JPS63202379A

JPS63202379A - アミラ−ゼｇ４の生産法

Info

Publication number: JPS63202379A
Application number: JP3682087A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Iwahashi; 均岩橋; Yoshiyuki Takasaki; 高崎　義幸
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1987-02-19
Publication date: 1988-08-22
Also published as: JPH0116479B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［技術分野］本発明はバシルス属細菌によるアミラーゼＧ４の生産増
強法に関するものである。

［従来技術］澱粉から、グルコースが４個、α−１，４−グル、ｊ・
− に知られている。

本発明者の一人は、バシルス　サーキュランス（Ｂａｃ
ｉｕｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）と同定した細菌が、
シュードモナス属のものとは違った新規なマルトテトラ
オース生成酵素を生産することを認め、先に特許出願し
た（特願昭６０−１４３５１８他）。

［目的及び効果］本発明者らは、この酵素の工業的利用を目的として、そ
の生産性を向上する方法について、鋭意研究を続けてき
た結果、アミラーゼＧ４を生産するバシルス属細菌を、
ドデシル硫酸ナトＩＪウムの存在下で培養すると、アミ
ラーゼＧ４の生産量が顕著に増加できることを認め、本
発明を完成した。

［構　成コすなわち、本発明は、バシルス属細菌を培養して、澱粉
からマルトテトラオースを生成するアミラーゼＧ４を製
造するに際し、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で培養
することを特徴とするバシルス属アミラーゼＧ４の製造
方法に関するものである。

以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明する。

本発明により生産されるアミラーゼＧ４は、下記の酵素
的性質を有する。

（１）作用；　アミロース、アミロペクチン、グリコー
ゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオースを主成分
とする分解物に分解する。本酵素はエンド型の分解様式
を持つα−アミラーゼの一種であり、液化澱粉に作用さ
せるとき約６５〜７５９６の収量でマルトテトラオース
が得られる。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；　　１５＋５可
溶性澱粉、０．０５ＭＩＪン酸緩衝液の下で作用させた
とき約７５℃まで作用し、最適作用温度は約５０℃であ
る。（第１図（ａ））。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ；約４〜約１２の
広い範囲に作用する。最適作用ｐＨは６〜８．５である
（０．０５Ｍ酢酸またはリン酸緩衝液、１９６可溶性澱
粉下で作用、第１図ｂ）。

（４）熱安定性；０．ＩＭ）リス緩衝液（１）Ｃ７，Ｏ
）の下で加熱した場合、５０℃、１０分間の加熱で約４
０９６失活し、５５℃、１０分間の加熱で約８５％失活
した（第１図（Ｃ））。

（５Ｊ　　ｐＨ安定性；Ｏ，Ｈｖｌ、ｍ衝液の下で、室
温（２５℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。そ
の結果、ｐＨ６〜９の範囲で安定であった（第１図（ｄ
））。

（６）安定化；カルシウムイオンが存在するとき、熱安
定性の増加が認められた（第１図（Ｃ）の破線）。

（７）阻害剤；　本酵素は、５Ｘ１０−”ＭのＨｇＣ１
，。

Ｃｕ５Ｏ４，ＺｎＳＯ４，ＡｇＮＯ３により、それぞれ
、約１００％、約９５％、約５０９６、約３０％阻害さ
れた。

（８）　　精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄
液から、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロース（５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　）カラム　クロマトグラフィーとバイオゲ
／ｌ／　（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ａ　０．５　ｍカラム　り
Ｃ１？トゲラフイー及び同ゲルによる再クロマトグラフ
ィーにより電気泳動的に均一まで精製することができる
。

（９）分子量；バイオゲ／Ｉ／　（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ａ
　Ｏ，５ｍを用いたゲル濾過法により測定した分子量は
約１万であった。

αα　力価測定法；０．ＩＭ！Ｉン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解させた２９６可溶性澱粉０．５艷に適量の酵
素を加え、水で全ｆｆ１ｌｒｎｔとし、４０℃で反応さ
せる。

この条件で１分間に１μモルのグルコースに相当する還
元力を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質１こついて、本発明以前に知られてい
るシュードモナス　スッツエリのマルトテトラオース生
成アミラーゼと比較すると（１）最適作用ｐＨは、本発
明の酵素はＩ）Ｈ６〜８．５の広いｐＨ範囲にあるのに
対し、シュードモナス　スッツェリの酵素はｐＨｓ付近
にあること、（２）本発明の酵素を澱粉に作用させたと
き、約６５〜７５％の収量でマルトテトラオースが得ら
れるのに対し、シュードモナス　スッツエリの酵素の場
合は約５５％であること、（３）本発明の酵素の分子量
は１万前後にあるのに対し、シュードモナス　スッツェ
リの酵素は、４８．０００と５８，０００にある［バイ
オケミストリー　アンド　バイオフィジクス　アクタ（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃｓ　Ａｃｔａ　）　５６６巻、８８頁（１９７９）］
など、本発明の酵素とシュードモナス　スツツエリの酵
素とは、澱粉からのマルトテトラオースの収量、最適作
用ｐＨ１分子量などの性質において、顕著な違いのある
酵素であり、本発明者は、この酵素をアミラーゼＧ４と
命名した。

