CN101883847B - 纤维素酶以及纤维低聚糖的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种酶溶液的制造方法：该方法以纤维素系物质为原料、在纤维素酶存在下通过酶解而有选择、高产地生产纤维二糖时，纤维素酶活性高、且可确保大量的纤维低聚糖高选择率的培养上清酶溶液；以及使用了该酶溶液的纤维低聚糖的制造方法。根据本发明，可提供包含纤维素酶的酶溶液的制造方法，该方法包含在含有来自属于锦葵科的植物种子的成分的液体培养基中，培养属于Trichoderma属的微生物。

Description

纤维素酶以及纤维低聚糖的制造方法
技术领域
本发明关于选择性、高产率制造纤维低聚糖的方法，是纤维素酶活性高、且纤维低聚糖选择率高的酶溶液的制造方法，以及使用了该酶溶液的纤维低聚糖的制造方法。
背景技术
纤维低聚糖是纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖的总称，是1～6个吡喃葡萄糖单位以β-1，4键合的各种糖类。近年来，与其他的低聚糖相同，纤维低聚糖的生理机能日益明确，可望作为功能性食品的新素材(参照非专利文献1)。一般，作为得到纤维二糖的方法，所知的有(1)使用了以蔗糖为原料的酶合成反应的方法和(2)使用了以纤维素为原料的酶的分解反应的方法。
作为上述(1)的酶合成反应，所知的有，在磷酸存在下，以蔗糖为原料，依次作用蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶以及纤维二糖磷酸化酶，得到纤维二糖的方法(参照专利文献1)。但是，该方法中，为了得到纤维二糖，使用了3种昂贵的酶，且在3个阶段各自必须反应，考虑工业生产的话，酶的成本较高，且生产效率低。
另一方面，作为上述(2)的酶分解反应，所知的有，将纤维素系材料通过纤维素酶进行分解的方法。关于此种酶解反应，关键在于如何提高从纤维素生产纤维低聚糖时含有纤维素酶的酶溶液的纤维低聚糖的生产效率，如何防止生成的纤维二糖向葡萄糖分解(参照非专利文献2)。
围绕上述课题，一直以来，进行了许多以提高纤维素酶解时的纤维低聚糖得率的尝试。
作为使用纤维素酶、通过酶解纤维素选择性得到纤维低聚糖的方法，例举如下。
专利文献2提出，使用含有许多非结晶性纤维素的纤维素原料，在木质素存在下进行纤维素酶的水解反应，同时，通过随时从反应液中至少采取水解反应所生成的纤维低聚糖中的纤维二糖的纤维低聚糖制造方法，专利文献3提出，蒸解含有天然木质纤维素的原料，将蒸解后未经过干燥而得到的湿浆(wet pulp)通过纤维素酶部分水解，至少采取纤维低聚糖中的纤维二糖的纤维低聚糖制造方法。
这些制造方法，是将纤维素酶所含的纤维低聚糖分解酶——β-葡萄糖苷酶吸附在木质素上，通过抑制β-葡萄糖苷酶的作用，抑制纤维低聚糖向葡萄糖的分解，提高纤维低聚糖的反应选择率。但是，这些制造方法中，由于所得到的糖化液含有大量的木质素，结果会降低纤维低聚糖的产收量。此外，为了得到高纯度的纤维低聚糖，必须进行从糖化液的脱除木质素的处理，因此存在精制工序变得复杂的问题。
专利文献4提出，通过使含有1～20质量％的木质素的木质纤维素与纤维素酶以及白色腐朽菌等木质素降解菌共同反应，制造纤维低聚糖的1种——纤维二糖的方法。该制造方法中，不经过纤维素的脱除木质素处理，可以提高对于纤维素酶的基质的作用，但由于其分解生成物中混入了纤维二糖以外的木质素降解物，因此与上述相同，纤维低聚糖的产收量下降。此外，为了得到高纯度的纤维二糖，必须有木质素降解物的除去工序，因此存在精制工序变得复杂的问题。
此外，通过使用特定的纤维素酶、纤维素的酶解，来提高纤维低聚糖得率的方法可例举如下。
专利文献5提出，通过属于纤维弧菌属的微生物所生产的纤维素酶的作用，在水性反应液中从纤维素系物质制造纤维低聚糖的方法中，通过超滤反应器的组合，可解除生成物阻碍，生成积蓄纤维低聚糖的纤维低聚糖的制造方法。通过该方法，作为纤维素系物质的酶解的分解生成物，可以得到仅由纤维二糖、纤维三糖构成的纤维低聚糖。但是，属于纤维弧菌属的微生物所生产的酶难以对结晶性的纤维素起作用，为了缩短反应时间、提高得率，必须有作为基质的非晶质纤维素，存在工序变复杂的问题。
专利文献6提出，用纤维素酶分解纤维素、生成纤维低聚糖的方法中，事先令纤维素酶与平衡为pH3.5～5.0的弱酸性阳离子交换树脂接触，从而选择性除去纤维素酶中的β-葡萄糖苷酶，令相关的除去了β-葡萄糖苷酶的纤维素酶与纤维素接触，从而得到纤维低聚糖的制造方法。根据该制造方法，通过纤维素的酶解，可以减少葡萄糖，得到纤维低聚糖60％以上的分解生成物。但是，该制造方法中，必须有除去纤维素中的β-葡萄糖苷酶的工序，存在纤维低聚糖制造工序变复杂的问题。此外，该纤维素酶精制工序中，对于未处理纤维素酶，必须用75～1000倍的阳离子交换树脂，因此纤维素酶处理量受限制，纤维低聚糖的生产效率不充分，存在纤维素酶精制成本、阳离子交换树脂的分离精制剂成本增加的问题。
