JPH07504804A - シクロデキストリン生成量の増加方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シフロブキス）　ＩＪン生成量の増加方法本発明は、シクロデキストリンに係り 、特にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎから得られたシクロデキストリングル コシルトランスフェラーゼと呼ばれるアミラーゼを用いてα−およびβ−シクロ デキストリンの生成量を増加させる方法に関する。

アミラーゼは、澱粉を構成する２種類のグルコースポリマーであるアミロースお よびアミロペクチンにおけるα１，４結合の加水分解作用を触媒することができ る酵素である。アミラーゼは広範な植物、細菌、および動物により生成されるも のである。

シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓａ）は、シクロ アミロースグルカノトランスフェラーゼとも呼ばれ、１９３９年にＴｉ１ｄｅｎ およびＨｕｄｓＳ、にＩｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢａｃ ｉｌｌｕｓ種（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ、　１９７４年７月３０日に発行され た米国特許第３．１３２６．７１５号を参照。）から得られている。ＣＧＴａｓ ｅはシクロデキストリンを形成する機能があることで知られている。

シクロデキストリンは、シャーデインガ（Ｓｃｈａｒｄ　ｉｎｇｅｒ）デキスト リンともよばれ、α１，４結合によりリング状またはトーラス状に結合された無 水グルコース単位から構成されている。リング中の無水グルコース単位の個数に よりシクロデキストリンの名前が決定される。α−シクロデキストリンは６個の 無水グルコース単位を有するが、β−シクロデキストリンは７個の無水グルコー ス単位を有し、またＴ−シクロデキストリンは８個の無水グルコース単位を有す る。無水グルコース単位が、α１．４結合以外の結合によりリングに結合され、 またリング自身を構成しないときは、シクロデキストリンは分岐シクロデキスト リンと呼ばれ、−これが他の化合物と複合物を形成する機能を有することから多 くの分野で各種の用途に用いられている。

従来、シクロデキストリンは、澱粉またはＤＥ値が１とｌＯの間の澱粉氷解物な どの澱粉基質に対してＣＧＴａｓｅを作用させることにより生成している。加水 分解反応は酵素に対して最適のＰＨと温度で行われるのが普通である。Ｂ、　ｍ ａｃｅｒａｎｓから得られたＣＧＴａｓｅの場合は、最適ｐＨは５と７の間にあ り、最適温度は５０℃と６０℃の間にある。

Ｂｏｍａｃｅｒａｎｓから得られたＣＧＴａｓｅを触媒として用いると、α−１ β−１Ｔ−シクロデキストリンが生成される。通常、α−シクロデキストリンの 量は約６３重量％であり、β−シクロデキストリンのｌが３０重量％、Ｔ−シク ロデキストリンの量は生成されたシクロデキストリンの全量の約７重量％である 。

反応媒体にある複合体を付加すると、反応の平衡点は、α−シクロデキストＩＪ ンが優勢に、またはβ−シクロデキストリンが優勢に生成されるようにシフトさ れることも知られている。例えば、１９７２年２月８日発行の米国特許第３．６ ４０゜８４７号には、温度が約５０℃、Ｉ＞Ｈが約７の１−デカノールが存在す ると、α−シクロデキストリンが優勢に生成されるが、トルエンが存在するメβ −シクロデキストリンが生成されることを開示している。この°８４７号特許に はさらに、澱粉基質が澱粉氷解物のときはシクロデキストリンはβ−シクロデキ ストリンを主として生成し、また基質がゲル化澱粉のときはα−およびβ−シク ロデキストリンの混合物を生成することが開示され、これらに関してはそれぞれ 例！およびＶに示しである。

Ｂ、　ｍａｃｅｒａｎｓから得られたＣＧＴａｓｅと澱粉基質の間の反応の平衡 が、反応が生じる温度を下げかつシクロヘキサンの存在下で反応を行わせること により、シフトされてより多くのシクロデキストリンおよび、α−およびβ−シ クロデキストリンのみを生成し、Ｔ−シクロデキストリンはほぼ生成されないこ とが見出されている。特に、澱粉基質をシフロブキス）　＋７ンの存在巾約４５ ℃およびそれ以下の温度でＢ、　ｍａｃｅｒａｎｓから得られたシクロデキスト リングルコシルトランスフェラーゼにより処理すると、生成されたシクロデキス トリンの量は、酵素に対する最適温度５０〜６０℃で生成されたシクロデキスト リンの量に比べて増加することも見出されている。