また、本酵素を生産するバシルス、サーキュランｘ　（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎａ　）Ｇ　−４は
、下記の菌学的性質を有している。本菌は微工研条寄第
８２０号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。

（１）形態；桿菌、巾０．５〜１×５〜６μ、運動性な
し、ダラム陰性。

（２）胞子；通常、末端近（に１個、胞子嚢のふくらみ
は認められない。

（３）肉汁；混濁、沈降する。

（４）肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及び表
面凹凸あり。

（５）グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色。

（６）グルコース硝酸寒天；生育悪い。

（７）ポテト；生育良好、乳白色に生育。

（８）グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり良（
ない。淡黄〜黄褐色。

（９）チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐色。

０αミルク；やっ（り凝固、ペプトン化。

（１１）インドール；生成しない。

（至）カタラーゼ；生成する。

０３アセチルメチルカルビノール；生成しない。

（１４）硫化水素；生成しない。

（５）クエン酸；利用する。

０ｅ硝酸塩の還元；陰性。

ａηクエン酸；利用する。

（１８１食塩肉汁；　８％食塩含有培地までよく生育し
、１（１食塩でも少し生育する。

（１１炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ　−ＩＪ
　ホース、マルトース、シュークロース、澱粉などから
酸を生成するが、ガスの生成はない。

Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−ソルボースの利
用性は良（ない。

■最適生育温度；　２６℃前後。

（社）最高生育温度；約６０℃ ■死滅温度；　１００℃で３０分間加熱しても死滅しな
い。

以上の菌学的性質について、バージエイス　マニュアル
　オブ　デタミネーティプ　バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙ″ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｍ＆ｃｔｅｈｉｏｌｏｇｙ　）の第７版及び第
８版［ザ　ウィリアムス　アンド　ゥイルキンス　カン
パニー（Ｔｈ８Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　町−Ｃｏｍ
ｐａｎｙ）、（１９５７年及び１９７４年）を参照し、
本菌をバシルス　サーキュラ：／　、；ｃ　（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）の一種と同定し、
バシルス　サーキュランスＧ−４と命名した。

本菌を培養してアミラーゼＧ４を生産するには、窒素源
として、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、
コーン・ステイープ・リカー、大豆粕、大豆タンパクお
よびこれらの部分分解物などの有機窒素源、炭素源とし
ては、澱粉、デキストリン、マルトース、グルコース、
シュークロースなど、そして、これに補足する栄養源と
して、無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩や各種の
金属塩を含む培地が使用される。

ドデシル硫酸ナトリウムは、培地に対して、０．０１９
６、通常０．０５〜０．１９６量添加すると、酵素の生
産量は、無添加の場合に比べ１．５〜２倍に増加する。

アミラーゼＧ４は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。

酵素は、必要により浪縮し、硫安、硫酸ナトリウムによ
る塩析によるか、または、アセトン、イソプロパツール
、エタノール、メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵
素を沈澱物として取得し、乾燥保存する。

実施例１゜ポリペプトンＳ（和光紬薬（株）販売の大豆製ペプトン
）０．５％　魚肉エキス１．５９６に２ＨＰＯ＜０．３
％、Ｍｇ５Ｏ，・７ＨｔＯ０，１９６、デキストリン１
．２９６からなる組成の液体培地（１）Ｈ６，５）　４
−に、第１表に記載の表面活性剤を０．１％量加えたも
のを、直径１８ｍｍの試験管に入れ、常法により殺菌後
、バシルス　サーキュランスＧ４　（微工研条寄第８２
０号）を接種し、３０℃で４日間振盪培養した。培養後
、遠心分離して得た上澄液について、生産されたアミラ
ーゼＧ４を測定した結果は、第１表に示す通りであった
。

第　　１　　表表から明らかなように、ドデシル硫酸ナトリウムの添加
により、アミラーゼＧ４の生産量が増収できた。

実施例　２実施例１で使用したと同じ組成の培地に、ドデシル硫酸
ナトリウムを、第２表に記載の量を加えた培地４ｍｌを
、直径１８ｍｍの試験管に入れ、常法により殺菌後、バ
シルス　サーキュランスＧ４（微工研条寄第８２０号）
を接種し、３０℃で４日間培養した。培養後、遠心分離
して得た上澄液について、生産されたアミラーゼＧ４を
測定した結果は、第２表に示す通りであった。

表から明らかなように、０．０５９６のドデシル硫酸ナ
トリウムの添加により、アミラーゼＧ４の生産量は約１
．５倍増収された。

【図面の簡単な説明】

Claims

【特許請求の範囲】

バシルス属細菌を培養して、澱粉からマルトテトラオー
スを生成するアミラーゼＧ４を製造するに際し、ドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下で培養することを特徴とする
バシルス属アミラーゼＧ４の製造方法。