专利文献7提出，令纤维素酯或纤维素醚酯的任一个或两者与纤维素酶溶解，保温一定时间后，变化pH，通过使不溶的固体部分与溶液分离，而选择性除去纤维素酶中含有的β-葡萄糖苷酶的纤维素酶精制方法，此外，将该除去了β-葡萄糖苷酶的纤维素酶与纤维素添加在水性介质中变为悬浊液，对该悬浊液进行一定时间的保温，令该悬浊液中生成纤维二糖，采取该纤维二糖的纤维二糖的制造方法。
专利文献8提出，在调整pH后可溶解壳聚糖的水性介质中，溶解上述壳聚糖和纤维素酶，保温一定时间后，变化pH，通过使不溶的固体部分与溶液分离，而选择性除去纤维素酶中含有的β-葡萄糖苷酶的纤维素酶精制方法，此外，将该除去了β-葡萄糖苷酶的纤维素酶与纤维素添加在水性介质中变为悬浊液，对该悬浊液进行一定时间的保温，令该悬浊液中生成纤维二糖，采取该纤维二糖的纤维二糖的制造方法。
通过这些制造方法，使用纤维素衍生物或壳聚糖对纤维素酶进行吸附分离处理，使其在吸附于纤维素衍生物或壳聚糖的状态下与纤维素接触，从而提高纤维二糖的得率。但是，该制造方法中，必须进行纤维素酶的精制处理，因此存在制造工序变得复杂，使用于纤维素酶精制的纤维素衍生物、壳聚糖昂贵、成本上升的问题。此外，由于同时将纤维素酶与纤维素衍生物或壳聚糖用于纤维素酶解，因此存在必须从分解反应液中将其除去的工序的问题。
专利文献9提出，将不溶性纤维素或含有纤维素的物质与来自Trichoderma的纤维素酶在水性介质中保温后，分离固体部分，在该固体部分中加入水溶性溶液，得到纤维二糖的方法。通过该制造方法，可以减少在纤维二糖制造工序中混入的β-葡萄糖苷酶，可选择性得到纤维二糖。但是，由于必须对固体部分进行纤维素酶吸附工序以及固体部分分离工序，因此存在工序非常复杂的问题。
非专利文献1：Cellulose Communications，5，No2，91-97(1998)
非专利文献2：《セルラ一ゼ》讲谈社サイエンテイフイツク发行，97-104(1987)
专利文献1：日本专利特开平03-130086号公报
专利文献2：日本专利特开平05-317073号公报
专利文献3：日本专利特开平07-184678号公报
专利文献4：日本专利特开平08-089274号公报
专利文献5：日本专利特开平01-256394号公报
专利文献6：日本专利特开平05-115293号公报
专利文献7：日本专利特开平05-227957号公报
专利文献8：日本专利特开平05-227958号公报
专利文献9：日本专利特开昭63-226294号公报
发明内容
本发明的目的是提供：以纤维素系物质为原料、在纤维素酶存在下酶解而有选择生产纤维二糖时，无须经过繁杂的工序，纤维素酶活性高、且可确保大量的纤维低聚糖高选择率培养上清酶溶液的酶溶液制造方法；以及使用了该酶溶液的纤维低聚糖的制造方法。
本发明人们发现，在含有0.1～10质量％棉籽粕的培养基中，培养属于Trichoderma属的微生物，可以得到纤维素酶活性高的培养液。此外，在除棉籽粕外还含有硫酸铵0.01％以上的培养基中接种属于Trichoderma属的微生物，通过在适当的条件下培养，成功地降低了β-葡萄糖苷酶的活性。
即，本发明如下。
(1)一种含有纤维素酶的酶溶液的制造方法，包括在含有棉籽粕的液体培养基中，培养Trichoderma reesei GL-1株和/或Trichoderma reesei AKC-015株。
(2)如(1)所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，在含有0.1～10质量％的棉籽粕的液体培养基中培养。
(3)如(1)或(2)所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，液体培养基含有硫酸铵。
(4)一种纤维低聚糖的制造方法，包含使用(1)～(3)任意一项所述的制造方法所制造的酶溶液对纤维素系物质进行酶解。
通过本发明，可以制造纤维素酶活性高、且纤维低聚糖选择率高的酶溶液，通过将该酶溶液用于纤维低聚糖的制造，可无须经过繁杂的工序而高产地制造纤维低聚糖。
附图说明
图1为棉籽粕与其它的本培养用培养基成分的CMCase活性(相对比)的比较。棉籽粕培养的培养液，较之于其它培养基成分系，在相同培养条件下显示出较高的CMCase活性(相对比)。
具体实施方式
本发明中的纤维素酶指的是分解纤维素的酶的总称，只要具有纤维素的分解活性，即包含在本发明所称的纤维素酶中。此外，本发明中的纤维素酶活性，可用分解羧甲基纤维素(CMC)的酶活性(CMC-ase)和分解结晶纤维素(MCC)的酶活性(MCC-ase)表示，可使用下述方法测定。这些纤维素酶活性越高，纤维素的分解速度、分解率提升，因此较为理想。
(1)CMC-ase活性
