JPWO2009022415A1 - セルラーゼ及びセロオリゴ糖の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
上記課題に絡み、従来、セルロース酵素分解時のセロオリゴ糖の収率向上を目的として多くの試みがなされてきた。
セルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することによりセロオリゴ糖を選択的に得る方法としては以下のものが挙げられる。
及び白色腐朽菌等のリグニン分解菌とともに反応することで、セロオリゴ糖の1種であるセロビオースの製造方法が開示されている。この製造方法では、セルロースの脱リグニン処理を経ずに、セルラーゼの基質に対する作用を高めることができるが、その分解生成物にはセロビオース以外にリグニン分解物が混入するため、上記と同様にセロオリゴ糖の収量が低くなる。また、高純度のセロビオースを得るには、リグニン分解物の除去工程が必要となり、精製工程が複雑となるという問題があった。
特許文献5には、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この方法によると、セルロース系物質の酵素分解による分解生成物として、セロビオース、セロトリオースのみからなるセロオリゴ糖が得られる。しかしながら、セロビブリオ属に属する微生物が生産する酵素は結晶性のセルロースには作用しにくく、反応時間を短縮し、収率を向上するためには基質として非晶質セルロースが必要であり、工程が複雑になるという問題があった。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
(2) アオイ科に属する植物の種子が綿実であることを特徴とする(1)に記載の酵素液の製造方法。
(3) 綿実由来の成分として綿実粕を0.1〜10質量%含有する液体培地においてTrichoderma属に属する微生物を培養することを特徴とする(2)に記載の酵素液の製造方法。
(5) 微生物がTrichoderma reeseiに属する菌株であることを特徴とする(1)から(4)のいずれかに記載の酵素液の製造方法。
(8) (1)から(7)のいずれかに記載の製造方法により製造された酵素液を用いて、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
20mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に溶解した1%カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を480μl用意する。これに適当に希釈した酵素液20μlを加え、40℃で30分間反応させる。95℃、15分間加熱して反応を停止させた後、3,5−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
50mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に懸濁した1.25質量%の結晶性セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名:セオラスPH−101を水分60%として、三英製作所製、商品名:万能攪拌混合機でフック羽根により、90分間、126rpmで混練攪拌したもの)の基質液0.4mlに適当に希釈した酵素液を0.1ml添加し、40℃で30分間反応後、95℃で15分間加熱して反応を停止させた後、3,5−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
200mM酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)に溶解した2.0質量%のセロビオース(Aldrich製:特級グレード)の基質液0.3mlに酵素液0.3mlを添加し、40℃で30分間反応後、95℃で15分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット(グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製)を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。1分間に1μmolのグルコースを遊離する酵素量を1酵素単位(1U)と定義する。
本発明の酵素液を、セロオリゴ糖の製造に使用する場合は、セルラーゼ活性が高く、かつセロオリゴ糖選択率が高い酵素液を得る必要があり、上記のTricoderma属に属する微生物の中でも、Trichoderma reeseiに属する菌株を用いることが好ましく、特に、Trichoderma reesei GL−1株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10323)またはTrichoderma reesei AKC−015株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10839)を使用することが好ましい。上記の方法において、さらにセロオリゴ糖を高収率で製造する為には、上記のTrichoderma reesei GL−1株あるいはAKC−015株を親株として、セロオリゴ糖を高収率かつ高選択率で得られるよう、公知の変異処理を施された変異株を使用することが好ましい。
Trichoderma reesei GL−1株またはAKC−015株を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で28℃、3〜10日間培養する。生成した胞子を生理的食塩水に100,000〜100,000,000 個/mlになるよう懸濁し、EMS(ethyl methane sulfonate)で変異処理を施す(100〜500μg/ml、pH7.0、28℃、5〜24時間)。セロオリゴ糖生産性の高いセルラーゼを分泌する菌株の選択は、この変異誘発処理胞子の懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、グルコースなどを炭素源として培養し、培養物の酵素活性を公知の方法で測定することで達成される。例えば、各変異処理菌株の培養物を用いて、セロビオースまたは結晶セルロースを基質として酵素分解し、生成した還元糖を定量してもよく、公知の発色基質を使用し培養物と酵素反応させることで定性的に目的の菌株を選択してもよい。
酵素分解方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明のセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のpH及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は5〜95℃、pHは1〜11の範囲でよい。また、この圧力、温度、pHについても、上記同様、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、上述のTricoderma reeesei GL−1株及び/またはAKC−015株、またはそれらの変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、常圧で、酢酸またはリン酸緩衝液中で、温度50〜60℃、pH3.0〜5.5の範囲で行うことが好ましい。
また、本発明により得られるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
[実施例1]
