JPH0116479B2

JPH0116479B2 -

Info

Publication number: JPH0116479B2
Application number: JP3682087A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Iwahashi; Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1987-02-19
Publication date: 1989-03-24
Also published as: JPS63202379A

Description

【発明の詳細な説明】

［技術分野］本発明はバシルス属細菌によるアミラーゼG4
の生産増強法に関するものである。［従来技術］澱粉から、グルコースが４個、α―1.4―グル
コシド結合しているマルトテトラオースを生成す
るアミラーゼは、これまでに、シユードモナス・
スツツエリ｛Pseudomonas stuzeri アーカイブ
オブバイオケミストリーアンドバイオフ
イジクス（Archive of Biochemistry and
Biophysics）145巻、105頁（1971）｝とシユード
モナスカロフイラ｛Pseudomonas
saccharophila、昭和60年度日本農芸化学大会講
演要旨集370頁（1985）｝に知られている。本発明者の一人は、バルシスサーキユランス
（Bacillus circulans）と同定した細菌が、シユー
ドモナス属のものとは違つた新規なマルトテトラ
オース生成酵素を生産することを認め、先に特許
出願した（特願昭60−143518他）。［目的及び効果］本発明者らは、この酵素の工業的利用を目的と
して、その生産性を向上する方法について、鋭意
研究を続けてきた結果、アミラーゼG4を生産す
るバシルス属細菌を、ドデシル硫酸ナトリウムの
存在下で培養すると、アミラーゼG4の生産量が
顕著に増加できることを認め、本発明を完成し
た。［構成］すなわち、本発明は、バシルス属細菌を培養し
て、澱粉からマルトテトラオースを生成するアミ
ラーゼG4を製造するに際し、ドデシル硫酸ナト
リウムの存在下で培養することを特徴とするバシ
ルス属アミラーゼG4の製造方法に関するもので
ある。以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明す
る。本発明により生産されるアミラーゼG4は、下
記の酵素的性質を有する。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα―グルカンをマルトテトラオー
スを主成分とする分解物に分解する。本酵素は
エンド型の分解様式を持つα―アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき約65〜75
％の収量でマルトテトラオースが得られる。 (2) 作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性
澱粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き約75℃まで作用し、最適作用温度は約50℃で
ある。（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適作用PH；約４〜約12の広
い範囲に作用する。最適作用PHは６〜8.5であ
る（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％可溶
性澱粉下で作用、第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の下
で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約40％
失活し、55℃、10分間の加熱で約85％失活した
（第１図ｃ）。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その結
果、PH６〜９の範囲で安定であつた（第１図
ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンが存在するとき、
熱安定性の増加が認められた（第１図ｃの破
線）。 (7) 阻害剤；本酵素は、５×10^-3MのHgCl₂、
CuSO₄、ZnSO₄、AgNO₃により、それぞれ、
約100％、約95％、約50％、約30％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、DEAE―セフアロース
（Sepharose）カラムクロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）A0.5mカラムクロマト
グラフイー及び同ゲルによる再クロマトグラフ
イーにより電気泳動的に均一まで精製すること
ができる。 (9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5mを用い
たゲル濾過法により測定した分子量は約１万で
あつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に
溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに適量の酵素
を加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で１分間に1μモルのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を１単位と
した。以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れているシユードモナススツツエリのマルトテ
トラオース生成アミラーゼと比較すると(1)最適作
用PHは、本発明の酵素はPH６〜8.5の広いPH範囲
にあるのに対し、シユードモナススツツエリの
酵素はPH８付近にあること、(2)本発明の酵素を澱
粉に作用させたとき、約65〜75％の収量でマルト
テトラオースが得られるのに対し、シユードモナ
ススツツエリの酵素の場合は約55％であるこ
と、(3)本発明の酵素の分子量は１万前後にあるの
に対し、シユードモナススツツエリの酵素は、
48000と58000にある［バイオケミストリーアン
ドバイオフイジクスアクタ（Biochemistry
