CN116426587A - 淀粉分支酶协同制备抗性糊精的方法 - Google Patents
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- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
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- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Abstract
本发明涉及淀粉精深加工技术领域，公开了一种淀粉分支酶协同制备抗性糊精的方法。本发明提供的方法将酸热法与酶解改性耦合，通过酸热法和酶解改性的处理条件相互配合，不仅显著提高抗性糊精产率，而且还能有效提高其抗消化性组分的含量，具有反应条件温和，环境污染少，抗性糊精产量高，产品质量好等优点，为抗性糊精的制备提供了一种高效、环保、节能的新方法、新思路。
Description
技术领域
本发明涉及淀粉精深加工技术领域，具体涉及一种淀粉分支酶协同制备抗性糊精的方法。
背景技术
抗性糊精通常是淀粉经过部分降解及糖基化转移形成的低热量葡聚糖，属于可溶性膳食纤维。具有较低的黏度、良好的持水性、耐热、耐酸、耐冷冻、耐储存、耐压、低褐变等良好的加工特性。
抗性糊精中，除淀粉中本来含有的α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键外，还含有α-1,2-糖苷键、α-1,3-糖苷键等难以被α-淀粉酶和糖化酶降解的分支结构，从而具有可消化性低的特性。除此之外，抗性糊精还具有摄入体内后，在上消化道中可减缓糖类吸收和饭后血糖的上升，进入下消化道后可促进肠道蠕动的特点。还有研究发现，抗性糊精还具有利于在体内形成短链脂肪酸等发酵产物，改善肠道菌群状态，调理肠道功能等作用。
上述特点使得抗性糊精成为在食品领域中具有广阔发展前景的低热量食品原料。目前针对抗性糊精制备的研究主要分为三个方向，一是对原料进行探索，研究不同来源与特性的淀粉制备的抗性糊精的区别；二是对制备方法进行改良和创新，例如在原有的酸热法基础上，研究人员进一步开发出了高温焙烤法、微波法、酶改性法等多种制备方法，旨在提高抗性糊精的产率以及抗性成分含量；三是对分离提纯的方法进行改良，包括采用乙醇沉淀法、发酵法、模拟移动床色谱分离法等多种方式对产品进行高效回收。
然而，目前的抗性糊精制备方法大多仍然基于物理、化学手段进行，其抗性糊精的产率仍有较大提升空间。而且单纯的物理、化学方法，例如酸热法等传统方法进行抗性糊精制备时，还存在着反应剧烈难以控制，副反应较多，产物复杂，具有环境污染风险，并且容易造成资源浪费，并面临着反应不均匀等问题的缺陷。为了提高抗性糊精的产率和品质，同时满足绿色生产和可持续性发展需要，亟需探索新的抗性糊精制备方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的制备方法普遍具有上述缺陷，且抗性糊精产率不足，产品中抗性成分含量较低等问题，提供一种淀粉分支酶协同制备抗性糊精的方法及应用，该方法具有反应条件温和，环境污染少，抗性糊精产率高，产品质量好等优点。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种制备抗性糊精的方法，所述方法包括：
(1)将淀粉与酸混合后进行焙烤，获得焦糊精，其中，所述焙烤的条件包括：温度150-170℃，时间0.5-4h；
(2)将步骤(1)获得的焦糊精与淀粉分支酶混合，进行酶解改性，其中，所述淀粉分支酶为来源于美洲红景天菌(Rhodothermus obamensis)的淀粉分支酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％的同一性。
本发明第二方面提供第一方面所述的方法制备获得的抗性糊精。
本发明第三方面提供第二方面所述的抗性糊精在食品药品制备中的应用，尤其是在功能性食品、药品或保健品制备中的应用。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的方法中，采用生物酶法对经酸解焙烤的焦糊精进行改性从而制备抗性糊精，具有反应条件温和，产物安全性高，抗性糊精产率高，产品中抗性成分含量高等优点。
(2)本发明提供的方法中采用淀粉分支酶对焦糊精进行改性，不引入其他化学基团，仅改变分子内部结构，同时，通过甄选特定的淀粉分支酶，能够产生更多支链，提高抗性成分含量。
