CN108587978A - 一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

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Abstract

一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018211。该菌株具有高耐碱性可在pH值为13.0、温度为68℃和10％NaCl的多重胁迫条件下生长，最佳产碱性蛋白酶环境pH值为11.0。

Description

一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌。
背景技术
蛋白酶指能够水解蛋白质肽链的一类酶的总称。根据蛋白酶降解多肽的方式不同，可将其分为内肽酶和端肽酶。内肽酶能够将大分子量的多肽链从中间切断，进而形成分子量较小的朊和胨；端肽酶分为羧肽酶和氨肽酶，它们能够分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。按其反应的最适pH值，可将蛋白酶分为酸性、中性和碱性蛋白酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶是一种重要的工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，已广泛应用于皮革、食品、医药、环境治理等方面。
在污水生物处理的过程中，会产生大量的污泥，污泥中含有许多难被分解的大分子有机物，如难分解的蛋白质，通常需要利用机械破碎、超声破碎或发酵等方式，才能使污泥中的这些大分子有机物从细胞中释放出来。污泥碱性发酵是将污泥厌氧消化过程与碱预处理方法相结合，有效地将污泥中的内碳源以挥发性脂肪酸的形式累积，进而实现污泥的资源化利用。
发明内容
本发明提供了一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，该菌株具有高耐碱性可在pH值为13.0、温度为68℃和10％NaCl的多重胁迫条件下生长，最佳产碱性蛋白酶环境pH值为11.0。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101为革兰氏阳性菌，菌株个体呈直杆状，长为3.09～3.48μm，宽为0.90～1.21μm，常以成对或链状排列，具圆端，周生鞭毛；枯草芽孢杆菌DFSW101菌落形状不规则，边缘呈锯齿形，灰白色，菌落扁平，无光泽，表面有皱褶，不透明，不易挑起。
本发明枯草芽孢杆菌DFSW101无荚膜，每一个细胞产一个芽孢，芽孢位于菌体近中央，芽孢呈椭圆或卵圆，芽孢形成后菌体略膨大，如图1所示。
本发明枯草芽孢杆菌DFSW101好氧，葡萄糖发酵为阳性、蔗糖发酵为阳性、乳糖发酵为阳性、果糖发酵为阳性、纤维二糖发酵为阳性、鼠李糖发酵为阴性、麦芽糖发酵为阳性、D-木糖发酵为阴性、山梨醇发酵为阳性、甘露醇发酵为阳性、L-阿拉伯糖发酵为阳性、柠檬酸盐利用试验为阳性、甲基红试验为阴性、V-P试验为阳性、硝酸盐还原试验为阳性、亚硝酸盐还原试验为阳性、淀粉水解试验为阳性、明胶液化试验为阳性、产氨试验为阳性、生长温度68℃试验为阳性、质量浓度2％的NaCl耐盐性试验为阳性、质量浓度3％的NaCl耐盐性试验为阳性、质量浓度7％的NaCl耐盐性试验为阳性、质量浓度10％的NaCl耐盐性试验为阳性、pH 8.0～13的NaOH耐碱试验为阳性。
产酶液体培养基(由40g葡萄糖、20g蛋白胨、1.4g磷酸氢二钠、0.6g氯化钙、0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成，pH值为11.0，121℃灭菌20min)中投加枯草芽孢杆菌DFSW101，然后在130r/min、28～52℃条件下发酵培养至枯草芽孢杆菌DFSW101菌数浓度达到1×107～1×108cfu/mL，发酵液中碱性蛋白酶的酶活力可达1940U/mL以上。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101属于芽孢杆菌属(Bacillus)；保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC No:M2018211，保藏日期为2018年4月16日。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌DFSW101菌株形态透射电镜图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101保藏号为CCTCC No:M 2018211。
本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101采用传统微生物分离纯化方法从哈尔滨太平污水处理厂的剩余污泥中经碱性发酵后分离筛选得到。经16S rDNA序列Genbank比对，并结合菌株、菌落形态、生理生化指标，判定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。16S rDNA比对结果如表1所示。
表1
本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101能在10℃～68℃环境中生长，最适生长温度为28～52℃，最佳产碱性蛋白酶温度为32℃。
本实施方式枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101可在pH值5.0～13.0条件下生长，最佳产碱性蛋白酶环境pH值为11.0。
具体实施方式二：本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、20g蛋白胨、1.4g磷酸氢二钠、0.6g氯化钙、0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成，pH值为11.0，121℃灭菌20min)中投加5％的枯草芽孢杆菌DFSW101，然后在130r/min、28℃条件下发酵培养至菌数浓度达到1×107～1×108cfu/mL。
采用Folin试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力：在pH值为11.0、30℃条件下，以1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。
本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为1940U/mL。
具体实施方式三：本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、20g蛋白胨、1.4g磷酸氢二钠、0.6g氯化钙、0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成，pH值为11.0，121℃灭菌20min)中投加5％的枯草芽孢杆菌DFSW101，然后在130r/min、52℃条件下发酵培养至菌数浓度达到1×107～1×108cfu/mL。
采用Folin试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力：在pH值为11.0、30℃条件下，以1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。
本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为1980U/mL。
具体实施方式四：本实施方式产酶液体培养基(由40g葡萄糖、20g蛋白胨、1.4g磷酸氢二钠、0.6g氯化钙、0.4g硫酸镁和1000mL蒸馏水组成，pH值为11.0，121℃灭菌20min)中5％的枯草芽孢杆菌DFSW101，然后在130r/min、32℃条件下发酵培养至菌数浓度达到1×107～1×108cfu/mL。
本实施方式枯草芽孢杆菌DFSW101发酵菌数浓度达到1×107～1×108cfu/mL一般需48h。
采用Folin试剂显色法测定碱性蛋白酶的酶活力：在pH值为11.0、30℃条件下，以1mL发酵液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位。
本实施方式发酵液中碱性蛋白酶的酶活力为2400U/mL。
实施例1
用2mol/L的NaOH溶液将3.5L污水处理厂剩余污泥pH值调节至11.0后，平均分配到2组(实验组和对照组)反应瓶(1L锥形瓶)中，保证污泥性质、质量浓度及颗粒大小一致。实验组按5％接菌量接种枯草芽孢杆菌DFSW101，对照组加同样体积的无菌水以保证污泥质量浓度一致；每种处理3个平行重复，130r/min、32℃振荡器内发酵，每6h使用2mol/L的NaOH溶液调节各反应瓶内pH值1次，保证pH值稳定在11.0±0.3。每24h取各反应瓶中发酵污泥10mL，10000r/min离心后立即将上清液用细菌滤器过滤，测定上清液中VFAs(挥发性脂肪酸)含量。
实验组剩余污泥在碱性发酵第6天VFAs含量达到最高值，而对照组剩余污泥在碱性发酵第10天VFAs含量才达到最高值。实验组VFAs含量最高值为对照组VFAs含量最高值的1.52倍。

Claims (1)

1.一株产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DFSW101保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018211。
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