これは、従来の考え方が、反応が行われる温度を下げると、単に加水分解反応速 度が減少し、また全てのシクロデキストリンの生成量が減少するということであ ったことから驚くことであり、予測されないものである。生成されたシクロデキ ストリンの量が実際に増加するということは予測されないものでる。

また、Ｂ、　ｍａｃｅｒａｎｓはあるＴ−シクロデキストリンを通常生成するこ とが知られているので、実際にはγ−シクロデキストリンは生成されないという ことも驚くことである。

澱粉基質が澱粉氷解物であるときα−７クロデキストリンが生成されることも見 出されている。澱粉氷解物シクロデキストリンへの転換時にシクロヘキサンが存 在すると、α−シクロデキストリン産物が得られるという事実は、従来シクロへ ＋サンはα−シクロデキストリンの生成を促進するとは考えられていなかったこ とから驚くことである。

シクロデキストリンの生成を増加させる原因は、低温であることとシクロヘキサ ンおよびＢ、　ｅａａｃｅｒａｎｓ酵素の存在を組み合わせた結果であることが 見出されている。低温のみあるいはシクロヘキサンのみではシクロデキストリン の生成の増加は得られず、また低温とシクロヘキサンの他のＣＧＴａｓｅとの組 合せはシクロデキストリンの生成増加をもたらさない。

温度とシクロヘキサンの組合せによりシクロデキス）　ＩＪンの生成が増加する 理由は正確には知られていない。温度とシクロヘキサンは共に、溶液中の酵素の 構造に対して、シクロデキストリンの生成を増加させるように作用する効果を有 することが仮定されている。さらに、生成された個々のα−およびβ−シクロデ キストリンの量にシフトが存在する理由は理解されていない。現実にはαシクロ デキストリンの全体的な増加がある。

適切な澱粉基質はゲル化澱粉と澱粉氷解物を含有している。ベースの澱粉はトウ モロコシ、麦、ノヤガイモ、米、タピオカ、およびモロコシなどの野菜源から得 られ名。さらに、ワックス状コーン（アミロペクチンを多く含有）または高アミ ロースコーン（アミロースを多く含有）などの異なる多くのソースを用いること ができる。澱粉にはワクス状コーン澱粉が好適に用いられる。澱粉氷解物は、約 １と１０の間のデキストロース当量（ＤＥ）を、好適には約５のＤＥを有するべ きである。氷解物は粒状澱粉に対する酸または酵素の作用により得られる。好適 には、澱粉氷解物は、細菌のα−アミラーゼなどのα−アミラーゼのゲル化粒状 澱粉に対する作用により生成される。好適な澱粉氷解物としては、ＤＥ値が約５ のワクス状コーン澱粉から得られたワックス状澱粉氷解物が用いられる。

本発明に遺したシクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼはＢａｃｉｌ ｌｕｓリングルコシルトランスフェラーゼは市販されている。これらの酵素は約 ６０℃の温度で最良に作用することが報告されている。このような酵素は約４５ ℃以下の温度で良好に機能し、てα−シクロデキストリンを生成するということ は驚くことである。

本発明による好適なプロセスにおいては、澱粉氷解物は水中に溶解され、固形分 が５雪量％と４０重量％の間の澱粉基質の水溶液を形成する。この溶液がその全 重量に対して約３５重量％の固形分を有すると好適である。

澱粉基質を転換するために用いられるＣＧＴａｓｅの量は、Ｔｉ１ｄｅｎ−Ｈｕ ｄｓｏｎ手順（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ＋でのＢ、Ｂ、　Ｔｉ１ｄｅｎおよびＣ， Ｓ、　Ｈｕｄｓｏｎ、４３．　５２７−５４４．　１９４２）により従来測定さ れた酵素活性度に依存して変化する。ＣＧＴａｓｅは好適にはミリメートル当た り約６００〜７００　Ｔｉ１ｄｅｎ−Ｈｕｄｓｏｎ単位を含有している。

