CN101058796B

CN101058796B - 一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN101058796B
Application number: CN2007100982541A
Authority: CN
Inventors: 吴力克; 张娟; 王宇明
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2007-04-25
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2027-04-25
Also published as: CN101058796A

Abstract

本发明公开了一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基及其制备方法。所述复合培养基由以下成分组成：螺旋藻粉50-150g，水苏糖40-80g，5％猪肝浸液30-100mL，蒸馏水补足1000mL。本发明有益效果：所选婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌3种双歧杆菌在该培养基中均生长良好，在最佳发酵状态下，最大生长量均可达到10¹⁰cfu/mL以上，优于经典的双歧杆菌选择性培养基TPY培养基及改良TPY培养基的液体深层培养效果。该复合培养基配方成分简单，用量小，成本低，制作过程简便，培养条件易控，安全无污染，可广泛用于作为最重要益生菌之一的双歧杆菌的研究、开发和生产，对双歧杆菌的工业化大规模、高密度发酵培养尤为适宜，亦对进一步深化螺旋藻和水苏糖的资源化开发利用具有重要意义。

Description

一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于药品、食品和食品添加剂以及兽药、生物饲料、饲料添加剂生产技术领域，尤其涉及一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基及其制备方法。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体最重要的生理性细菌，是胃肠道正常菌群中核心的优势菌群。长期和大量的研究表明，在人和豢养动物的整个生命过程中，双歧杆菌的多项生理调节功能对维持其健康状态具有至关重要的作用；换句话说，机体几乎所有的非健康状态，都直接或间接地与双歧杆菌数量和功能的平衡失调有关。正因如此，从20世纪70年代末开始，双歧杆菌制剂及其相关产品的开发及其产业化，成为健康产业链中重要的一环，在药品、保健品、食品、兽药和饲料等生产领域得到蓬勃发展，至今仍势头强劲。目前，双歧杆菌制剂及其相关产品的开发和生产主要通过发酵工程技术手段进行，主要有赖于双歧杆菌的大规模发酵培养，因此，不断开发出双歧杆菌高效、简便、廉价和安全的生产型培养基，以期提高培养效率，保证产品质量，降低生产成本，已成为双歧杆菌制剂及其相关产品的生产企业和研发机构着力追求的目标。

在现有技术中，双歧杆菌的规模培养和发酵生产仍以经典的TPY培养基或改良TPY培养基为主。实践证明，此类培养基培养双歧杆菌效果较好，细胞繁殖快，生物量较大，菌体浓度的量级一般可达10⁸cfu/mL。但目前TPY培养基存在如下问题：一是配方较复杂，质量和生产条件控制不易，原料种类多、价格高，不适宜大规模发酵时应用；二是需加入过多的无机盐类，对人体和动物健康具有潜在的有害影响；三是双歧杆菌对营养和环境条件要求苛刻，对TPY培养基的低氮源和低pH耐受性差，存活时间缩短，发酵生物量仍偏低，一般难以达到生产要求。

因此，如何开发出更为高效、经济、易控和安全的双歧杆菌发酵培养基，以适应双歧杆菌的生产和相关产业的快速发展，是研发人员面临的巨大挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于双歧杆菌大规模、高密度培养的发酵复合培养基，以及该复合培养基的制备方法。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基，由以下成分组成：

螺旋藻粉 50-150g

水苏糖 40-80g

5％猪肝浸液 30-100mL

蒸馏水补足 1000mL。

其中婴儿双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 60g

5％猪肝浸液 40mL

蒸馏水补足 1000mL。

青春双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 50g

5％猪肝浸液 50mL

蒸馏水补足 1000mL。

长双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 40g

5％猪肝浸液 60mL

蒸馏水补足 1000mL。

本发明所述双歧杆菌发酵用复合培养基的制备方法如下：

(1)制备标准螺旋藻微粉体(LVT)：

a.选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm。

b.螺旋藻粉称重后，用60目筛过筛除杂。

c.将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点(玻璃点)后，用气流粉碎(包括使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨和靶式气流磨等)的方法进行能量破碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干，按培养基配比量的需求分装备用。