(3)本发明提供的方法中，优选采用特定工艺制备的焦糊精，再配合特定淀粉分支酶的改性处理，使得抗性糊精产率和产品品质得到进一步提高。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在研究中巧妙地发现，在传统的酸热法生产工艺基础上，加入淀粉分支酶改性的处理步骤，能够有效解决酸热法反应剧烈难以控制、副反应多、产物复杂、环保性差等问题。该方法不仅能够提高抗性糊精的产率和生产效率，通过淀粉分支酶的分支化作用，还能够催化酸热法制备的焦糊精分子中的α-1,4-糖苷键断裂并发生转移，以α-1,6-糖苷键等形式形成更多支链，使得分子整体的抗消化性得到提高，从而得到品质更好的抗性糊精产品。经过进一步研究，发明人还发现，特定工艺条件制备的焦糊精经过特定淀粉分支酶(例如发明人研究过程中从美洲红景天菌中分离获得的一种淀粉分支酶)的改性，能够进一步提高抗性糊精的产率以及产品中抗性组分的含量，使得整体制备工艺的产量和产品品质都得到进一步改进。
基于上述发现，本发明一方面提供一种制备抗性糊精的方法，所述方法包括：
(1)将淀粉与酸混合后进行焙烤，获得焦糊精，其中，所述焙烤的条件包括：温度150-170℃，时间0.5-4h；
(2)将步骤(1)获得的焦糊精与淀粉分支酶混合，进行酶解改性，其中，所述淀粉分支酶为来源于美洲红景天菌Rhodothermus obamensis的淀粉分支酶，其氨基酸序列与SEQID NO:1所示的序列具有至少80％的同一性。
MSWLTEEDIRRWESGTFYDSYRKLGAHPDDEGTWFCVWAPHADGVSVLGAFNDWNPCDLPLERYGGGLWAGYVPGARPGHDYKYRIRHGFYQADKTDPYAFAGEPPTGSPIEGLAEWITRLDYTWLEPEHGRRRKGPASLYEPVSGYEVHLGSHFPEAMGESFSYREIAEPLADYVQEMGFTHVELLPVMEHPYYGSWGYQVVGYYAPTFRYGGPQDLMYLIDYLFQRRVGVILDWVPSHFAADPQGLVFFDGTTLFEYDDSWHGRPPDWGTYVFDYNKPGVRNFLISNALFWLEKYHVDGLRVLERASMLYRREHRKEWTPRIFGGRENLEAIDFILFMGGLVYLHFPEAMTIAEESPGAPGVSAPTYNNGLGFLYKWVMGWMHDTLDYIARDPIYRKYHHPELTFSLWYAFSEHYVLPLSHDEVVHGKGSLWGKMPGDDGSGAANLRLLFGHEDGHPGKKLLFMGGEFGQHHEWNHDTQLEWHLLDQPYHRGIQLWVCDLNHLYRTNPALWHDGPEGFEWIDFSDRDQSDDGYLRKNAGRMLLFVLNFTPVPREHYRVGVPIGGPWHEVLNSDAVAYGGSGMGNFGRVRAVPESWHGRPFHLELTLPPLAALILEPEHG(SEQ IDNO:1)
本发明中，对于所使用的淀粉分支酶的具体获取方式没有特别限制，其可以为通过商购或定制获得的具有前述特征的淀粉分支酶，也可以为按照现有技术自行制备获得的相关产品。例如，本领域技术人员可以根据SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，按照密码子表获取其编码基因，再采用基因工程手段生物表达获取相应的淀粉分支酶。在此基础上，还可以根据所选用的基因工程菌的特点，在对该淀粉分支酶的作用不产生不利影响的情况下对该序列进行改造(例如在不影响该淀粉分支酶的功能的前提下插入或删去一些的氨基酸残基，为了提高淀粉分支酶的作用效果进行单点或多点突变，或者为了方便纯化而添加一些常见的氨基酸标签等)。
本发明中，对于淀粉的具体选择没有特别限制，任意能够用于抗性糊精制备的淀粉均可适用于本发明。根据本发明的一些优选实施方式，其中，步骤(1)中，所述淀粉选自普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、山药淀粉、绿豆淀粉、马铃薯淀粉和小麦淀粉中的至少一种。
优选地，所述淀粉为普通玉米淀粉。
优选地，所述淀粉在与酸混合前先进行预干燥处理。优选所述预干燥处理的条件使得所述淀粉中的水含量不超过15重量％。
根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中，所述酸选自盐酸、硫酸、柠檬酸和酒石酸中的至少一种。优选为盐酸。
优选地，所述酸采用浓度为0.1-0.25重量％的溶液形式与淀粉混合。
为了使得淀粉与酸混合更加均匀，优选地，所述酸以喷淋的方式与淀粉混合。
根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，以干物质计，所述淀粉分支酶的用量为180-250U/g焦糊精(以干基计)。
为了使得焦糊精与淀粉分支酶更加均匀地接触并促使其进行改性，优选地，所述焦糊精先加水配制成10-30重量％的焦糊精溶液，再与淀粉分支酶混合。
