CN113817629B - 一株产碱性蛋白酶菌株、所产碱性蛋白酶及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株产碱性蛋白酶菌株，涉及生物技术领域，所述菌株为柯赫芽孢杆菌(Bacillus kochii)，所述菌株的保藏日期为2020年6月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉市八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020180。本发明还提供上述菌株所产碱性蛋白酶和碱性蛋白酶的生产方法。本发明的有益效果在于：本发明中的菌株可以高效产碱性蛋白酶，所产碱性蛋白酶在55℃活性达到最高，在pH 10‑11时酶活性最高，二价阳离子中Mg²⁺、Mn²⁺对酶活有正向提升作用。

Description

一株产碱性蛋白酶菌株、所产碱性蛋白酶及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株产碱性蛋白酶菌株、所产碱性蛋白酶及方法。

背景技术

蛋白酶在温和的条件下作用于蛋白质中的肽键，可将蛋白质降解成小分子的多肽和氨基酸。蛋白酶在食品、洗涤、医药、制革以及饲料等行业有广泛用途，其销售额占全球酶制剂的60％以上。

蛋白酶按其酶解最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的最适pH大多在9.5-10.5。碱性蛋白酶除了可以水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键以及转酯和转肽的能力，应用潜力巨大。按照不同来源，蛋白酶还可分为植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物蛋白酶，其中微生物源蛋白酶提取自细菌、放线菌或真菌类微生物，种类多样，且可采用工业化发酵生产，不受资源、环境和空间的限制，稳定可控，具有动物源蛋白酶和植物源蛋白酶所不可比拟的优越性。

由于蛋白酶高效的生物活性功能，研究人员一直以来十分注重发现和挖掘新型蛋白酶资源，丰富蛋白酶种类。不同产酶微生物赋予所产蛋白酶不同的酶学特性，有助于增加对不同蛋白酶资源的认识。公开号为CN103865865A的专利公开一种海参肠道产碱性蛋白酶菌株，但是二价金属离子对该菌株所产碱性蛋白酶的活性具有抑制作用，限制了该碱性蛋白酶的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种二价金属离子如Mg²⁺、Mn²⁺对碱性蛋白酶活性具有提升作用的产碱性蛋白酶菌株及所产碱性蛋白酶。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

一株产碱性蛋白酶菌株，所述菌株为柯赫芽孢杆菌(Bacillus kochii)，所述菌株的保藏日期为2020年6月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉市八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020180。

有益效果：本发明中的菌株可以高效产碱性蛋白酶，所产碱性蛋白酶在55℃活性达到最高，在pH 10-11时酶活性最高，二价金属阳离子中Mg²⁺、Mn²⁺对酶活有正向提升作用，一价金属阳离子不影响碱性蛋白酶的活性。

优选地，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述菌株所产碱性蛋白酶。

有益效果：所产碱性蛋白酶在55℃活性达到最高，在pH 10-11时酶活性最高，二价阳离子中Mg²⁺、Mn²⁺对酶活有正向提升作用。

优选地，往碱性蛋白酶中加入二价金属阳离子、一价金属阳离子或变性剂SDS。

有益效果：添加二价金属阳离子提高碱性蛋白酶的活性，添加一价金属阳离子不影响碱性蛋白酶的活性，变性剂SDS在低浓度时对酶活无抑制作用。

优选地，所述二价金属阳离子包括Mg²⁺、Mn²⁺。

优选地，所述Mg²⁺的终浓度为1-10mM，所述Mn²⁺的终浓度为5mM。

优选地，所述变性剂SDS的浓度小于等于5mM。

优选地，所述一价金属阳离子包括Li⁺、Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺。

优选地，调节碱性蛋白酶的pH值为10-11，温度为50-55℃。

有益效果：本发明所产碱性蛋白酶活性在该条件下活性较强。

本发明还提供上述菌株生产碱性蛋白酶的方法，包括以下步骤：将菌株接种于培养基，于30-32℃发酵培养16-20h。

有益效果：发酵培养16-20h时，蛋白酶酶活和生物量最高，积累量达到最大，随着时间延长，逐步下降。

本发明的优点在于：本发明中的菌株可以高效产碱性蛋白酶，所产碱性蛋白酶在55℃活性达到最高，在pH 10-11时酶活性最高，二价阳离子中Mg²⁺、Mn²⁺对酶活有正向提升作用。

所产碱性蛋白酶在55℃活性达到最高，在pH 10-11时酶活性最高，二价阳离子中Mg²⁺、Mn²⁺对酶活有正向提升作用。

发酵培养16-20h时，蛋白酶酶活和生物量最高，积累量达到最大，随着时间延长，逐步下降。

附图说明

图1为本发明实施例1中菌株P140的蛋白酶解透明圈；

图2为本发明实施例1中菌株P140的菌落形态；

图3为本发明实施例1中菌株P140的显微观察照片(1000X)

