CN109400760B - 一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用环糊精水解酶纯化γ‑环糊精的方法,属于环糊精加工技术领域。本发明以淀粉或糊精为底物,用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液,加入一定量以γ‑CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,灭酶;以上述反应液为底物,向其中加入一定量的环糊精水解酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后灭酶。本发明利用了一种对环糊精具有选择降解能力的环糊精水解酶,利用其对于α‑CD和β‑CD具有较高的降解能力,而对γ‑CD具有较弱的降解能力,选择性的除去α‑CD和β‑CD,保留γ‑CD,从而提高γ‑CD的纯度。本发明突破了以往工业上大多采用有机溶剂沉淀的方法,采用酶法纯化γ‑环糊精的方法,操作简单,绿色环保,在环糊精加工领域具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,特别涉及一种在环糊精葡萄糖转移酶(CGTase)生产环糊精过程中的γ-环糊精(γ-CD)的纯化方法,属于环糊精加工技术领域。
背景技术
环糊精(Cyclodextrin,简称CD)是淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的作用下生成的一系列环状低聚糖的总称,通常含有6~12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有重要实际意义的是由α-1,4糖苷键连接的6、7、8个葡萄糖单元的分子,分别称为α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)。
天然的β-CD是目前工业生产中应用的最为广泛的环糊精。目前,β-CD占全球环糊精产量的约70%,α-CD占约15%,而γ-CD仅占约5%,其余约10%的CD产量是各种CD的衍生品。β-CD的价格由于易于分离和纯化而显著降低,而生产α-CD和γ-CD的价格却仍然比较昂贵,这主要是因为α-CD和γ-CD的生产和分离纯化的难度很高。与α-CD和β-CD相比,γ-CD具有更大的疏水腔,更高的水溶性和更有利的生物利用度,使其能够与更大的分子形成不溶性复合物并改善活性物质的溶解度。因此,在食品,化妆品和制药工业中对γ-CD的需求不断增长。然而,由于其低产量和高生产成本,尽管市场需求很大,γ-CD的应用仍然有限。
目前,提高γ-CD产量的方法主要集中在筛选产物特异性更高的γ-CGTase,以及对现有的γ-CGTase进行基因改造以获得更高产量的γ-CD。尽管通过上述手段一定程度提高了γ-CD的所占比例,CGTase作用淀粉的生产产物中仍有较高比例的α-CD、β-CD存在。现阶段,在工业上多是通过“溶剂法”来解决不同CD的分离纯化,即添加有机溶剂作为络合剂,选择性的提取目标CD。如使用1-丁醇可以使α-CD沉淀比例大幅提高。然而,这种溶剂方法也相对昂贵,易燃且有毒。而且,溶剂的高沸点不利于形成的分子的回收。针对以上存在的问题,寻找一种绿色高效的方法来纯化γ-CD是十分重要的。本发明利用对α-CD、β-CD具有高度选择性降解能力,而对γ-CD降解能力较弱的环糊精水解酶来辅助CD生产过程中γ-CD的分离纯化。酶法降解,绿色高效,具有“溶剂法”不可替代的优势。同时,本发明也为环糊精水解酶,这类新兴的多功能淀粉酶拓展了应用面。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明提供了一种利用环糊精水解酶纯化γ-CD的方法。本发明方法操作简单,绿色环保,通过环糊精水解酶对不同的环糊精的选择性降解能力,来除去α-CD和β-CD,从而提高γ-CD的纯度。
本发明的技术方案,一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其以淀粉糊精为底物,用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液,加入一定量以γ-CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,灭酶;以上述反应液为底物,向其中加入一定量的环糊精水解酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后灭酶。
进一步的,所述环糊精葡萄糖基转移酶为CGTase,其以γ-CD为产物;具体包括以γ-CD为主产物的γ-CGTase和产物中含有不同比例的γ-CD的α-CGTase,β-CGTase。
进一步的,所述环糊精水解酶在GenBank中的编号为WP_048164969.1。
进一步的,所述糊精具体为麦芽糊精,干糊精或环糊精。
进一步的,所述淀粉具体为玉米淀粉,高直链玉米淀粉,蜡质玉米淀粉,马铃薯淀粉,木薯淀粉,红薯淀粉,豌豆淀粉,小麦淀粉,大米淀粉,绿豆淀粉,红豆淀粉,莲子淀粉或栗子淀粉等。
进一步的,所述所配置的缓冲溶液浓度为10-200 mM、pH为4-10。
进一步的,所述所用的底物溶液质量/体积浓度为1%-30%。
进一步的,所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.1-50U,控制反应温度为40-80℃,反应时间为1-48h。
