶，115℃灭菌20min，冷却后接种，在30℃摇床200rpm培养24h即为摇瓶种子培养基。

小罐发酵：小罐发酵共作了6罐，各次小罐发酵数据如表7所示。

表7各次小罐发酵数据

通过多次试验，总结出较为理想的发酵条件是装量为5L；实消温度115℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种。培养温度30℃；罐压0.04Mpa；搅拌转速200rpm。两小时取样一次，测定pH、波美度、生物量，26h放罐。硒的添加采用分次流加法，第一次加硒是在16h，硒添加量为10ppm；第二次加硒在20h，硒添加量为20ppm最后一次加硒在22h，硒添加量为100ppm，发酵结果如表8所示，生长曲线如图2所示。

表8产朊假丝酵母小罐发酵数据

从发酵结果看，产朊假丝酵母小罐发酵18h其生物量可达到1.6％，含硒量可达到2000μg/g以上，硒的添加以分次添加效果较好，第一次加硒是大约在16h，添加量为10ppm硒；第二次加硒在20h，添加量为20ppm硒；最后一次加硒在22h，添加量为100ppm硒。试验中发现同样是流加硒，加入总量达230ppm时发酵液会变红，说明有单质硒析出，故将硒的总流加量控制在130ppm。

实施例5车间试生产

硒酵母的生产工艺虽不复杂，但酵母的含硒量受发酵培养时间、接种量、发酵培养基中硒浓度等诸多因素的影响，存在着一定的差异。作为产业化开发其生产工艺须在试验室基础上加以改进，特别是发酵培养基中硒浓度、添加时间还有待进一步试验确定。目前这方面的研究报道较少，为获得含硒量较高的硒酵母，使其更具推广应用价值，顺利进行硒酵母的工业化生产，分别在一工厂菌液车间和邹平华孟集团发酵车间进行了试生产，并制定了硒酵母生产工艺及操作细则。

(一)一厂发酵罐发酵

1仪器设备

电热恒温摇床、50L种子罐、0.5T发酵罐、电炉、离心机、分光光度计、电热板、通风橱。

2材料与方法

2.1材料

培养基：麦芽汁加酵母菌生长的必需营养元素，即麦芽汁中加入2％葡萄糖、1％NH₄H₂PO₄、0.0001％CaCl₂、0.3％KH₂PO₄、0.0001％MnSO₄、0.1％Na₂HPO₄、0.1％MgSO₄.7H₂O、0.05％蛋白胨、0.0001％FeSO₄、0.0001％ZnSO₄、0.1％泡敌，调pH至6.0。

麦芽汁的制作：取一份麦芽粉加5份水，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5mL的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)，1500rpm离心取上清。

2.2方法

2.2.1液体种子制作

采用5000mL三角瓶，装量1000mL/5000mL三角瓶，115℃灭菌20min，冷却后接种，在30℃摇床200rpm培养24h即为摇瓶种子培养基。

2.2.2种子罐发酵

50L种子罐培养基装量为30L；实消温度115℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种。培养温度28～30℃，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，培养16h即可转入发酵罐培养。

2.2.30.5T发酵罐发酵

0.5T发酵罐培养基装量为350L；实消温度115℃，时间30min；待培养基温度降为30℃时接种。培养温度28～30℃，罐压0.05MPa。

发酵期间两小时取样一次，镜检并测定pH、波美度、生物量，26h放罐。硒的添加采用分次流加法，第一次加硒是在16h，流加量为10ppm；第二次加硒在20h，流加量为20ppm；最后一次加硒在22h，流加量为100ppm。发酵结果如表9所示，发酵罐硒酵母生长曲线如图3所示。

表9产朊假丝酵母0.5吨发酵罐发酵数据

从发酵结果看，产朊假丝酵母小罐发酵26h其含硒量即可达到2000μg/g(干样)以上，硒的添加以分次添加效果较好，第一次加硒是大约在16h，添加量为10ppm；第二次加硒在20h，添加量为20ppm；最后一次加硒在22h，添加量为100ppm。