准备480μl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5)中溶解有1％羧甲基纤维素钠盐溶液的溶液。在其中加入经过适当稀释的酶溶液20μl，进行40℃、30分钟的反应。95℃加热15分钟，停止反应，然后通过3，5-二硝基水杨酸法进行还原糖比色定量。用纤维二糖标准液制作标准曲线，通过纤维二糖换算，将1分钟内游离1μmol的还原糖的酶量定义为1个酶单位(1U)。
(2)MCC-ase活性
在50mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5)中悬浊有1.25质量％结晶性纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名セオラスPH-101，水分60％，使用三英制作所制造、商品名：万能搅拌混合机的钩型(フツク)搅拌叶，进行90分钟、126rpm混炼搅拌得到)的基质液0.4ml中，加入经过适当稀释的酶溶液0.1ml，进行40℃、30分钟的反应后，加热95℃、15分钟，停止反应，然后通过3，5-二硝基水杨酸法进行还原糖比色定量。用纤维二糖标准液制作标准曲线，通过纤维二糖换算，将1分钟内游离1μmol的还原糖的酶量定义为1个酶单位(1U)。
此外，本发明中的β-葡萄糖苷酶指的是分解纤维低聚糖、生成葡萄糖的酶，以β-葡萄糖苷酶活性定量。通过纤维素的酶解得到葡萄糖的情况下，酶溶液的β-葡萄糖苷酶活性越高，由于葡萄糖的生成速度以及分解率越高，因此有效。反之，为了高产地得到纤维低聚糖，有效的是使用上述纤维素酶活性高、且β-葡萄糖苷酶活性低的酶溶液。该β-葡萄糖苷酶活性可通过以下方法测定。
(3)β-葡萄糖苷酶活性
在200mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5)中溶解有2.0质量％纤维二糖(Aldrich制造：特级级别)的基质液0.3ml中，加入酶溶液0.3ml，进行40℃、30分钟的反应后，95℃加热15分钟，停止反应，然后使用变旋酶和葡萄糖氧化酶组合的酶法试剂——葡萄糖定量试剂盒(葡萄糖CII-test wako，和光纯药工业公司制造)，定量反应液中的葡萄糖浓度。将1分钟内游离1μmol的葡萄糖的酶量定义为1个酶单位(1U)。
本发明使用的纤维素酶生产菌为属于Tricoderma属的微生物。通过接种属于Tricoderma属的微生物、培养，可以制造本发明的纤维素酶活性高的酶。
将本发明的酶溶液用于制造纤维低聚糖时，必须要得到纤维素酶活性高、且纤维低聚糖选择率高的酶溶液，在上述属于Tricoderma属的微生物中，优选使用属于Trichodermareesei的菌株，特别优选使用Trichoderma reesei GL-1株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心、受托编号：FERM BP-10323)或Trichoderma reesei AKC-015株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心、受托编号：FERM BP-10839)。上述方法中，为了进一步高产制造纤维低聚糖，优选使用以上述Trichoderma reesei GL-1株或AKC-015株为亲株、经已知的变异处理得到的变异株，以得到高产且高选择率的纤维低聚糖。
此外，GL-1株于2005年4月15日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))、受托编号：FERM BP-10323，AKC-015株于2007年6月13日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮编305-8566))、受托编号：FERM BP-10839。
此处的已知的变异处理指的是，对于具有纤维素酶生产能的微生物，根据需要使用诸如紫外线照射或亚硝基胍等诱变剂，进行诱变处理，从这些菌株中选择处理纤维低聚糖生产效率高的菌株。作为诱变处理所使用的微生物，亲株优选使用Trichoderma reesei GL-1株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心、受托编号：FERM BP-10323)、或Trichoderma reesei AKC-015株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心、受托编号：FERM BP-10839)。
作为变异处理的一例，例如可举出如下方法。