进一步的,所用的环糊精水解酶的添加量为0.1-50U,反应温度为50-100℃,反应时间为1-24h。
本发明的有益效果:本发明利用了一种对环糊精具有选择降解能力的环糊精水解酶,利用其对于α-CD和β-CD具有较高的降解能力,而对γ-CD具有较弱的降解能力,选择性的除去α-CD和β-CD,保留γ-CD,从而提高γ-CD的纯度。本发明突破了以往工业上大多采用有机溶剂沉淀的方法,采用酶法纯化γ-环糊精的方法,操作简单,绿色环保,在环糊精加工领域具有良好的应用潜力。
附图说明
图1是本发明实施例4中终产物的高效液相图谱。1、反应5min时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱,2、反应5h时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱,3反应10h时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱(最终只剩余γ-CD)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明进行具体描述。
实施例1
用20mM、pH=6.0的磷酸缓冲液配置2%(w/v)DE13-17的麦芽糊精溶液5 mL,加入0.8U的CGTase,在60℃条件下,反应8h,沸水灭活30min。以上述反应液作为底物,加入0.5U环糊精水解酶,在80℃条件下反应1h,反应结束后,沸水灭活1.5h。
实施例2
用50mM、pH=6.5的10 %(w/v)可溶性淀粉溶液10mL,预糊化处理,加入5U的CGTase,在50℃条件下,反应16h,沸水灭活30min。以上述反应液作为底物,加入2.1U环糊精水解酶,在70℃条件下反应4h,反应结束后,用5mL 的0.4M NaOH灭活,用0.4 M 盐酸溶液中和。
实施例3
用50mM、pH=7.5 的5 %(w/v)可溶性淀粉溶液30mL,预糊化处理,加入11.7U的CGTase,在50℃条件下,反应24h,沸水灭活30min。以上述反应液作为底物,加入5.3U环糊精水解酶,在65℃条件下反应12h,反应结束后,用15mL的1M NaOH灭活,用1M盐酸将溶液中和。
实施例4
用20mM、pH=5.5的磷酸缓冲液配置1%(w/v)DE4-7麦芽糊精溶液5mL,加入0.67U的CGTase,在60℃条件下,反应10h,沸水灭活30min。以上述反应液作为底物,加入0.5U环糊精水解酶,在75℃条件下反应,分别反应5min,5h,10h反应结束后,用2.5mL、0.1M NaOH将酶灭活,用0.1M 盐酸将溶液中和。使用高效液相色谱法检测上述不同反应时间下的产物,得到的结果如图1所示。
由图1结果可以看出,随着环糊精水解酶水解时间从5min延长到10h,CGTase反应的产物由α-CD,β-CD和γ-CD的混合物,到最终只剩余γ-CD,使得γ-CD得到纯化。
Claims (8)
1.一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:其以淀粉或糊精为底物,用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液,加入一定量以γ-CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,灭酶;以上述反应液为底物,向其中加入一定量的环糊精水解酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后灭酶;
所述环糊精葡萄糖基转移酶为CGTase,其以γ-CD为产物;具体包括以γ-CD为主产物的γ-CGTase和产物中含有不同比例的γ-CD的α-CGTase,β-CGTase;
所述环糊精水解酶在GenBank中的编号为WP_048164969.1。
2.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所述糊精具体为麦芽糊精或环糊精。
3.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所述淀粉具体为玉米淀粉,马铃薯淀粉,木薯淀粉,红薯淀粉,豌豆淀粉,小麦淀粉,大米淀粉,绿豆淀粉,红豆淀粉,莲子淀粉或栗子淀粉。
4.如权利要求3所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所述玉米淀粉具体为高直链玉米淀粉或蜡质玉米淀粉。
5.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所述缓冲溶液浓度为10-200 mM、pH为4-10。
6.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所述底物溶液质量/体积浓度为1%-30%。
7.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所用环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.1-50U,控制反应温度为40-80℃,反应时间为1-48h。
8.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法,其特征在于:所用的环糊精水解酶的添加量为0.1-50U,反应温度为50-100℃,反应时间为1-24h。
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