転換時の溶液のｐＨは、一般に約５〜８の範囲にあり、好適には約６．０〜６． ５の範囲にある。ｐＨの調整には従来の方法が用いられる。

転換時の温度は約４５℃以下に、好適には約１５〜約４０℃に維持される。約２ ０℃と約３５℃の間の温度で良好な結果が得られている。

シクロヘキサンは、約５〜約１０反応体積％の量で存在する。好適には、このシ クロへ＋サンは、シクロヘキサン添加前の全反応体積に対して約５体積％の量で 存在する。任意のシクロヘキサン源を用いることができる。

転換時間は約１日から約４日である。

シフ“ロデキストリングルコシルトランスフェラーゼによる澱粉基質の処理の後 、シクロデキストリンが回収される。シクロデキストリンは、好適には、溶液中 の非環式材料からのシクロデキストリン沈澱物を分離することにより回収される 。非環式材料からの環式材料の分離は遠心または濾過により適切になされる。

非環式材料から環式材料を分離した後、環式材料の溶液は約３０％固形分に調整 され、蒸留されてシクロヘキサンを蒸発させる。これにより、従来の方法で分離 されるα−およびβ−シクロデキストリンの溶液が得られる。

このα−およびβ−シクロデキストリンの溶液は従来の炭素処理を施すと好適で ある。結晶化によりβ−シクロデキストリンの殆どが回収される。これらの炭素 処理および結晶化は従来の方法で行われる。

次に、残る溶液は限定量のシクロヘキサンにより処理されてα−シクロデキスト リンを特異的に複合化する。得られた複合物は遠心または濾過により溶液から適 切に分離される。

次に、シクロへ牛サンとα−／クロデキストリンの複合物が蒸留により分離され る。次に、α−７クロデキストリンが炭素処理され、結晶化されて、純粋なα− ，シクロデキストリンが得られる。

本発明の上記の側面およびその他の側面は以下に示す例によりさらに完全に理解 されよう。

を示すものである。以下の表Ｉには得られた結果が示しである。

２０　１１．６９　３９．８　６０．２３０　１２．７５　２６．７　’　７３ ．３４０　１４、４２　１３　８７ ５０　８、２７　２３　７７ ６０　８．０５　０１００ 澱粉基賀はＤＥ値が５のワックス状コーン澱粉°水解物であった。シクロデキス トリンを生成するために、３０％（乾量基準）ｆｌｉ粉水解水解溶液整した。ｐ ）ｌが６．０±０．２に調節され、溶液に全反応体積の５％量のシクロヘキサン が添加された。さらに、溶液には１００グラムの澱粉固形９当たり８００　Ｔｉ １ｄｅｎ−Ｈｕｄｓｏｎ単位のレベルで／クロデキストリングルコンルトランス フェラーゼを添加した。反応生成物が表１に示した種々の温度で培養された。転 換は３日間攪拌して継続された。生成されたシクロデキストリンが収集され、高 圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析された。上記表１にリストし た全量が生成されたシクロデキストリンのダラムで表した全重量である。α−お よびβ−シクロデキストリンの百分率もリストしである。他のいかなる測定可能 なシクロデキストリンも生成されず、例えばＴシクロデキストリンは生成されな かった。このことは、ここで示した全ての例に対して言えることである。

ｓｅの臨界性を示したものである。

例Ｉに従って２種類の別々の溶液が調整され、以下の表■にリストした温度で培 養された。シクロデキストリンの量、および転換により生成されたα−１β−１ およびＴ−シクロデキストリンの量は以下の表■に示しである。

表■ 温度（’Ｃ）　酵素　全量（ｇｒ／１０ｈｌ）　ａ　（％）　β（％）　ｒ（％ ）２０　Ｂ、ｍａｃｅｒａｎｓ　１１．６９　３９．８　６０．２　０２０　Ｂ 、５ｕｂｔｉｌｕｓ　１４．４０　０　１０００５０　Ｂ、　ｍａｃｅｒａｎｓ 　８．２７　２３　７７　０５０　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｕｓ　１４．７０　０　 １００　０この表■から明らかなように、ＣＧＴａｓｅがＢ、　５ｕｂｔｉｌｕ ｓから得られたとき反応の温度を下げることにより生成されるシクロデキストリ ンの量の増加は存在しない。上記のように、両溶液は存在するシクロヘキサンを 有した。このようにして、低温およびシクロヘキサンのみではシクロヘキサン量 の増加は得られなかった。