根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，所述淀粉分支酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％，优选至少95％的同一性。例如95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、100％的同一性，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。
优选地，所述淀粉分支酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
为了进一步提高改性的效率和效果，根据本发明的一种优选实施方式，其中，步骤(2)中，所述酶解改性的条件包括温度55-70℃，时间10-16h。
根据本发明的优选实施方式，其中，根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括：(3)将步骤(2)酶解改性的产物依次进行液化处理和糖化处理。
本发明中，对于所述液化处理和糖化处理的方式和条件均没有特别限制，任意本领域中能够用于淀粉或其衍生物(例如糊精类物质等)的液化和糖化的方式均可适用于本发明。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述液化处理的方式包括：将酶解产物与α-淀粉酶混合，并在液化条件下进行处理。优选所述液化条件包括pH 5-6，温度80-100℃，时间20-60min。
优选地，所述α-淀粉酶的用量为50-100U/g焦糊精(即以酶解产物对应的焦糊精干基为基准，进行α-淀粉酶的用量计算，后同)。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述糖化处理的方式包括：将液化处理产物与β-淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶(又称为糖化酶、α-1,4-葡萄糖水解酶)混合，并在糖化条件下进行处理。优选所述糖化条件包括pH 4-5，温度50-70℃，时间12-24h。
优选地，所述β-淀粉酶的用量为50-100U/g焦糊精。
优选地，所述葡萄糖淀粉酶的用量为50-100U/g焦糊精。
为了尽可能去除抗性糊精产品中的易消化组分(例如葡萄糖、麦芽糖等单糖和双糖)，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)还包括将糖化处理产物进行发酵处理的操作。
优选地，所述发酵处理的方式包括：将糖化产物与发酵菌混合，进行发酵，以去除糖化产物中的单糖和/或双糖(例如葡萄糖、麦芽糖等)。
更优选地，所述发酵处理的条件使得发酵产物中，以干物质计，单糖和/或双糖的含量不超过发酵体系总重量的5重量％。优选所述发酵条件包括温度30-37℃，时间12-24h。
本发明中，对于发酵处理过程中采用的发酵菌的具体选择并没有特别限制，任意能够用于食品或食品原料制备，且能够利用葡萄糖、麦芽糖等易消化的单糖和双糖，同时无法水解或基本无法水解抗性糊精中的抗性元件(例如α-1,2-糖苷键及α-1,3-糖苷键等)进行增殖和代谢的菌种均可适用于本发明。例如可以选用酿酒酵母、毕赤酵母等发酵剂进行发酵处理。“基本无法水解”是指在发酵处理后，抗性元件的含量不低于发酵前的90重量％。本发明对于发酵处理过程中采用的发酵菌的来源也没有特别限制，其只要具有上述特征和功能即可，既可以是商购获得的相关产品，也可以是自行筛选、培养的相关菌种。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括：(4)将发酵处理产物进行纯化处理和干燥处理，获得抗性糊精。
本发明中，纯化处理的主要目的为去除发酵产物中的发酵菌体和大分子杂质(例如失活的酶蛋白等)。任意能够实现该目的的纯化处理方式均可适用于本发明。优选地，所述纯化处理包括对发酵产物进行固液分离和对获得的液相进行膜过滤，以去除其中的发酵菌和杂质。
更优选地，所述固液分离的方式可以为离心分离。优选所述离心分离的条件包括温度15-25℃，转速8000-12000rpm，时间15-25min。
更优选地，所述膜过滤采用水系膜进行。优选孔径0.3-0.5μm的水系膜。
任意本领域中能够用于抗性糊精干燥的处理方式均可适用于本发明。优选地，所述干燥处理的方式选自喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥、滚筒干燥和冷冻干燥中的至少一种，优选所述干燥处理的条件使得干燥后的抗性糊精中水分含量不超过20重量％，更优选为10-15重量％。