将Trichoderma reesei GL-1株或AKC-015株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、3～10天的培养。将生成的孢子悬浊在生理盐水，成为100,000～100,000,000个/ml，用EMS(ethyl methane sulfonate)实施变异处理(100～500μg/ml、pH7.0、28℃、5～24小时)。分泌纤维低聚糖生产性高的纤维素酶的菌株的选择，可通过从该诱变处理孢子的悬浊液中离心分离收集孢子、充分洗净、将葡萄糖等作为碳源培养、用已知的方法测定培养物的酶活性来达成。例如，可通过使用各变异处理菌株的培养物，将纤维二糖或结晶纤维素作为基质进行酶解，既可以对生成的还原糖进行定量，也可以使用已知的发色基质令培养物和酶反应，定性选择目标菌株。
本发明的酶溶液的制造方法所使用的本培养用培养基，必须含有来自属于锦葵科的植物种子的成分。作为属于锦葵科的植物种子可举出有棉花、黄秋葵、朱槿、木槿、芙蓉、蜀葵等的种子，优选使用棉籽等。作为来自属于锦葵科的植物种子的成分，可使用例如棉籽粕。此处的棉籽指的是，属于锦葵科棉花属的植物的种子、及其外皮，棉籽粕指的是，从棉籽榨取棉籽油后剩下的物质。本发明的棉籽粕，除了上述的棉籽，也可包括种子、棉籽壳、棉籽绒、棉花、花瓣等。用于培养属于Tricoderma属的微生物的培养基中棉籽的添加量，与酶溶液的纤维素酶活性密切相关，为了得到高效价的纤维素酶，培养基中棉籽粕的添加量必须为0.1～10质量％。培养基中棉籽粕的更优选添加量为0.2～7质量％，进一步优选2～5质量％。
为了得到本发明的选择性制造纤维低聚糖的β-葡萄糖苷酶活性下降的酶溶液，除了来自属于锦葵科的植物种子的成分，还优选在液体培养基中添加选自硫酸根离子、硫酸氢根离子以及铵离子中的至少一种，特别优选在液体培养基中添加硫酸铵。作为培养基中硫酸铵的添加量，为了降低β-葡萄糖苷酶活性，优选0.01～10质量％，更优选0.02～2质量％。特别优选的范围是0.1～0.5质量％。
在本培养所使用的培养基中，除了上述记载的，作为碳源可举出有，纤维素粉末、纤维二糖、滤纸、一般纸类、木屑、米糠、稻壳、蔗渣、大豆粕、咖啡粕、淀粉、乳糖、葡萄糖、甘油、乙醇、有机酸等。此外，作为氮源，可添加硝酸铵等无机铵盐、尿素、氨基酸、肉提取物、酵母提取物、聚蛋白胨、蛋白分解物等有机含氮物。作为无机盐类，可使用KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O、MnCl3·4H2O、ZnSO4·7H2O等。如有需要可使用含有有机微量营养物的培养基。
培养中可使用通常的通气搅拌培养装置或固体培养装置，使用上述培养基，以温度20～40℃、优选26～30℃、培养pH2～8、优选2.5～5.5培养的话，3～10天纤维素酶活性达到最高。接着，通过对培养液进行离心分离、过滤等已知的方法除去菌体，得到上清液。该上清液可直接作为粗酶液使用。
以下说明纤维低聚糖的制造方法。
酶解方法只要使用已知的方法即可，并无特别限制，举一例，作为基质，将纤维素系物质在水性介质中悬浊，添加本发明的纤维素酶，一边搅拌或振荡，一边加温进行糖化反应的方法。
上述方法中，悬浊方法、搅拌方法、纤维素酶·基质的添加方法·添加顺序、它们的浓度等反应条件，可为了得到更高产的纤维低聚糖而进行适当调整。此时的反应液的pH以及温度，只要在酶不失活的范围内即可，一般，在常压下反应时，温度在5～95℃、pH在1～11的范围即可。此外，该压力、温度、pH也可与上述相同，可为了得到更高产的纤维低聚糖而进行适当调整。使用将上述的Trichoderma reesei GL-1株和/或AKC-015株、或它们的变异株作为纤维素酶生产菌所得到的纤维素酶时，纤维素的酶解优选在常压、醋酸或磷酸缓冲液中、温度50～60℃、pH3.0～5.5的范围内进行。
本发明使用的纤维素系物质，优选为含有纤维素的水不溶性纤维质物质。它既可以来自植物性，也可以是动物性，作为产生其的动植物，可举出例如，木材、竹、麦蒿、稻蒿、玉米疖(コブ)、棉花、苎麻、蔗渣、红麻、甜菜、海鞘、细菌纤维素等。此外，本发明中，除了上述动植物产生的天然纤维素系物质，也可以使用将天然纤维素系物质暂且进行化学·物理溶解、或膨润后，再生得到的再生纤维素系物质、以及将纤维素系原料进行了化学修饰的纤维素衍生物系物质。这些纤维素系物质在工业上可任意为浆、纤维素粉末、结晶纤维素等的天然纤维素系原料、人造丝等的再生纤维素、碱性纤维素、磷酸膨润纤维素等各种再生纤维素系原料、羧甲基纤维素钠等各种纤维素衍生物系原料。但是，将得到的纤维低聚糖用于医药品、食品、化妆品时，更优选使用天然纤维素系原料。作为原料，既可以使用其中的1种纤维素系物质，也可以使用2种以上的混合。