事実、低温では、”Ｂ、５ｕｂｔｉｌｕｓを用いた場合、シクロデキストリンの 生成量は低かった。

一旦 本例は、溶液中のシクロヘキサンの存在の臨界性を示すものであり、通常、低温 が反応を遅くシ、より少ない生成物を与えることが予測される。

澱粉氷解物の溶液が、シクロへキサンの無い場合に以下の表■にリストした温１ ｆｆ（’Ｃ）　全量（ｇｒ／１００ｍ１）　ａ　（％）　８　（％）　ｒ　−ｆ ％）２０　３．４３　、　６２．３５　２９．１０　Ｂ、５５５０　３．９４　 ５５．５６　３３．４６　１０．９８上記から判るように、温度の低下は、従来 の考え方が何を指示するかを正確に示すもの、すなわち、生成される生成物の量 を単に下げることを示すものである。このようにして、低温のみではシクロデキ ストリンの増加をもたらさない。

即 本例はさらに、シクロヘキサンと低温との組合せの臨界性を示すものである。

２種類の溶液が調整され、／クロヘキサンまたはトルエンのいずれかを用いて以 下の表■にリストした温度で例Ｉに従って培養された。トルエンの量はシクロヘ キサンの量と同じであった。

邑Ｎ 温度（’Ｃ１色倉＃　全１　（ｇｒ／１００ｍ１）　ａ　（９６）　８　（％） 　ｒ　（％＞２０　シクロヘキサン　１１．６９　３９．８　６０．２　０２０ トルエン　１１．４０　０　１００　．０５０　シクロヘキサン　８．２７　２ ３　７７　０５０トルエン　１２．９０　０　１００　０これらの結果から判る ように、低温ではトルエンが複合物であったとき生成された／クロデキストリン の量を増加させなかった。実際、低温はシクロデキストリンの生成量の減少をも たらした。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂａｃｉｌｌｓｍａｃｅｒａｎｓから得られたシクロデキストリングルコシ ルトランスフェラーゼにより触媒される澱粉基質の加水分解反応において、シク ロデキストリンの生成量を増加させるために、かつα−およびβ−シクロデキス トリンを生成し、ｒ−シクロデキストリンをほぼ生成しないために、シクロヘキ サンの存在下約４５℃以下の温度で加水分解反応を行うプロセス。
2. ２．存在する前記シクロヘキサンの量は反応体積の約５から約１０パーセントで ある請求項１記載のプロセス。
3. ３．前記温度が約２０℃と４０℃の間である請求項１記載のプロセス。
4. ４．前記澱粉基質は、ＤＥ値が１と１０の間の澱粉水解物である請求項１記載の プロセス。
5. ５．前記澱粉水解物はワックス状澱粉水解物である請求項４記載のプロセス。
6. ６．前記澱粉基質がＢａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓからのシクロデキストリ ングルコシルトランスフェラーゼによりシクロデキストリンに転換されるシクロ デキストリンの生成量を増加させるプロセスであって、シクロヘキサンの存在下 約４５℃以下の温度で前記澱粉水解物をシクロデキストリンに転換することから なるプロセス。
7. ７．存在する前記シクロヘキサンの量は反応体積の約５から約１０パーセントで ある請求項６記載のプロセス。
8. ８．前記温度は約２０℃と約４０℃の間である請求項６記載のプロセス。
9. ９．前記澱粉基質はＤＥ値が１と１０の間の澱粉水解物である請求項６記載のプ ロセス。
10. １０．前記澱粉水解物はワックス状澱粉水解物である請求項９記載のプロセス。
11. １１．α−シクロデキストリンを生成するプロセスであって、（ａ）シクロへキ サンの存在下約４０℃以下の温度で、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓから得 られたシクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼによりＤＥ値が１と１ ０の間の澱粉水解物の水溶性スラリーを処理して、ｒ−シクロデキストリンを生 成することなくα−シクロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンを形成す るプロセスと、 （ｂ）形成されたα−シクロデキストリンとβ−シクロデキストリンを回収する プロセスからなるプロセス。
12. １２．前記澱粉水解物の処理は約１日から４日の時間をとる請求項１１記載のプ ロセス。
13. １３．存在する前記シクロへキサンの量はスラリーの約５体積％である請求項１ １記載のプロセス。
14. １４．前記スラリーは約３０重量％から約３５重量％の固形分を有する請求項１ １記載のプロセス。
15. １５．前記スラリー処理時の温度は約２０から約４５℃である請求項１１記載の プロセス。