图4为本发明实施例1中菌株P140基于16S rRNA基因序列比对结果构建的系统发育树；

图5为本发明实施例2中菌株P140液体发酵产蛋白酶曲线；

图6为本发明实施例3中菌株P140产蛋白酶的最适温度；

图7为本发明实施例3中菌株P140产蛋白酶的温度稳定性；

图8为本发明实施例4中菌株P140产蛋白酶的最适pH；

图9为本发明实施例4中菌株P140产蛋白酶的pH稳定性；

图10为本发明实施例5中金属离子及变性剂对菌株P140产蛋白酶酶活的影响；

图11为本发明实施例5中Mg²⁺浓度对菌株P140产蛋白酶酶活的影响；

图12为本发明实施例5中Mn²⁺浓度对菌株P140产蛋白酶酶活的影响；

图13为本发明实施例5中SDS浓度对菌株P140产蛋白酶酶活的影响。

柯赫芽孢杆菌(Bacillus kochii)，所述菌株的保藏日期为2020年6月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉市八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020180。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

(一)柯赫芽孢杆菌(Bacillus kochii)CCTCC M 2020180的分离筛选用于培养和筛选的培养基：

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉20g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

富集培养基(LB培养基)：蛋白胨10g，酵母浸出汁5g，氯化钠10g，水1000mL，pH7.5。

酪蛋白琼脂培养基：干酪素0.4％，磷酸二氢钾0.036％，七水合硫酸镁0.05％，氯化锌0.0014％，七水合磷酸氢二钠0.107％，氯化钠0.016％，氯化钙0.0002％，Trypticase0.005％，琼脂2％，pH 6.5-7.0。

产酶发酵培养基：葡萄糖2g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，七水合硫酸镁0.2g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

取样与富集培养：选择小麦、玉米或黄豆秸秆田间堆场，铲取秸秆堆最下层与土壤接触部分的腐积层样品于无菌样品袋中，完成取样。在实验室中分别称取2g秸秆腐积层样品，加10ml无菌水分散均匀，取1mL分散液加入50mL/250mL富集培养基中，32℃，150rpm，培养24h。

初筛：取培养好的富集培养液1mL，用无菌水梯度稀释至10^-7，每个稀释度取0.5mL稀释液涂布酪蛋白筛选培养基平板，32℃倒置培养24-48小时后，挑取有水解透明圈单菌落。

分离纯化：挑取上述单菌落在酪蛋白筛选培养基上连续划线分离三次，获得纯培养物。挑取生长迅速、水解透明圈大而明显的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基试管斜面，斜面菌株成熟后于4℃冰箱中保藏。

摇瓶发酵复筛：将上述保藏菌株接种于种子培养基(同发酵培养基)，经32℃，150rpm，培养活化12h后按6％接种量接种于发酵培养基中，32℃，180rpm培养24-72h。发酵液8000rpm离心15min后取上清液，即为粗酶液。

采用福林酚试剂显色法测定其蛋白酶活力，筛出蛋白酶活较高的菌株，命名为菌株P140，菌株P140的蛋白酶解透明圈和菌落形态如图1和图2所示，菌株P140的显微镜照片如图3所示，可以看出，该产蛋白酶菌株为革兰氏阳性杆菌，菌落为光滑湿润、边缘半透明有分枝、乳白色，在酪蛋白筛选平板上有明显的透明水解圈。

(二)菌株P140的鉴定

菌株提取DNA：

1、选择新鲜的CCTCC M 2020180斜面培养物，用巴氏管向其中加入约1ml双蒸水(ddH₂O)，刮取少量菌体至1.5mL的EP管中，12000rpm离心2min，去上清；

2、加入1mLddH₂O重悬，12000rpm离心2min，去上清；

3、重复步骤2；

4、向1.5MLEP管中加入适量(200ul)ddH₂O，加入玻璃珠，震荡破碎1min，然后将EP管放入沸水中煮沸10min；

5、将EP管置于冷水中冷却；

6、取出EP管，12000rpm离心2min，取上清作PCR模板备用。

PCR反应：模板DNA 2μL；引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)各1μL；Ex Taq聚合酶25μL；ddH₂O 21μL。PCR扩增反应条件：94℃ 10min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，34个循环；72℃ 10min，10℃∞。测定16SrRNA基因片段长度为1446bp，如SEQ ID NO.1所示，如图4所示，测序结果与GeneBank中序列进行比对分析，以Clostridium butyricum VPI3266(AJ458420.1)为外枝构建了Neighbor-Joining系统发育树，与Bacillus kochii WCC4582(FN995265)基因序列相似性达到99.79％。结合菌株形态以及生理生化特征，CCTCC M 2020180菌株鉴定为科赫芽孢杆菌(Bacillus kochii)。