根据本发明一种特别优选的实施方式，其中，所述方法包括：
(1)酸解焙烤：采用喷淋的方式将淀粉与酸的水溶液(优选酸的水溶液的浓度为0.1-0.25重量％)混合后在150-170℃的温度下焙烤1-3h，获得焦糊精；
(2)酶解改性：将步骤(1)获得的焦糊精与淀粉分支酶混合，进行酶解改性，其中，所述淀粉分支酶为来源于美洲红景天菌Rhodothermus obamensis的淀粉分支酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％的同一性，所述淀粉分支酶的用量为180-250U/g焦糊精(例如可以为180U/g焦糊精、185U/g焦糊精、190U/g焦糊精、200U/g焦糊精、210U/g焦糊精、220U/g焦糊精，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值)；
(3)液化、糖化及发酵处理：将步骤(2)获得的酶解改性的产物与α-淀粉酶混合，在pH 5-6，温度85-95℃的条件下处理20-40min，获得液化处理产物，其中，α-淀粉酶的用量为50-100U/g焦糊精；
将液化处理产物与β-淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶混合，在pH 4-5，温度55-65℃的条件下处理12-24h，获得糖化处理产物，其中，β-淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶的用量为50-100U/g焦糊精；
将糖化处理产物与发酵菌(优选酵母菌)混合，在温度30-37℃的条件下发酵12-24h，以使单糖和/或双糖(例如葡萄糖、麦芽糖等)的含量不超过发酵体系总重量的5重量％；
(4)纯化和干燥处理：将发酵产物在9000-10000rpm的转速下离心15-20min，然后将获得的液相经0.4-0.5μm水系膜过滤；
将获得的滤液进行干燥(优选喷雾干燥、真空干燥和冷冻干燥中的至少一种)，获得水含量为10-15重量％的抗性糊精(粉末)。
本发明第二方面提供如上所述的方法制备获得的抗性糊精。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述抗性糊精中抗性组分的含量不低于80重量％。
优选地，所述抗性糊精的数均分子量(Mn)为1090-2100g/mol；重均分子量(Mw)为3850-4300g/mol，优选为4000-4200g/mol；峰分子量(MP)为1120-1150g/mol。峰分子量又称为“最高峰的分子量”，是指分子量分布曲线图中最高峰处的顶端分子量。
本发明第三方面提供如上所述的抗性糊精在食品药品制备中的应用。尤其是在功能性食品、药品或保健品制备中的应用。
由于本发明提供的抗性糊精具有抗性组分含量高、抗消化性好、制备工艺简单、绿色环保的优点，使其特别适合用于具有减肥功能、控制血糖功能的食品或药品，低GI食品，特殊医学用途配方食品等产品的制备。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中采用的淀粉为购自山东寿光巨能金玉米开发有限公司的普通玉米淀粉。在使用前，先对玉米淀粉进行预干燥处理，使得其中水分含量不超过15重量％。采用的淀粉分支酶为分离自美洲红景天菌Rhodothermus obamensis STB05中，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的酶，其具体获得方法可参考：Expression and characterization ofan extremely thermophilic1,4-α-glucan branching enzyme from Rhodothermusobamensis STB05.Protein Expression and Purification,2019,164:105478.。采用的α-淀粉酶购自无锡杰能科生物工程有限公司，β-淀粉酶购自大连美仑生物技术有限公司，牌号为MB3067，葡萄糖淀粉酶购自美国Sigma-Aldrich公司，牌号为A7095。采用的食品级干酵母粉购自安琪酵母股份有限公司。未作特殊说明的情况下，采用的其他试剂和材料均为购自正规化学品供应商的商购产品，试剂纯度均为分析纯。
实施例1
按照以下方法进行抗性糊精制备：
(1)按干基质量10mL/100g淀粉的比例，将质量分数0.1％的稀盐酸以喷淋的方式与淀粉混合，然后将所得混合物在150℃下酸解焙烤2h，获得焦糊精。
(2)将步骤(1)获得的焦糊精加水溶解为20重量％的溶液，调节pH至7，按照180U/g焦糊精(焦糊精以干基计，后同)的添加量加入淀粉分支酶进行改性，反应温度为60℃，反应时间为10h，获得酶解改性产物。