(2)准备水苏糖：有成品市售，本发明选用食品级的可溶性水苏糖结晶。

(3)制备5％猪肝浸液：

①将5g市售猪肝浸粉，加入70-80℃加热的蒸馏水100mL中，用振荡或搅拌的方法直至肝浸粉在水中彻底溶解形成溶液，即得5％猪肝浸液。

②5％猪肝浸液也可用下述方法制得：

a.精选质量无虞的新鲜或冷冻猪肝(含水量50-60％)，称重后绞成碎末。

b.装入刻度烧瓶内，按质量∶容积为18g-20g∶100mL的配比量加入蒸馏水，升温到100℃，持续浸煮约4-6h。

c.第一次浸煮完毕的猪肝悬液，待降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取得滤液；残余肝渣再次浸煮，时间2h，降温后重复分级过滤和榨汁过程，合并滤液，3000r/min离心5分钟，去除沉淀的少许滤渣，得5％猪肝浸液。

(4)制备发酵复合培养基：

根据所述三种双歧杆菌的不同培养基配方，组合配比量的螺旋藻粉、水苏糖和5％猪肝浸液，并以蒸馏水定容，即可分别制得培养婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌所需的复合发酵培养基。

本发明的有益效果：本发明所涉及的双歧杆菌均在本发明提供的培养基中生长良好，最大生长量级均可达到10¹⁰cfu/ml，发酵增菌效果优于目前使用的经典双歧杆菌培养基TPY培养基或TPY改良培养基，表明本发明提供了一种效果优良的双歧杆菌选择培养基；本发明所涉及的双歧杆菌复合培养基配方简单，主要原料螺旋藻属于优良的可食用天然物质，对人体和环境都十分安全，其它辅助成分种类少，用量小，且亦属于可食用物质，安全性好；培养基制备方法简单，性能可靠，增菌效果稳定性、重复性好，在摇瓶和/或发酵罐培养条件下均可达到活菌数10¹⁰cfu/ml的高密度培养水平，表明本发明提供了一种安全性、适用性均好的双歧杆菌发酵培养基；本发明所涉及的复合培养基成分组成和生产工艺流程简单，成本低，适宜于双歧杆菌的工业化大规模培养；发酵后菌体与发酵液中其它成分比重不同，易于分离，节省能耗和设备成本；不经分离的发酵液以及分离后的菌体和上清液均可直接开发成双歧杆菌相关制品，有利于发酵产品的多元化开发，且没有废液和废渣污染环境，表明本发明提供了一种经济效益和生态效益俱佳的双歧杆菌生产培养基；本发明所涉及复合培养基中主要原料的来源，除螺旋藻成型产品外，尚可以是食品级或饲料级的螺旋藻粉体原料，乃至富含螺旋藻或其营养成分的藻液和藻渣；次要原料来源，鲜猪肝和猪肝浸粉价廉易得，水苏糖除成型产品外，亦可采用富含水苏糖的大豆、生地、泽兰、银苗等的浸提物；本发明复合培养基的成分原料特点，既保证了广泛的原料来源、降低生产成本，又有益于多种天然物质的资源化开发利用。

附图说明

图1为婴儿双歧杆菌(Bifid1)、青春双歧杆菌(Bifid2)和长双歧杆菌(Bifid3)在标准螺旋藻液体培养基中摇瓶培养的生长曲线示意图；

图2为婴儿双歧杆菌(Bifid1)、青春杆菌(Bifid2)和长双歧杆菌(Bifid3)在标准螺旋藻液体培养基中发酵罐培养的生长曲线示意图；

图3～5为Bifid1、Bifid2、Bifid3三株双歧杆菌在正交试验中的三因素不同水平与实验指标关系示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基及该复合培养基的制备方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了确定本发明所述发酵培养基的组成，发明人进行了如下工作：

