CN109400760A - 一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用环糊精水解酶纯化γ‑环糊精的方法，属于环糊精加工技术领域。本发明以淀粉或糊精为底物，用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液，加入一定量以γ‑CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，灭酶；以上述反应液为底物，向其中加入一定量的环糊精水解酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后灭酶。本发明利用了一种对环糊精具有选择降解能力的环糊精水解酶，利用其对于α‑CD和β‑CD具有较高的降解能力，而对γ‑CD具有较弱的降解能力，选择性的除去α‑CD和β‑CD，保留γ‑CD，从而提高γ‑CD的纯度。本发明突破了以往工业上大多采用有机溶剂沉淀的方法，采用酶法纯化γ‑环糊精的方法，操作简单，绿色环保，在环糊精加工领域具有良好的应用潜力。

Description

一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法
技术领域
本发明涉及一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，特别涉及一种在环糊精葡萄糖转移酶（CGTase）生产环糊精过程中的γ-环糊精（γ-CD）的纯化方法，属于环糊精加工技术领域。
背景技术
环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6~12个D-吡喃葡萄糖单元。其中研究得较多并且具有重要实际意义的是由α-1,4糖苷键连接的6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）和γ-环糊精（γ-CD）。
天然的β-CD是目前工业生产中应用的最为广泛的环糊精。目前，β-CD占全球环糊精产量的约70％，α-CD占约15％，而γ-CD仅占约5％，其余约10％的CD产量是各种CD的衍生品。β-CD的价格由于易于分离和纯化而显著降低，而生产α-CD和γ-CD的价格却仍然比较昂贵，这主要是因为α-CD和γ-CD的生产和分离纯化的难度很高。与α-CD和β-CD相比，γ-CD具有更大的疏水腔，更高的水溶性和更有利的生物利用度，使其能够与更大的分子形成不溶性复合物并改善活性物质的溶解度。因此，在食品，化妆品和制药工业中对γ-CD的需求不断增长。然而，由于其低产量和高生产成本，尽管市场需求很大，γ-CD的应用仍然有限。
目前，提高γ-CD产量的方法主要集中在筛选产物特异性更高的γ-CGTase,以及对现有的γ-CGTase进行基因改造以获得更高产量的γ-CD。尽管通过上述手段一定程度提高了γ-CD的所占比例，CGTase作用淀粉的生产产物中仍有较高比例的α-CD、β-CD存在。现阶段，在工业上多是通过“溶剂法”来解决不同CD的分离纯化，即添加有机溶剂作为络合剂，选择性的提取目标CD。如使用1-丁醇可以使α-CD沉淀比例大幅提高。然而，这种溶剂方法也相对昂贵，易燃且有毒。而且，溶剂的高沸点不利于形成的分子的回收。针对以上存在的问题，寻找一种绿色高效的方法来纯化γ-CD是十分重要的。本发明利用对α-CD、β-CD具有高度选择性降解能力，而对γ-CD降解能力较弱的环糊精水解酶来辅助CD生产过程中γ-CD的分离纯化。酶法降解，绿色高效，具有“溶剂法”不可替代的优势。同时，本发明也为环糊精水解酶，这类新兴的多功能淀粉酶拓展了应用面。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种利用环糊精水解酶纯化γ-CD的方法。本发明方法操作简单，绿色环保，通过环糊精水解酶对不同的环糊精的选择性降解能力，来除去α-CD和β-CD，从而提高γ-CD的纯度。
本发明的技术方案，一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其以淀粉糊精为底物，用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液，加入一定量以γ-CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，灭酶；以上述反应液为底物，向其中加入一定量的环糊精水解酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后灭酶。
进一步的，所述环糊精葡萄糖基转移酶为CGTase，其以γ-CD为产物；具体包括以γ-CD为主产物的γ-CGTase和产物中含有不同比例的γ-CD的α-CGTase，β-CGTase。
进一步的，所述环糊精水解酶在GenBank中的编号为WP_048164969.1。
进一步的，所述糊精具体为麦芽糊精，干糊精或环糊精。
进一步的，所述淀粉具体为玉米淀粉，高直链玉米淀粉，蜡质玉米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉，红薯淀粉，豌豆淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，绿豆淀粉，红豆淀粉，莲子淀粉或栗子淀粉等。
进一步的，所述所配置的缓冲溶液浓度为10-200 mM、pH为4-10。
进一步的，所述所用的底物溶液质量/体积浓度为1%-30%。
进一步的，所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.1-50U，控制反应温度为40-80℃，反应时间为1-48h。
进一步的，所用的环糊精水解酶的添加量为0.1-50U，反应温度为50-100℃，反应时间为1-24h。
本发明的有益效果：本发明利用了一种对环糊精具有选择降解能力的环糊精水解酶，利用其对于α-CD和β-CD具有较高的降解能力，而对γ-CD具有较弱的降解能力，选择性的除去α-CD和β-CD，保留γ-CD，从而提高γ-CD的纯度。本发明突破了以往工业上大多采用有机溶剂沉淀的方法，采用酶法纯化γ-环糊精的方法，操作简单，绿色环保，在环糊精加工领域具有良好的应用潜力。
附图说明
图1是本发明实施例4中终产物的高效液相图谱。1、反应5min时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱，2、反应5h时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱，3反应10h时的α-CD、β-CD、γ-CD的峰谱（最终只剩余γ-CD）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
用20mM、pH=6.0的磷酸缓冲液配置2%（w/v）DE13-17的麦芽糊精溶液5 mL，加入0.8U的CGTase，在60℃条件下，反应8h，沸水灭活30min。以上述反应液作为底物，加入0.5U环糊精水解酶，在80℃条件下反应1h，反应结束后，沸水灭活1.5h。
实施例2
用50mM、pH=6.5的10 %（w/v）可溶性淀粉溶液10mL，预糊化处理，加入5U的CGTase，在50℃条件下，反应16h，沸水灭活30min。以上述反应液作为底物，加入2.1U环糊精水解酶，在70℃条件下反应4h，反应结束后，用5mL 的0.4M NaOH灭活，用0.4 M 盐酸溶液中和。
实施例3
用50mM、pH=7.5 的5 %（w/v）可溶性淀粉溶液30mL，预糊化处理，加入11.7U的CGTase，在50℃条件下，反应24h，沸水灭活30min。以上述反应液作为底物，加入5.3U环糊精水解酶，在65℃条件下反应12h，反应结束后，用15mL的1M NaOH灭活，用1M盐酸将溶液中和。
实施例4
用20mM、pH=5.5的磷酸缓冲液配置1%（w/v）DE4-7麦芽糊精溶液5mL，加入0.67U的CGTase，在60℃条件下，反应10h，沸水灭活30min。以上述反应液作为底物，加入0.5U环糊精水解酶，在75℃条件下反应，分别反应5min，5h，10h反应结束后，用2.5mL、0.1M NaOH将酶灭活，用0.1M 盐酸将溶液中和。使用高效液相色谱法检测上述不同反应时间下的产物，得到的结果如图1所示。
由图1结果可以看出，随着环糊精水解酶水解时间从5min延长到10h，CGTase反应的产物由α-CD，β-CD和γ-CD的混合物，到最终只剩余γ-CD，使得γ-CD得到纯化。