(3)将酶解改性产物的pH调节至5.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加α-淀粉酶，在90℃下液化30min，获得液化产物。
将液化产物降温至60℃，调节pH至4.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加β-淀粉酶，反应时间为20h，获得糖化产物；
将糖化产物在95℃下煮沸30min灭酶，加入食品级干酵母粉25g/L进行发酵，发酵条件为32℃，200rpm反应12h。经检测，以干物质计，发酵结束后体系中的单糖和双糖的总含量约为3.1重量％。
(4)将发酵产物在10000rpm条件下离心20min，采用0.45μm水系膜对上清液进行过滤，然后对滤液进行喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末状抗性糊精A1。
实施例2
按照以下方法进行抗性糊精制备：
(1)按干基质量10mL/100g淀粉的比例，将质量分数0.2％的稀盐酸以喷淋的方式与淀粉混合，然后将所得混合物在160℃下酸解焙烤2h，获得焦糊精。
(2)将步骤(1)获得的焦糊精加水溶解为20重量％的溶液，调节pH至7，按照180U/g焦糊精的添加量加入淀粉分支酶进行改性，反应温度为55℃，反应时间为12h，获得酶解改性产物。
(3)将酶解改性产物的pH调节至6，按100U/g焦糊精的加酶量添加α-淀粉酶，在90℃下液化30min，获得液化产物。
将液化产物降温至60℃，调节pH至4.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加葡萄糖淀粉酶，反应时间为12h，获得糖化产物；
将糖化产物在95℃下煮沸30min灭酶，加入食品级干酵母粉30g/L进行发酵，发酵条件为37℃，200rpm反应14h。经检测，以干物质计，发酵结束后体系中的单糖和双糖的总含量约为2.5重量％。
(4)将发酵产物在10000rpm条件下离心20min，采用0.45μm水系膜对上清液进行过滤，然后对滤液进行喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末状抗性糊精A2。
实施例3
按照以下方法进行抗性糊精制备：
(1)按干基质量10mL/100g淀粉的比例，将质量分数0.15％的稀盐酸以喷淋的方式与淀粉混合，然后将所得混合物在170℃下酸解焙烤2h，获得焦糊精。
(2)将步骤(1)获得的焦糊精加水溶解为20重量％的溶液，调节pH至7，按照200U/g焦糊精的添加量加入淀粉分支酶进行改性，反应温度为50℃，反应时间为14h，获得酶解改性产物。
(3)将酶解改性产物的pH调节至6，按50U/g焦糊精的加酶量添加α-淀粉酶，在90℃下液化30min，获得液化产物。
将液化产物降温至60℃，调节pH至4.5，按100U/g焦糊精的加酶量添加葡萄糖淀粉酶，反应时间为18h，获得糖化产物；
将糖化产物在95℃下煮沸30min灭酶，加入食品级干酵母粉30g/L进行发酵，发酵条件为37℃，200rpm反应24h。经检测，以干物质计，发酵结束后体系中的单糖和双糖的总含量约为3.4重量％。
(4)将发酵产物在10000rpm条件下离心20min，采用0.45μm水系膜对上清液进行过滤，然后对滤液进行真空干燥，最终得到淡黄色粉末状抗性糊精A3。
实施例4
按照以下方法进行抗性糊精制备：
(1)按干基质量10mL/100g淀粉的比例，将质量分数0.25％的稀盐酸以喷淋的方式与淀粉混合，然后将所得混合物在165℃下酸解焙烤2h，获得焦糊精。
(2)将步骤(1)获得的焦糊精加水溶解为20重量％的溶液，调节pH至7，按照220U/g焦糊精的添加量加入淀粉分支酶进行改性，反应温度为50℃，反应时间为10h，获得酶解改性产物。
(3)将酶解改性产物的pH调节至6，按100U/g焦糊精的加酶量添加α-淀粉酶，在90℃下液化30min，获得液化产物。
将液化产物降温至60℃，调节pH至4.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加葡萄糖淀粉酶，反应时间为16h，获得糖化产物；
将糖化产物在95℃下煮沸30min灭酶，加入食品级干酵母粉20g/L进行发酵，发酵条件为30℃，200rpm反应12h。经检测，以干物质计，发酵结束后体系中的单糖和双糖的总含量约为2.9重量％。
(4)将发酵产物在10000rpm条件下离心20min，采用0.45μm水系膜对上清液进行过滤，然后对滤液进行冷冻干燥，最终得到淡黄色粉末状抗性糊精A4。
实施例5
按照以下方法进行抗性糊精制备：