一、研究了螺旋藻作为复合培养基基础成分的适合状态。

螺旋藻产品目前有藻粉、片剂、胶囊、酒类和软饮料，以及作为添加剂制成的各种形态的营养食品和饲料添加剂，但其基础状态是粉体，即从大然水体中和/或养殖池打捞后，过筛收集藻泥，将其干燥(烘干或晒干)成为藻粉，直接使用或再进行深度加工。螺旋藻的成分分析和质量标准均是依其藻粉而定的。研究表明，占螺旋藻绝大部分的蛋白质和糖类基本是水溶性的，但由于被多层的细胞壁和类囊体膜包绕，很难顺利释出并被分解成小分子；此外，螺旋藻藻体为螺旋丝状结构，长度达225-2250μm不等，常因其结构特性相互缠结成团，严重影响了藻体的分散性，使螺旋藻丰富的营养作用难以体现。鉴于双歧杆菌的生长和发酵特点，只有溶解于溶剂中的可溶性成分和粒度极小的小分子物质才能被双歧杆菌直接利用或分解利用，故必需将螺旋藻进行充分的前处理，使其转变为双歧杆菌培养基基础成分的合适状态。本发明人根据螺旋藻的结构特点，确定获得本培养基所用标准螺旋藻微粉体(LVT)的步骤如下：

1.选择市售平均粒径为150-250μm的食品级或饲料级螺旋藻粉。

2.称重后过60目筛，去除藻粉中的杂质和结块，将所选螺旋藻粉低温冻结至裂碎临界点(玻璃点)，用气流粉碎(包括使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨和靶式气流磨等)的方法进行能量粉碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性微粉体。

3.收集上述可溶性微粉体，烘干，按配比量的需求分装备用。

二、观察了3株双歧杆菌在以螺旋藻为单一成分培养基中的生长状况

为了设计以螺旋藻为基础原料的发酵培养基，首先对3种双歧杆菌在标准螺旋藻液体培养基中的生长状况进行了系统研究。方法为：

1.制备标准螺旋藻微粉体液体培养基：

a.称取标准螺旋藻微粉体(LVT)80g，加入800mL双重蒸馏水中，边添加边搅拌，直至LVT均匀溶化和/或分散于蒸馏水中，补加蒸馏水定容，确定溶质/溶剂配比量为80g LVT制得1000mL标准螺旋藻微粉体液体培养基。

b.将制得的LVT液体培养基置于高压灭菌容器中，110℃、0.2MPa高压蒸汽灭菌20min，灭除培养液中的杂菌和酶活，冷却备用。

2.在实验室摇瓶条件和中试发酵罐条件进行双歧杆菌培养：

a.将3株双歧杆菌(分别为：婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到装有500ml标准螺旋藻微粉体液体培养基的无菌瓶中，在绝对厌氧、pH7.0、温度35.5℃的条件下，置小型恒温振荡培养箱中，以110r/min的速率，间歇振摇培养(每1h一次，每次10min)；以每3h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得结果表明：3株双歧杆菌均可在标准螺旋藻微粉体液体培养基中良好生长。婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌大约在培养18h时进入对数生长期，在培养48h时达到生长高峰，此时婴儿双歧杆菌的最大生长量为3.03×10⁹cfu/ml，青春双歧杆菌的最大生长量为2.43×10⁹cfu/ml；长双歧杆菌大约在培养15h进入对数生长期，在培养42h时达到生长高峰，此时长双歧杆菌的最大生长量为2.11×10⁹cfu/ml(见附图1)。

b.将3株双歧杆菌(分别为：婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到装有7L标准螺旋藻微粉体液体培养基的10L厌氧培养罐中进行培养。培养条件：初始pH7.2，温度36.0℃，110r/min间歇搅拌每2h一次；以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得结果表明：3株双歧杆菌均可在标准螺旋藻微粉体液体培养基中良好生长。婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌大约在培养20h时进入对数生长期，在培养48h时达到生长高峰，此时婴儿双歧杆菌的最大生长量为2.86×10⁹cfu/ml，青春双歧杆菌的最大生长量为2.48×10⁹cfu/ml；长双歧杆菌大约在培养16h进入对数生长期，在培养40h时达到生长高峰，此时长双歧杆菌的最大生长量为2.45×10⁹cfu/ml(见附图2)。