2.2.4发酵终点的控制及后处理

由于酵母在生长过程中吸收无机硒，经过生化反应将其转化为自身蛋白质组成部分，而酵母本身具有还原性，大量酵母成熟后，可将发酵液中氧化态的四价硒还原为红色单质硒沉淀下来。由于这种单质硒和硒酵母混在一起，很难用物理方法分开，因此在硒酵母的生产中，一定要做好发酵终点的控制，防止单质硒过多生成而使发酵液变红。试验证明在本发酵试验条件下可以很好地控制红硒沉淀的产生，但要注意采用冷冻干燥时发酵结束后要立即离心，并清洗菌体2～3遍，然后冷冻干燥、粉碎、包装；采用喷雾干燥则须在发酵结束后立即喷干。

(二)邹平华孟集团发酵

发酵工艺同一工厂发酵罐发酵。试验测定生物量为18mL/100mL，菌泥的硒含量为667μg/g，水分为64.8％，绝干硒含量为1895μg/g，本次试验酵母细胞内的硒未达到2000μg/g，原因在于考虑到要将发酵液运回公司菌液车间进行后处理，为防止运输过程中菌液变红，故缩短了发酵时间。发酵后，所得产品样品如图4所示。

实施例6硒酵母生产

1工艺流程

硒酵母生产采用麦芽汁培养基为基础培养基，大麦芽须经品管部门检测合格后使用。工艺流程图如图5所示。

2操作细则

2.1麦芽的质量控制

2.2麦芽汁的制作

取一份麦芽粉加5份水，65℃水浴保温4h，使其自行糖化，直至糖化完全，波美度8.0以上。

350L种子罐发酵

3.1培养基

麦芽汁 100％

葡萄糖 2％

NH₄H₂PO₄ 1％

CaCl₂ 0.0001％

KH₂PO₄ 0.3％

MnSO₄ 0.0001％

Na₂HPO₄ 0.1％

MgSO₄.7H₂O 0.1％

蛋白胨 0.05％

FeSO₄ 0.0001％

ZnSO₄ 0.0001％

泡敌 0.1％

初始pH6.0，装量为30L。

3.2灭菌、发酵

灭菌：空消：121℃30min；

实消：夹层加温，115℃30min完成实消。

接种：待培养基温度降到30℃接种，接种量为2％。

发酵：接种后30℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm。

4发酵：1000L发酵罐发酵

4.1硒溶液的制备

按每1000mL水加入无水亚硒酸钠228g的比例配制成含硒10％的亚硒酸钠溶液，121℃灭菌30min，做成硒含量为10％的无菌亚硒酸钠溶液，备用。

4.2培养基

同50L种子罐发酵，装量为700L。

4.3灭菌

空消：121℃30min；

实消：115℃30min完成实消。

4.4接种

待培养基温度降到30℃接种，接种量为2％。

4.5发酵及发酵过程控制

接种后30℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，通气量600m³/h。

发酵期间每2h取样一次，镜检并测定pH值和生物量。发酵期间pH值降为4.5时用NaOH调为5.5；在酵母菌生物量(鲜)达15％以上时第一次添加硒，添加量为10ppm(以硒计)；第一次添加后约4h第二次添加硒，添加量为20ppm(以硒计)；4h后第三次添加硒，添加量为100ppm(以硒计)。第三次加硒后4h放罐。

5后处理

5.1冷冻干燥

发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为硒酵母成品。

5.2喷雾干燥

发酵结束后，立即喷干。

实施例7硒酵母安全性试验

采用小白鼠给硒组和不给硒组做对照试验。

1材料与方法

1.1硒酵母

实施例5制备的硒酵母，用球磨机破壁后得到的硒酵母，硒含量为2153.5μg/g，破壁率为60％左右。

1.2试验动物选择与分组

选择体重18～22g左右的昆明种小鼠40只，雌雄各半。基础日粮预饲一周后随机分为4个试验组，每组动物数小鼠为10只，雌雄各5只，分盒喂养，其中一组为对照组，其余三组为试验组。