Tricoderma reesei GL−1株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10323)をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製):0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03mL、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水:30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101)0.3gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
Tricoderma reesei GL−1株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製):0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03ml、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101)0.3gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
実施例1、または2と同様の方法において、本培養用培地の綿実粕(実施例1では1g、実施例2では2g)を使用するかわりに、小麦フスマ(日本製粉)2gまたは1g(それぞれ小麦フスマ−2%、1%とする)、コーンスティープリカー(和光純薬製)2gまたは1g(それぞれコーンスティープリカー−2%、1%とする)、を含んだ本培養用培地を用いるほかは実施例1と同様の方法でTricoderma reesei GL−1株を6日間培養した。6日目に培養液を遠心分離した後、その上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)を測定し、それぞれの結果を図1に示す。
Tricoderma reesei GL−1株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製):0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03ml、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101):0.3gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
Tricoderma reesei GL−1株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製) 0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03ml、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101):0.3gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で3日間前培養した。
実施例1と同様に培養して得られた培養液の上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)、セルラーゼ活性(MCCase)及びβ−グルコシダーゼ活性を測定し、それぞれの結果を表1、2及び表3に示す。
実施例2と同様に培養して得られた培養液の上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)、セルラーゼ活性(MCCase)及びβ−グルコシダーゼ活性を測定し、それぞれの結果を表1、2及び表3に示す。
本培養用培地100mlに綿実粕:5gを入れる以外は実施例4と同様にして培養して、7日目に培養液を遠心分離した後、上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)及びセルラーゼ活性(MCCase)は58.4及び19.4であった。
本培養用培地100mlに綿実粕:7gを入れる以外は実施例4と同様にして培養して、7日目に培養液を遠心分離した後、上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)及びセルラーゼ活性(MCCase)は17.9及び8.0であった。
Tricoderma reesei GL−1株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、28℃、7日間培養して胞子を十分形成させる。その1白金耳を綿実粕(ファーマメディア、トレダース社製) 0.15g、KH2PO4:0.06g、(NH4)2SO4:0.045g、MgSO4・7H2O:0.009g、CaCl2・2H2O:0.009g、アデカノールLG109:0.03ml、微量元素液(H3BO36mg (NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg FeCl3・6H2O 100mg CuSO4.5H2O 40mg MnSO4・5H2O 8mg ZnSO4・7H2O 200mgを水100mlに溶解並びに懸濁した液):0.03mlを水30mlに溶解及び懸濁させ、pH4.0に調整し、150ml容三角フラスコに30ml分注し、結晶セルロース(旭化成ケミカルズ製、商品名PH−101):0.15gを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、28℃で6日間前培養した。培養6日目に、GL−1株の培養液を遠心分離した後、その上澄1mLのセルラーゼ活性(CMCase)およびβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、CMCaseが29.4U、β−グルコシダーゼ活性が0.145Uであった。
Claims (8)
- アオイ科に属する植物の種子由来の成分を含有する液体培地においてTrichoderma属に属する微生物を培養することを含む、セルラーゼを含む酵素液の製造方法。
- アオイ科に属する植物の種子が綿実であることを特徴とする請求項1に記載の酵素液の製造方法。
- 綿実由来の成分として綿実粕を0.1〜10質量%含有する液体培地においてTrichoderma属に属する微生物を培養することを特徴とする請求項2に記載の酵素液の製造方法。
- 液体培地が、硫酸イオン、硫酸水素イオンおよびアンモニウムイオンから選ばれる少なくとも一つを含有することを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の酵素液の製造方法。
- 微生物がTrichoderma reeseiに属する菌株であることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の酵素液の製造方法。
- Trichoderma reeseiに属する菌株が、Trichoderma reesei GL−1株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10323)、および/またはTrichoderma reesei AKC−015株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10839)、および/またはGL−1株もしくはAKC−015株を親株として得られる変異株であることを特徴とする請求項5に記載の酵素液の製造方法。
- Trichoderma reesei AKC−015株(独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号;FERM BP−10839)を培養することを含む、セルラーゼを含む酵素液の製造方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載の製造方法により製造された酵素液を用いて、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
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