该酶反应既可以批量式进行，也可以连续式进行。酶分解反应中，为了回避纤维二糖引起的生成物障碍，将反应系统内的纤维二糖浓度保持在特定范围，这对提高纤维低聚糖的生产效率是很重要的。作为保持反应系统内纤维二糖浓度在特定范围的方法，可以是通过超滤、反渗过滤等的膜过滤取出反应系统生成的纤维二糖的方法；可以是将活性炭、竹、木材等干燥植物粉等有机多孔质基材、二氧化硅等无机多孔质基材导入反应系统，令纤维二糖吸附在它们上的方法；可以是将纤维素基质固定在色谱柱上、令包含纤维素酶的反应液流通的方法；也可以是通过高分子等固定纤维素酶、令包含纤维素酶的反应液流通的方法。
主成分为通过上述酶解得到的纤维低聚糖的水溶液，也可以根据需要实施脱色、脱盐、除酶等精制处理。精制方法只要是已知的方法，则无特别限制，例如可使用活性炭处理、离子交换树脂处理、色谱处理、精密过滤、超滤、反渗过滤等过滤处理、晶析处理等，这些可单独使用，也可2种以上组合。
主成分为上述方法精制的纤维低聚糖的水溶液，既可以直接使用，也可根据需要通过干燥进行固化。干燥方法只要是已知的方法，则无特别限制，例如可使用喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥、薄膜干燥、棚段干燥、气流干燥、真空干燥等，这些可单独使用，也可2种以上组合。
作为上述精制、干燥处理时的纤维低聚糖的介质，除了水以外，也可以根据需要使用有机溶剂等。这里所使用的有机溶剂也没有特别限制，但优选例如制造医药品、食品及它们的添加剂工序中所使用的有机溶剂，可举出《医药品添加物事典》(药事日报社株式会社发行)、《日本药局方》、《食品添加物公定书》(均为广川书店发行)中分类为溶剂的物质。水、有机溶剂可自由地单独使用，也可以2种以上并用，可以将1种介质暂且分散后除去该介质、分散在不同介质。
经过了上述工序的纤维低聚糖的形态并没有特别限制，例如可在常温下以固体、悬浊液、乳液、浆、溶液状的形态使用。作为固体状纤维低聚糖的一例，可举出粉末、颗粒、粒、成形体、积层体、固体分散体等。
通过本发明得到的纤维低聚糖的用途并没有特别限制，例如可用作食品、化妆品、医药品、一般工业制品等领域中的食品成分、化妆品成分、色素成分、香料成分、医药品药效成分、农药成分、饲料成分、肥料成分、培养基成分、分析用试剂成分、以及添加剂、中间原料、发酵原料等。
通过本发明得到的纤维低聚糖，在食品中可用于例如，果冻、布丁、酸奶等的凝胶；蛋黄酱、调味汁、沙司类、酱类、汤、蔬菜加工品等的调味品；咖喱、肉丁洋葱、肉酱、炖、汤等的方便食品、冰鲜食品；汉堡、培根、香肠、腊香肠、火腿类等的畜产加工品；鱼糕、圆筒状鱼糕、鱼肉火腿·香肠、油炸鱼糕等的水练制品；面包、生面、干面、通心粉、意大利面、包子皮、蛋糕预混物、奶糊预混物、白酱、饺子·春卷等的皮类等小麦加工食品；咖喱、酱、汤、关东煮、果酱等罐头、瓶装罐头类；糖果、止咳糖、点心片、巧克力、饼干、曲奇、烤米粉片、日式欧式糕点、欧式带馅糕点、小吃点心、砂糖点心、布丁等糕点类、油炸类；肉饼、饺子、包子等调理加工品；蔬菜糊、肉末、水果糊、鱼类贝类的糊等糊类等。此外，也可用于冰淇淋、冰牛奶、乳冰、冰淇淋乳、炼乳、黄油、酸奶、奶酪、白酱等乳制品；人造黄油、油脂饼(fat spread)、使面点酥松的油脂等油脂加工品等。还可用于可乐等碳酸饮料、含碳酸、含酒精、乳制品的混合水果软饮料、果汁或含果汁饮料、乳类饮料等的饮料；咖啡、牛奶、豆奶、可可牛奶、水果牛奶、酸奶等乳酸/乳类饮料等；煎茶、乌龙茶、抹茶、红茶等茶饮料等。
本发明得到的纤维低聚糖，可期待具有乳酸菌、乳酸杆菌等的活性化等肠内有益菌赋活、降低血糖浓度、血中胰岛素浓度，降低血中胆固醇、降低身体脂肪率、促进脂·糖代谢、改善通便·便臭、抗触性等各种生理活性，因此，除了上述通常的食品用途，也可作为生理活性物质用于功能性食品、健康食品、减肥食品等用途。
此外，通过本发明得到的纤维低聚糖，由于是高纯度，因此也可用作各种纤维低聚糖衍生物的化学变换原料。
实施例
基于实施例等对本发明进行更具体的说明，但本发明并不局限于这些实施例等。
[实施例1]
将Trichoderma reesei GL-1株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心、保藏编号：FERM BP-10323)在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、7天的培养，充分形成孢子。将1白金环的棉籽粕(培养基、トレダ一ス公司制造)：0.15g、KH2PO4：0.06g、(NH4)2SO4：0.045g、MgSO4·7H2O：0.009g、CaCl2·2H2O：0.009g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.03mL、微量元素液(H3BO36mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mg FeCl3·6H2O 100mgCuSO4·5H2O 40mg MnSO4·5H2O 8mg ZnSO4·7H2O 200mg溶解在100ml水并悬浊的溶液)∶0.03ml溶解在水∶30ml并悬浊，调整为pH4.0，分注30ml在150ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)0.3g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的预培养用培养基，进行28℃、3天的预培养。