上述结果证实，本发明所述方法制备的标准螺旋藻微粉体液体培养基的营养组分构成，无论在实验室水平的摇瓶培养条件，还是在中试水平的发酵罐培养条件，均适合上述3种双歧杆菌的繁殖生长，可作为筛选优化大规模培养双歧杆菌之生产培养基的初始培养基。

三、考察了在标准螺旋藻微粉体液体培养基中添加不同辅助营养成分对双歧杆菌生长的影响

在本发明中，发明人参考经典双歧杆菌培养基的配方，在标准螺旋藻微粉体液体培养基中分别添加相关营养成分，考察研究这些营养成分对标准螺旋藻微粉体液体培养基的营养补充效果，为研制效果更佳的双歧杆菌发酵培养基提供科学依据。方法为：将3种双歧杆菌(分别为：婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌)复苏活化后，分别以0.2％的接种量，接种到7L标准螺旋藻微粉体液体培养基中，同时分别按常规比例加入受试物质成分(见表1-表3)，于10L厌氧发酵罐中按前述条件进行培养，通过活菌数的测定，评价各种受试物质成分对3株双歧杆菌生长状态的影响。结果为：在标准螺旋藻微粉体液体培养基中分别添加水苏糖和5％猪肝浸液时，对3种双歧杆菌的促进生长作用极为显著；在标准螺旋藻微粉体液体培养基中分别添加牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、可溶性淀粉时，对3种双歧杆菌也有明显的促进生长作用。实验结果见表1、表2和表3。

注：“+”表示添加后有促进作用；“-”表示添加后有抑制作用。

表2 标准螺旋藻液体培养基添加不同受试物质成分后青春双歧杆菌的生长状况

表3 标准螺旋藻液体培养基添加不同受试物质成分后长双歧杆菌的生长状况

从以上3个表的实验结果可以得出如下初步结论：

1.添加不同的辅助营养物质对3种双歧杆菌生长的影响效果基本一致，表明双歧杆菌属对营养环境的要求具有共性特点。

2.在与LVT相组合的碳源中，称为“超强双歧因子”的水苏糖对3种双歧杆菌有极为显著的促进生长作用；葡萄糖、可溶性淀粉也有明显促生长作用，但浓度偏高，影响成本，而且葡萄糖易造成菌株对LVT利用的干扰。

3.在与LVT相组合的氮源中，5％猪肝浸液分别对3种乳杆菌有极为显著的促进生长作用；酵母膏、牛肉膏也有明显促生长作用，但所需浓度远远大于猪肝浸粉和浸液，且体积大，成本偏高，不适用于生产培养基。

四、筛选优化了螺旋藻培养基的配方，用正交试验法确定了培养3种双歧杆菌培养基的最佳配方组成

综合上述结果，并充分考虑成本因素，通过多次筛选试验，最终确定选用水苏糖和5％猪肝浸液为辅助营养添加物质，与标准螺旋藻微粉体(LVT)分别构成3种双歧杆菌的专用复合培养基。进一步地，在三因素的单因了试验基础上，设计正交试验对每一菌种复合培养基中三种成分的的最适配比组合进行了筛选优化。本试验采用了L⁹(3⁴)正交表(见表4-表12)。

首先选择婴儿双歧杆菌的一个菌株(Bifid1)作为试验菌株实施正交试验。具体过程：将Bifid1复苏活化后，以0.2％的接种量接种于所选物质成分以不同配比浓度组合的各个液态培养基中，在厌氧条件下，置37℃恒温振荡培养箱，以110r/min的速率振摇培养48h，以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得正交试验结果表明：A2B2C1为最优组合(见表5)。为寻找理论上的最优培养基组合，作所选三个因素不同水平与试验指标的关系图，结果为：A2、B2、C1分别显示为三个因素的最佳水平(见图3)，即婴儿双歧杆菌在8％标准螺旋藻粉液体培养基+6％水苏糖+4％的5％猪肝浸液的复合培养基中生长最好。