and Biophysics Acta）566巻、88頁（1979）］な
ど、本発明の酵素とシユードモナススツツエリ
の酵素とは、澱粉からのマルトテトラオースの収
量、最適作用PH、分子量などの性質において、顕
著な違いのある酵素であり、本発明者は、この酵
素をアミラーゼG4と命名した。また、本酵素を生産するバシルス、サーキユラ
ンス（Bacillus circulans）Ｇ―４は、下記の菌
学的性質を有している。本菌は微工研条寄第820
号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。 (1) 形態；桿菌、巾0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。 (2) 胞子；通常、末端近くに１個、胞子嚢のふく
らみは認められない。 (3) 肉汁；混濁、沈降する。 (4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及
び表面凹凸あり。 (5) グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐
色。 (6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。 (7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。 (8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり
良くない。淡黄〜黄褐色。 (9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。 (10) ミルク；やつくり凝固、ベプトン化。 (11) インドール；生成しない。 (12) カタラーゼ；生成する。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) 硫化水素；生成しない。 (15) クエン酸；利用する。 (16) 硝酸塩の還元；陰性。 (17) クエン酸；利用する。 (18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生育
し、10％食塩でも少し生育する。 (19) 炭水化物；Ｄ―グルコース、Ｄ―フラクト
ース、Ｄ―マンノース、Ｌ―アラビノース、Ｄ
―リボース、マルトース、シユークロース、澱
粉などから酸を生成するが、ガスの生成はな
い。Ｄ―キシロース、Ｌ―ラムノース、Ｌ―ソ
ルボースの利用性は良くない。 (20) 最適生育温度；26℃前後。 (21) 最高生育温度；約60℃ (22) 死滅温度；100℃で30分間加熱しても死滅
しない。以上の菌学的性質について、バージエイスマ
ニユアルオブデタミネーテイブバクテリオ
ロジー（Bergey's Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版［ザウイ
リアムスアンドウイルキンスカンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、
（1957年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス
サーキユランス（Bacillus circulans）の一種
と同定し、バシルスサーキユランスＧ―４と命
名した。本菌を培養してアミラーゼG4を生産するには、
窒素源として、肉エキス、ペプトン、酵母エキ
ス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカー、大
豆粕、大豆タンパクおよびこれらの部分分解物な
どの有機窒素源、炭素源としては、澱粉、デキス
トリン、マルトース、グルコース、シユークロー
スなど、そして、これに補足する栄養源として、
無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩や各種の
金属塩を含む培地が使用される。ドデシル硫酸ナトリウムは、培地に対して、
0.01％、通常0.05〜0.1％量添加すると、酵素の生
産量は、無添加の場合に比べ1.5〜２倍に増加す
る。アミラーゼG4は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。酵素は、必要により濃縮し、硫安、硫酸ナトリ
ウムによる塩析によるか、または、アセトン、イ
ソプロパノール、エタノール、メタノールなどの
有機溶媒を加えて、酵素を沈澱物として取得し、
乾燥保存する。実施例１ポリペプトンＳ｛和光純薬(株)販売の大豆製ペプ
トン｝0.5％魚肉エキス1.5％K₂HPO₄0.3％、
MgSO₄・7H₂O0.1％、デキストリン1.2％からな
る組成の液体培地（PH6.5）４mlに、第１表に記
載の表面活性剤を0.1％量加えたものを、直径18
mmの試験管に入れ、常法により殺菌後、バシルス
サーキユランスG4（微工研条寄第820号）を接
種し、30℃で４日間振盪培養した。培養後、遠心
分離して得た上澄液について、生産されたアミラ
ーゼG4を測定した結果は、第１表に示す通りで
あつた。

【表】表から明らかなように、ドデシル硫酸ナトリウ
ムの添加により、アミラーゼG4の生産量が増収
できた。実施例２実施例１で使用したと同じ組成の培地に、ドデ
シル硫酸ナトリウムを、第２表に記載の量を加え
た培地４mlを、直径18mmの試験管に入れ、常法に
より殺菌後、バシルスサーキユランスG4（微工
研条寄第820号）を接種し、30℃で４日間培養し
た。培養後、遠心分離して得た上澄液について、
生産されたアミラーゼG4を測定した結果は、第
２表に示す通りであつた。

【表】表から明らかなように、0.05％のドデシル硫酸
ナトリウムの添加により、アミラーゼG4の生産
量は約1.5倍増収された。

【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ、ｃとｄはそれぞれ、アミラーゼ
G4の最適作用温度、最適作用PH、熱安定性とPH
安定性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１バシルス属細菌を培養して、澱粉からマルト
テトラオースを生成するアミラーゼG4を製造す
るに際し、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で培
養することを特徴とするバシルス属アミラーゼ
G4の製造方法。