1.3饲养

对照组小鼠饲粮为基础日粮；试验组小鼠饲粮是在基础日粮的基础上加入1ppm；10ppm；20ppm的硒酵母(以硒计量)。自由采食，饲喂环境相同。试验组连续饲喂试验饲料30天。试验中观察小鼠的各项指标，并做好记录。在试验结束时称体重，计算小鼠体重变化；解剖观察肝脏和肾脏有无病变，结果如表10所示。

2结果与讨论

表10安全性试验记录表

经单向方差分析检验，肝重/体重F＝0.247，P＝0.862，P＞0.01，肾重/体重F＝0.777，P＝0.539，P＞0.01，可见试验组与对照组之间无显著性差异，说明在1～20ppm硒浓度范围内对小鼠的肝脏和肾脏无明显影响。且试验小鼠体态正常，肝脏和肾脏均无肉眼可见变化。

Claims

1.一株具有较强有机硒耐受、富集、转化能力的酵母菌，其特征在于：该菌株命名为产朊假丝酵母(Candida utilis)CUM，已于2010年04月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010090。

2.根据权利要求1所述的具有较强有机硒耐受、富集、转化能力的酵母菌，其特征在于：所述产朊假丝酵母细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为3.5μm～4.5μm×7.0μm～13.0μm，以多边出芽方式进行无性繁殖，形成假菌丝；麦芽汁固体培养，菌落呈乳白色，表面光滑湿润，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状；化能异养型，能发酵葡萄糖、蔗糖和棉子糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖；能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度30℃，最适生长pH为6.0。

3.权利要求1所述的一株具有较强有机硒耐受、富集、转化能力的酵母菌在生产制备硒酵母中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：将培养基置于发酵罐中，灭菌，空消：121℃，30min；实消：夹层加温，115℃，30min，完成实消；待培养基温度降至30℃时，接种，接种量1％～3％；接种后30℃培养发酵，罐压0.05MPa，搅拌转速80rpm，通气量600m³/h；发酵过程中添加无菌亚硒硝酸钠溶液；发酵26h；发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为硒酵母成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得硒酵母成品。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：

(4)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为硒酵母成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得硒酵母成品。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述培养基为麦芽汁培养基，其成分为麦芽汁加酵母菌生长的必需营养元素，即：麦芽汁中加入2％葡萄糖、1％NH₄H₂PO₄、0.0001％CaCl₂、0.3％KH₂PO₄、0.0001％MnSO₄、0.1％Na₂HPO₄、0.1％MgSO₄.7H₂O、0.05％蛋白胨、0.0001％FeSO₄、0.0001％ZnSO₄、0.1％泡敌，调pH至6.0；所述百分含量均为质量份数；

所述麦芽汁是通过以下方法配制的：取一份麦芽粉，加5倍重量份水，65℃水浴保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全，波美度8.0以上，即得麦芽汁。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述添加的无菌亚硒硝酸钠溶液中硒的质量分数为10％。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述添加无菌亚硒硝酸钠溶液的方式为：在酵母菌生物量(鲜)达15％以上时第一次添加硒，添加量为10ppm(以硒计)；第一次添加4h后第二次添加硒，添加量为20ppm(以硒计)；再过4h后第三次添加硒，添加量为100ppm(以硒计)；第三次加硒4h后放罐。

9.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述添加无菌亚硒硝酸钠溶液的方式为：采用分次流加法，第一次加硒是在发酵后16h，硒添加量为10ppm(以硒计)；第二次加硒在发酵后20h，硒添加量为20ppm(以硒计)；最后一次加硒在发酵后22h，硒添加量为100ppm(以硒计)，发酵26h放罐。