实施例2

菌株P140液体发酵产蛋白酶

测定方法：将菌株P140按6％的接种量接种于产酶发酵培养基，在32℃，180rpm条件下进行液体发酵，0-72h生长期内定时取样测定分析胞外蛋白酶活性、生物量(发酵液适当稀释后测光密度OD₆₀₀)以及pH值随培养时间的变化趋势。

测定结果：如图5所示，在16-20h时，蛋白酶酶活和生物量最高，酶活达到最大12U，随着时间延长，逐步下降。培养过程中pH值保持相对稳定，在8左右。

实施例3

菌株P140所产蛋白酶的酶学性质

测定方法：将菌株P140所产蛋白酶在30℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，70℃，80℃不同温度条件下进行酶活检测，酶活检测采用福林酚试剂显色法测定。

菌株P140所产蛋白酶在30℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，70℃，80℃不同温度孵育条件下，0-60min范围内每隔10min取样进行酶活分析，分析其对不同反应温度的耐受性。

测定结果：如图6所示，酶活开始随着反应温度的提高而提高，在55℃时相对酶活达到最高，随后开始下降，其反应最适温度为55℃。

图7结果表明，其在40℃反应温度以下，随着孵育时间的延长，相对酶活基本保持稳定。在45℃以上，随着孵育时间的增加，相对酶活逐步下降，55℃以上酶活下降较快。

实施例4

菌株P140所产蛋白酶的pH耐受性

测定方法：菌株P140所产蛋白酶在4，5，6，7，8，9，10，11不同pH条件下进行酶活检测，并在30℃保温1h后按照酶活测定方法进行酶活检测。

测定结果：如图8所示，在碱性条件下保持较高活性，在pH 10-11时酶活性最高。尤其是pH值为11时酶活稳定性最高，而在酸性条件下不稳定，酶活快速下降(图9)。

实施例5

一价和二价金属阳离子以及蛋白变性剂SDS(十二烷基磺酸钠)对菌株P140产蛋白酶酶活的影响

测定方法：在菌株P140产蛋白酶液中分别添加一价金属阳离子Li⁺、Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、二价金属阳离子Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺以及变性剂SDS，考察其对P140蛋白酶酶活的影响，金属离子在反应体系中的终浓度为1mM、5mM、10mM，SDS在反应体系中的终浓度为5mM、10mM、15mM、20mM，按照酶活测定方法进行酶活检测。

测定结果：如图10-图13所示，在添加终浓度为5mM时，二价阳离子中Mg²⁺、Mn ²⁺对酶活有正向提升作用，而Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺对酶活有抑制作用，Li⁺、Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺等一价阳离子对酶活几乎没影响，变性剂SDS在5mM低浓度时对酶活无抑制作用，而在15mM浓度以上则明显抑制酶活性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院合肥物质科学研究院

<120> 一株产碱性蛋白酶菌株、所产碱性蛋白酶及方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcggcgtgct atacatgcaa gtcgagcgaa tctgagggag cttgctccca aagattagcg 60

gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120

cggggctaat accggataat atctatttat acatataatt agattgaaag atggttctgc 180

tatcacttac agatgggccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240

gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc 360

aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttag ggaagaacaa 420

gtatcggagt aactgccggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540

cgcgcgcagg cggttcctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca 600

ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccaagtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atttggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtaactgacg 720

ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780

acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgcagcaa acgcattaag 840

cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960

catcctctga caatcctaga gataggactt tccccttcgg gggacagagt gacaggtggt 1020

gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

ccttgatctt agttgccagc atttagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200

ctacaatgga tggtacaaag ggctgcaaga ccgcgaggtt tagccaatcc cataaaacca 1260

ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gccggaatcg ctagtaatcg 1320

cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380

cgagagtttg taacacccga agtcggtggg gtaacctttt ggagccagcc gcctaaggta 1440

cagaat 1446

Claims (3)

1. 一株产碱性蛋白酶菌株，其特征在于：所述菌株为柯赫芽孢杆菌（Bacillus  kochii），所述菌株的保藏日期为2020年6月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉市八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020180。

2. 根据权利要求1所述的产碱性蛋白酶菌株，其特征在于：所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.采用权利要求1所述的菌株生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：将菌株接种于培养基，于30-32℃发酵培养16-20h。

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