接着，将该培养液在棉籽粕：2g、KH2PO4：0.2g、MgSO4·7H2O：0.03g、CaCl2·2H2O：0.03g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.1ml、微量元素液∶0.1ml溶解在水∶100ml并悬浊，调整为pH4.0，分注100ml在500ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)2g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的本培养用培养基，进行28℃、6天的培养。在第6天将培养液进行离心分离，测定其1mL上清液的纤维素酶活性(CMCase)。将其结果作为药物培养基(フア一マメデイア-)2％，如图1所示。
[实施例2]
将Trichoderma reesei GL-1株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、7天的培养，充分形成孢子。将1白金环与棉籽粕(培养基、トレダ一ス公司制造)：0.15g、KH2PO4：0.06g、(NH4)2SO4：0.045g、MgSO4·7H2O：0.009g、CaCl2·2H2O：0.009g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.03mL、微量元素液(H3BO36mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mgFeCl3·6H2O 100mg  CuSO4·5H2O 40mg MnSO4·5H2O 8mg ZnSO4·7H2O 200mg溶解在100ml水并悬浊的溶液)∶0.03ml溶解在水∶30ml并悬浊，调整为pH4.0，分注30ml在150ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)0.3g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的预培养用培养基，进行28℃、3天的预培养。
接着，将该培养液在棉籽粕：1g、KH2PO4：0.2g、MgSO4·7H2O：0.03g、CaCl2·2H2O：0.03g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.1ml、微量元素液∶0.1ml溶解在水∶100ml并悬浊，调整为pH4.0，分注100ml在500ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)2g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的本培养用培养基，进行28℃、6天的培养。在第6天将培养液进行离心分离，测定其上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)。将其结果作为药物培养基(フア一マメデイア-)2％，如图1所示。
[比较例1]
在与实施例1、或2相同的方法中，除了使用含有小麦米糠(日本制粉)2g或1g(小麦米糠各自为2％、1％)、玉米浆(和光纯药制造)2g或1g(玉米浆各自为2％、1％)的本培养用培养基代替本培养用培养基的棉籽粕(实施例1为1g、实施例2为2g)外，与实施例1相同的方法对Trichoderma reesei GL-1株进行6天的培养。在第6天将培养液进行离心分离后，测定其上液1mL的纤维素酶活性(CMCase)，各自的结果如图1所示。
[实施例3]
将Trichoderma reesei GL-1株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、7天的培养，充分形成孢子。将其1白金环与棉籽粕(培养基、トレダ一ス公司制造)：0.15g、KH2PO4：0.06g、(NH4)2SO4：0.045g、MgSO4·7H2O：0.009g、CaCl2·2H2O：0.009g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.03mL、微量元素液(H3BO36mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mgFeCl3·6H2O 100mg CuSO4·5H2O 40mg MnSO4·5H2O 8mg ZnSO4·7H2O 200mg溶解在100ml水并悬浊的溶液)∶0.03ml溶解在水∶30ml并悬浊，调整为pH4.0，分注30ml在150ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)0.3g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的预培养用培养基，进行28℃、3天的预培养。