在得到婴儿双歧杆菌(Bifid1)的理想培养基组合配方后，选择青春双歧杆菌和长双歧杆菌各一个菌株(分别为Bifid2和Bifid3)，进行培养效果的扩大验证试验。具体过程：将Bifid2和Bifid3复苏活化后，分别以0.2％的接种量接种于三种物质以不同配比浓度组合的各个液态培养基中，在厌氧条件下，置37℃恒温振荡培养箱以110r/min的速率振摇培养48h，以每4h为一时段，定时取样进行活菌计数。所得正交试验结果表明：Bifid2在添加5％水苏糖和5％猪肝浸液的8％标准螺旋藻微粉体液体培养基中，活菌数可达10¹⁰cfu/ml以上，最优组合亦为A2B2C1(见表8)，即在8％标准螺旋藻液体培养基+5％水苏糖+5％的5％猪肝浸液的复合培养基中生长最好；Bifid3在添加4％水苏糖和6％猪肝浸液的8％标准螺旋藻粉液体培养基中，活菌数可达10¹⁰cfu/ml以上，最优组合也为A2B2C1(见表11)，即在8％标准螺旋藻液体培养基+4％水苏糖+6％的5％猪肝浸液的复合培养基中生长最好。

正交试验结果列表如下：

表4 Bifid1正交试验水平和因素列表

表5 Bifid1正交试验方案和结果分析表

表6 Bifid1在A2B2C1组合配方培养基中验证试验

表7 Bifid2正交试验水平和因素列表

表8 Bifid2正交试验方案和结果分析表

表9 Bifid2在A2B2C1组合配方培养基中验证实验

表10 Bifid3正交试验水平和因素列表

表11 Bifid3正交试验方案和结果分析表

表12 Bifid3在A2B2C1组合配方培养基中验证实验

经以上的系列试验得出以下结果：

1.双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

标准螺旋藻粉体(LVT) 50～150g

低聚糖 30～80g

5％猪肝浸液 30～100mL

蒸馏水补足 1000mL

2.婴儿双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

标准螺旋藻粉 80g

水苏糖 60g

5％猪肝浸液 40mL

蒸馏水补足 1000mL

3.青春双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

标准螺旋藻粉 80g

水苏糖 50g

5％猪肝浸液 50mL

蒸馏水补足 1000mL

4.长双歧杆菌发酵用复合培养基的适宜配方是：

标准螺旋藻粉 80g

水苏糖40g

5％猪肝浸液 60mL

蒸馏水补足 1000mL

实施例1

婴儿双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为：

标准螺旋藻微粉体(LVT) 800g

水苏糖 600g

5％猪肝浸液 400mL

蒸馏水补足 10000mL

婴儿双歧杆菌发酵用复合培养基的制备：

(1)制备标准螺旋藻微粉体(LVT)：

a.选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm。

b.螺旋藻粉称重后，用60目筛过筛除杂。

c.将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点(玻璃点)后，用对喷式气流磨法进行气流粉碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干，分装、密封备用。

(2)准备水苏糖：有成品市售。本发明选用食品级的可溶性水苏糖结晶，分装、密封备用。

(3)制备5％猪肝浸液：取50g市售猪肝浸粉，加入70-80℃加热的蒸馏水1000mL中，用振荡或搅拌的方法直至肝浸粉在水中彻底溶解形成溶液，得5％猪肝浸液。

(4)制备发酵复合培养基：即时称取标准螺旋藻微粉体(LVT)800g和水苏糖600g，先后加入8000ml蒸馏水中，充分搅拌溶解后，再添加预先制得的5％猪肝浸液400ml，混匀，用蒸馏水补足容积至10000ml，即制得婴儿双歧杆菌发酵用复合培养基。