(1)按干基质量10mL/100g淀粉的比例，将质量分数0.2％的稀盐酸以喷淋的方式与淀粉混合，然后将所得混合物在170℃下酸解焙烤1h，获得焦糊精。
(2)将步骤(1)获得的焦糊精加水溶解为20重量％的溶液，调节pH至7，按照250U/g焦糊精的添加量加入淀粉分支酶进行改性，反应温度为50℃，反应时间为12h，获得酶解改性产物。
(3)将酶解改性产物的pH调节至5.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加α-淀粉酶，在90℃下液化30min，获得液化产物。
将液化产物降温至60℃，调节pH至4.5，按50U/g焦糊精的加酶量添加β-淀粉酶，反应时间为24h，获得糖化产物；
将糖化产物在95℃下煮沸30min灭酶，加入食品级干酵母粉25g/L进行发酵，发酵条件为30℃，200rpm反应24h。经检测，以干物质计，发酵结束后体系中的单糖和双糖的总含量约为3.9重量％。
(4)将发酵产物在10000rpm条件下离心20min，采用0.45μm水系膜对上清液进行过滤，然后对滤液进行冷冻干燥，最终得到淡黄色粉末状抗性糊精A5。
实施例6
按照实施例1中的方法进行抗性糊精制备，不同的是，按照表1调整步骤(1)中焦糊精制备的条件。其余步骤和操作均与实施例1相同。
表1
测试例1
采用以下方法对以上实施例中抗性糊精得率以及各抗性糊精样品中抗性组分的含量进行测试和计算。结果详见表2。
抗性糊精得率的测定：
采用GOPOD法检测试剂盒(购自北京利德曼生化股份有限公司)测定样液(浓度为0.05重量％的抗性糊精溶液)中的葡萄糖含量。取0.05mL样液，于离心管中稀释100倍，预热后加入1.5mL显色剂，于37℃下保温10min。在520nm波长下测定吸光值，样液中的葡萄糖浓度根据以下公式计算：
式中：cGlu——葡萄糖浓度，mmol/L
Ai——样品的吸光度
A0——空白溶液的吸光度
As——标准溶液的吸光度
cs——标准溶液中葡萄糖浓度，mmol/L
然后根据以下公式换算抗性糊精得率：
X＝100-ωGlu×0.9
式中：X——抗性糊精得率，％
ωGlu——葡萄糖含量，％
0.9——脱水转化系数
抗性组分含量的测定：
参照Rapidly available glucose in foods:an in vitro measurement thatreflects the glycemic response.American Journal of Clinical Nutrition,1999,69(3):448-454.中记载的体外模拟消化方法，取其肠道消化部分并进行改进：取0.1g烘干后的样品于2.5mL 0.25mol/L醋酸钠缓冲液与1.67mL蒸馏水中，沸水浴糊化30min后加入15颗玻璃珠(直径4mm)。37℃保温后加入2.5mL醋酸钠缓冲液，30min后加入0.83mL胰酶液，开始计时。反应20min、120min时分别取200μL反应液，置于5mL 66.6％乙醇中灭酶，3500rpm离心5min后，取50μL上清液测定葡萄糖含量。按照如下计算公式换算抗性组分(即抗消化组分)含量：
RDS＝G20×0.9×100
SDS＝(G120-G20)×0.9×100
RS＝100-RDS-SDS
式中：RDS——快消化组分的质量分数，％
G20——样品消化20min产生葡萄糖的质量分数，％
SDS——慢消化组分的质量分数，％
G120——样品消化120min产生葡萄糖的质量分数，％
RS——抗消化组分的质量分数，％
表2
测试例2
为进一步表征抗性糊精品质，对本发明提供的方法制备获得的抗性糊精样品的平均分子量进行测定。具体检测方式和条件包括：采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定以上实施例中制备获得的抗性糊精A2的分子量。使用配备2410示差折光检测器的Waters 1525高效液相色谱系统进行HPGFC分析，并用Empower工作站记录和处理色谱数据。使用UltrahydrogelTMLinear(300mm×7.8mm)凝胶过滤柱对样品进行分离，柱温为40℃，以0.5mL/min的流速注入50μL样品，0.1M硝酸钠作为流动相。其中样品浓度为5mg/mL，采用Sigma-Aldrich的Dextran系列标准溶液作为分子量校正曲线标准品。
以不采用酶处理的方法制备获得的抗性糊精(即参照实施例2的制备方法，只是省略步骤(2)的酶处理步骤，其他操作和条件均与该实施例相同)为对照，结果如表3所示。
可以看出，本发明提供的方法制得的抗性糊精样品与对照组抗性糊精样品的平均分子量存在一定差异。其中，对照组样品的分子量相对较大，而本发明提供的淀粉分支酶协同的方法制备获得的样品分子量进一步增加。经检测，对照组和抗性糊精A2的聚合度分别为23和25个葡萄糖单元，由此表明本发明所选用的淀粉分支酶的作用有助于增加糊精分子的簇状结构，延缓其消化性。