接着，将该培养液在棉籽粕：2g、(NH4)2SO4：0.15g、KH2PO4：0.2g、MgSO4·7H2O：0.03g、CaCl2·2H2O：0.03g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.1ml、微量元素液∶0.1ml溶解在水∶100ml并悬浊，调整为pH4.0，分注100ml在500ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)2g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的本培养用培养基，进行28℃、6天的培养。在第6天将培养液进行离心分离后，测定其上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)、纤维素酶活性(MCCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，各自的结果如表1、2及表3所示。
[实施例4]
将Trichoderma reesei GL-1株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、7天的培养，充分形成孢子。将其1白金环与棉籽粕(培养基、トレダ一ス公司制造)：0.15g、KH2PO4：0.06g、(NH4)2SO4：0.045g、MgSO4·7H2O：0.009g、CaCl2·2H2O：0.009g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.03mL、微量元素液(H3BO36mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mgFeCl3·6H2O 100mg CuSO4·5H2O 40mg MnSO4·5H2O 8mg ZnSO4·7H2O 200mg溶解在100ml水并悬浊的溶液)∶0.03ml溶解在水30ml并悬浊，调整为pH4.0，分注30ml在150ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)0.3g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的预培养用培养基，进行28℃、3天的预培养。
接着，将该培养液与棉籽粕∶1g、(NH4)2SO4：0.15g、KH2PO4：0.2g、MgSO4·7H2O：0.03g、CaCl2·2H2O：0.03g、アゲカノ一ル(注册商标)LG109：0.1ml、微量元素液∶0.1ml溶解在水∶100ml并悬浊，调整为pH4.0，分注100ml在500ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)2g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的本培养用培养基，进行28℃、6天的培养。在第6天将培养液进行离心分离后，测定其上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)、纤维素酶活性(MCCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，各自的结果如表1、2及表3所示。
[实施例5]
测定与实施例1相同培养得到的培养液的上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)、纤维素酶活性(MCCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，各自的结果如表1、2及表3所示。
[实施例6]
测定与实施例2相同培养得到的培养液的上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)、纤维素酶活性(MCCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，各自的结果如表1、2及表3所示。
[表1]