实施例2

青春双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为：

标准螺旋藻微粉体 800g

水苏糖 500g

5％猪肝浸液 500mL

蒸馏水补足 10000mL

青春双歧杆菌发酵用复合培养基的制备：

(1)制备标准螺旋藻微粉体(LVT)：

a.选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm。

b.螺旋藻粉称重后，用60目筛过筛除杂。

(3)制备5％猪肝浸液：

a.精选质量无虞的新鲜或冷冻猪肝(含水量70％)200g，绞成碎末。

b.装入刻度烧瓶内，按质量∶容积为180g∶1000mL的配比量加入蒸馏水，升温到100℃，持续浸煮约4-6h。

(4)制备发酵复合培养基：即时称取标准螺旋藻微粉体(LVT)800g和水苏糖500g，先后加入8000ml蒸馏水中，充分搅拌溶解后，再添加预先制得的5％猪肝浸液500ml，混匀，用蒸馏水补足容积至10000ml，即制得青春双歧杆菌发酵用复合培养基。

实施例3

长双歧杆菌发酵用复合培养基的组成为：

标准螺旋藻粉 800g

水苏糖 400g

5％猪肝浸液 600mL

蒸馏水补足 10000mL

长双歧杆菌发酵用复合培养基的制备：

(1)制备标准螺旋藻微粉体(LVT)：

a.选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm。

b.螺旋藻粉称重后，用60目筛过筛除杂。

(4)制备发酵复合培养基：

即时称取标准螺旋藻微粉体(LVT)800g和水苏糖400g，先后加入8000ml蒸馏水中，充分搅拌溶解后，再添加预先制得的5％猪肝浸液600ml，混匀，用蒸馏水补足容积至10000ml，即制得长双歧杆菌发酵用复合培养基。

Claims

1.一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于由以下成分组成：

螺旋藻粉 50-150g

水苏糖 40-80g

5％猪肝浸液 30-100ml

蒸馏水补足 1000mL。

2.根据权利要求1所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于其组成为：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 60g

5％猪肝浸液 40mL

蒸馏水补足 1000mL。

3.根据权利要求1所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于其组成为：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 50g

5％猪肝浸液 50mL

蒸馏水补足 1000mL。

4.根据权利要求1所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于其组成为：

螺旋藻粉 80g

水苏糖 40g

5％猪肝浸液 60mL

蒸馏水补足 1000mL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于所述螺旋藻粉的制备过程为：选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm，称重后，用60目筛过筛除杂，所选螺旋藻粉用气流粉碎方法进一步粉碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干。

6.根据权利要求1-4任一项所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于：所述水苏糖为可溶性水苏糖结晶。

7.根据权利要求1-4任一项所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基，其特征在于所述5％猪肝浸液的制备过程为：将5g市售猪肝浸粉，加入70-80℃加热的蒸馏水100mL中，用振荡或搅拌的方法直至肝浸粉在水中彻底溶解形成溶液，即得5％猪肝浸液。

8.一种用于双歧杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备螺旋藻粉：选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径150-250μm，称重后，用60目筛过筛除杂，所选螺旋藻粉用气流粉碎方法进一步粉碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干，按培养基配比量的需求分装备用；

(2)准备水苏糖：选择市售食品级的可溶性水苏糖结晶；

(3)制备猪肝浸液：将5g市售猪肝浸粉，加入70-80℃加热的蒸馏水100mL中，用振荡或搅拌的方法直至肝浸粉在水中彻底溶解形成溶液，即得5％猪肝浸液；

(4)制备发酵培养基：根据权利要求2-4任一项所述培养基配方，组合配比量的螺旋藻粉、水苏糖和5％猪肝浸液，并以蒸馏水定容，即制得用于双歧杆菌发酵的复合培养基。

9.根据权利要求8所述的用于双歧杆菌发酵的复合培养基的制备方法，其特征在于：所述气流粉碎方法是指将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点后，使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨或靶式气流磨的气流粉碎方法进行能量破碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体。