表3
注：表3中，Mn代表数均分子量，Mw代表重均分子量，MP代表峰分子量，峰面积是指在色谱图中背景线以上部分的总面积，代表抗性糊精样品峰所占据的面积，面积越大说明所得抗性糊精的分子量分布更均一、品质更好，面积(％)是指主峰占总峰面积的比例。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备抗性糊精的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将淀粉与酸混合后进行焙烤，获得焦糊精，其中，所述焙烤的条件包括：温度150-170℃，时间0.5-4h；
(2)将步骤(1)获得的焦糊精与淀粉分支酶混合，进行酶解改性，其中，所述淀粉分支酶为来源于美洲红景天菌(Rhodothermus obamensis)的淀粉分支酶，其氨基酸序列与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少80％的同一性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述淀粉选自普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、山药淀粉、绿豆淀粉、马铃薯淀粉和小麦淀粉中的至少一种；
优选地，所述淀粉为普通玉米淀粉；
优选地，所述淀粉在与酸混合前先进行预干燥处理，优选所述预干燥处理的条件使得所述淀粉中的水含量不超过15重量％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，所述酸选自盐酸、硫酸、柠檬酸和酒石酸中的至少一种，优选所述酸以浓度为0.1-0.25重量％的溶液形式与淀粉混合；
优选地，所述酸以喷淋的方式与淀粉混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，以干物质计，所述淀粉分支酶的用量为180-250U/g焦糊精；
优选地，所述焦糊精先加水配制成10-30重量％的焦糊精溶液，再与淀粉分支酶混合；
和/或，步骤(2)中，所述淀粉分支酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％，优选至少95％的同一性；
优选地，所述淀粉分支酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所述酶解改性的条件包括温度55-70℃，时间10-16h。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括：(3)将步骤(2)酶解改性的产物依次进行液化处理和糖化处理；
优选地，所述液化处理的方式包括：将酶解产物与α-淀粉酶混合，并在液化条件下进行处理，优选所述液化条件包括pH 5-6，温度80-100℃，时间20-60min；
优选地，所述糖化处理的方式包括：将液化处理产物与β-淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶混合，并在糖化条件下进行处理，优选所述糖化条件包括pH4-5，温度50-70℃，时间12-24h。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)还包括将糖化处理产物进行发酵处理的操作；
优选地，所述发酵处理的方式包括：将糖化产物与发酵菌混合，进行发酵，以去除糖化产物中的单糖和/或双糖；
更优选地，所述发酵处理的条件使得发酵产物中，以干物质计，单糖和/或双糖的含量不超过发酵体系总重量的5重量％，优选所述发酵条件包括温度30-37℃，时间12-24h。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括：(4)将发酵处理产物进行纯化处理和干燥处理，获得抗性糊精；
优选地，所述纯化处理包括对发酵产物进行固液分离和对获得的液相进行膜过滤，以去除其中的发酵菌和杂质；
优选地，所述干燥处理的方式选自喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥、滚筒干燥和冷冻干燥中的至少一种，优选所述干燥处理的条件使得干燥后的抗性糊精中水分含量不超过20重量％，更优选为10-15重量％。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备获得的抗性糊精。
10.权利要求9所述的抗性糊精在食品药品制备中的应用，尤其是在功能性食品、药品或保健品制备中的应用。
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