Claims (9)

1.一种利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：其以淀粉或糊精为底物，用缓冲溶液配置一定浓度的底物溶液，加入一定量以γ-CD为产物的环糊精葡萄糖基转移酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，灭酶；以上述反应液为底物，向其中加入一定量的环糊精水解酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后灭酶。
2.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述环糊精葡萄糖基转移酶为CGTase，其以γ-CD为产物；具体包括以γ-CD为主产物的γ-CGTase和产物中含有不同比例的γ-CD的α-CGTase，β-CGTase。
3.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述环糊精水解酶在GenBank中的编号为WP_048164969.1。
4.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述糊精具体为麦芽糊精、干糊精或环糊精。
5.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述淀粉具体为玉米淀粉，高直链玉米淀粉，蜡质玉米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉，红薯淀粉，豌豆淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，绿豆淀粉，红豆淀粉，莲子淀粉或栗子淀粉。
6.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述所配置的缓冲溶液浓度为10-200 mM、pH为4-10。
7.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所述所用的底物溶液质量/体积浓度为1%-30%。
8.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所用环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.1-50U，控制反应温度为40-80℃，反应时间为1-48h。
9.如权利要求1所述利用环糊精水解酶纯化γ-环糊精的方法，其特征在于：所用的环糊精水解酶的添加量为0.1-50U，反应温度为50-100℃，反应时间为1-24h。
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