表1.纤维素酶活性(CMCase)
Figure GSB00000583051000121
表1为：作为本培养用培养基的成分，比较每个棉籽粕(表中记载为(フア一マメデイア-))以及硫酸铵(表中记载为硫酸铵)的添加量的培养液的CMCase活性(相对值，单位U)。可知，在培养基中添加硫酸铵的话，即使棉籽粕添加量少，也可以提高CMCase。
[表2]
表2.纤维素酶活性(MCCase)
Figure GSB00000583051000122
表2为：作为本培养用培养基的成分，比较每个棉籽粕(表中记载为(フア一マメデイア-))以及硫酸铵(表中记载为硫酸铵)的添加量的培养液的MCCase活性(相对值，单位U)。可知，在培养基中添加硫酸铵的话，即使棉籽粕添加量少，也可以提高MCCase。
[表3]
表3.β-葡萄糖苷酶
Figure GSB00000583051000123
表3为：作为本培养用培养基的成分，比较每个棉籽粕(表中记载为(フア一マメデイア-))以及硫酸铵(表中记载为硫酸铵)的添加量的培养液的β-葡萄糖苷酶活性(相对值，单位U)。可知，在培养基中添加硫酸铵的话，表1及表2所示的纤维素酶活性(CMCase、MCCase)提升，且β-葡萄糖苷酶活性下降。
因此，由于在培养基中添加棉籽粕、硫酸铵可以提高纤维素酶活性、降低β-葡萄糖苷酶活性，因此在纤维素系物质的酶解中，使用本发明的酶溶液的话，可期待高产地得到纤维低聚糖。
[实施例7]
除了在本培养用培养基100ml中加入棉籽粕：5g以外，与实施例4相同地培养，在第7天将培养液离心分离后，上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)以及纤维素酶活性(MCCase)为58.4和19.4。
[实施例8]
除了在本培养用培养基100ml中加入棉籽粕：7g以外，与实施例4相同地培养，在第7天将培养液离心分离后，上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)以及纤维素酶活性(MCCase)为17.9和8.0。
[实施例9]
将Trichoderma reesei GL-1株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，进行28℃、7天的培养，充分形成孢子。将其1白金环与棉籽粕(培养基、トレダ一ス公司制造)：0.15g、KH2PO4：0.06g、(NH4)2SO4：0.045g、MgSO4·7H2O：0.009g、CaCl2·2H2O：0.009g、アデカノ一ル(注册商标)LG109：0.03mL、微量元素液(H3BO36mg(NH4)6Mo7O24·4H2O 26mgFeCl3·6H2O 100mg CuSO4·5H2O 40mg MnSO4·5H2O 8mg ZnSO4·7H2O 200mg溶解在100ml水并悬浊的溶液)∶0.03ml溶解在水30ml并悬浊，调整为pH4.0，分注30ml在150ml容量的三角烧瓶，添加结晶纤维素(旭化成ケミカルズ制造，商品名PH-101)0.15g后，接种到经过高压灭菌器灭菌的预培养用培养基，进行28℃、6天的预培养。在培养第6天将GL-1株培养液进行离心分离后，测定其上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，CMCase为29.4U、β-葡萄糖苷酶活性为0.145U。
在与上述相同的操作中，使用的菌株由GL-1株变为AKC-015株，进行培养，对培养液进行离心分离后，测定其上清液1mL的纤维素酶活性(CMCase)以及β-葡萄糖苷酶活性，CMCase为37.0U、β-葡萄糖苷酶活性为0.046U。
工业可利用性
通过本发明的制造方法得到的纤维低聚糖，除了通常的食品素材，还适宜用作功能性食品素材、医药品以及其它化学品的中间体合成材料等的化学变换原料、发酵原料，适用于食品、医药品、一般工业制品领域。

Claims (4)

1.一种含有纤维素酶的酶溶液的制造方法，包括在含有棉籽粕的液体培养基中，培养里氏木霉(Trichoderma reesei)GL-1株FERM BP-10323和/或里氏木霉(Trichoderma reesei)AKC-015株FERM BP-10839。
2.如权利要求1所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，在含有0.1～10质量％的棉籽粕的液体培养基中培养。
3.如权利要求1或2所述的酶溶液的制造方法，其特征在于，液体培养基含有硫酸铵。
4.一种纤维低聚糖的制造方法，包含使用权利要求1～3任意一项所述的制造方法所制造的酶溶液对纤维素系物质进行酶解。
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