CN108060148A - 一种蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于真菌发酵技术领域，具体涉及一种蜜蜂球囊菌发酵产葡甘聚糖酶的方法，具体通过将发酵种子液接种于培养基，培养基原料含有L‑阿拉伯糖3~24g/L，酵母浸粉5.5~44g/L，Mn²⁺0.03~1.92 mol/L，烟酸0.005~0.04g/L，控制pH 7.1~7.7，在250 mL的三角瓶装液量为50 mL，接种量5%，于30℃，转速150 r/min下培养。本发明的发酵方法发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。

Description

一种蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，具体涉及一种蜂球囊菌发酵产葡甘聚糖酶的培养基及方法。

背景技术

蜜蜂球囊菌隶属于子囊菌亚门、不整子囊菌纲、球囊菌目、球囊霉属的一个种。此菌是蜜蜂白垩病的病原，是影响我国养蜂业发展的潜在病害之一。本发明就是希望从葡甘聚糖酶上分析蜜蜂球囊菌，提高葡甘聚糖酶的产量。

葡甘聚糖酶是一种能将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的可诱导细胞外泌酶(董桂清，广西轻工业，2007)。葡甘聚糖由甘露糖和葡萄糖单元按1.6∶1.0的摩尔比通过β-1，4-糖苷键相连的天然多糖高分子。目前在真菌、细菌中都有发现产葡甘聚糖酶的菌株，葡甘聚糖酶的应用将会对传统的食品、医药行业等有深远的影响。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种蜜蜂球囊菌发酵产葡甘聚糖酶的培养基，具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基的原料含有L-阿拉伯糖24g/L，酵母浸粉22g/L，Mn²⁺1.92mol/L，烟酸0.005g/L，培养基pH为7.1。

一种蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法包括以下步骤：

(a)将蜜蜂球囊菌按照10％接种至种子培养基，制得发酵种子液；

(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量5％，于30℃，转速150r/min下培养9h。

所述的种子培养基的原料为：将200g土豆加水750mL熬汁，加20g葡萄糖，稀释至1000mL。

采用本发明优化后的培养基，菌龄1d，发酵周期9h，蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶，得到酶为969.59U/mL。

本发明的显著优点在于：本发明的发酵方法发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。

附图说明

图1为甘露糖标准曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

(1)种子培养基配制：去皮马铃薯200g，加水750mL熬汁过滤(八层纱布)，加入葡萄糖20g，再稀释至1000mL，分装于250mL的三角瓶中，每个三角瓶含100mL。121℃，灭菌20min。

(2)发酵种子的制作：将蜜蜂球囊菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于30℃下培养7d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株切块，大小为0.5×0.5cm，5块放入种子培养基，30℃，转速150r/min下培养24h，即为发酵液。

(3)酶液的制备：取步骤(2)下的发酵液在4℃下，10000r/min离心10min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长540nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。

(4)葡甘聚糖酶活测定：在30℃条件下，每1min水解葡甘聚糖释放1μmol对甘露糖所需的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)。

方法：0.9mL葡甘聚糖(质量浓度为0.4％)底物中，加入适当稀释的酶液0.1mL，30℃水浴10min，立即放入100℃水中，水浴5min终止反应，然后加入2.0mL DNS试剂，100℃水浴5min，立即冷却至室温后，用蒸馏水定容至20mL混匀，于波长540nm处测定吸光度值(OD₅₄₀值)。酶活力(U/g或U/mL)＝A×K×V×n/(t×m)(A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL)。

(5)标准曲线的制作：精确配制无水甘露糖1mg/L标准溶液；取25mL具塞试管10支，分别加入质量溶度为称取100mg无水甘露糖(105℃干燥至恒质量)，用适量蒸馏水将其溶解，并定容至100mL。取25mL具塞试管10支，分别加入质量浓度1mg/mL甘露糖溶液0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL，并加蒸馏水补足至1.0mL，加入3，5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid，DNS)试剂[11]，混合均匀。100℃水浴显色5min，冷却至室温后，用蒸馏水定容至20mL，于波长540nm处测定其吸光度值。以甘露糖质量浓度(x)为横坐标，OD_540nm值(y)为纵坐标绘制甘露糖标准曲线，线性回归方程为y＝0.6168x-0.0153,R²＝0.9967。结果见图1。

标准曲线制作表格如下：

1.0mmol/L甘露糖(mL)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9
											蒸馏水(mL)	18	17.9	17.8	17.7	17.6	17.5	17.4	17.3	17.2	17.1
DNS(mL)	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2

(6)不同碳源、氮源、金属离子、维生素、PH对产葡甘聚糖酶的影响

(a)碳源对酶产量的影响，在含有蛋白胨8.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，KCl 5g/L，NaNO₃3g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L的培养基中分别添加6.0g/L蔗糖、6.0g/L葡萄糖、6.0g/L麦芽糖、6.0g/L果糖、6.0g/L L-阿拉伯糖、6.0g/L海藻糖、6.0g/LD-山梨醇、6.0g/L甘露醇、6.0g/Lα-乳糖、6.0g/L甲壳素、6.0g/L糊精、6.0g/L木糖醇、6.0g/LD-半乳糖、6.0g/L壳聚糖、6.0g/L魔芋粉、6.0g/L阿拉伯树胶、6.0g/L木聚糖、6.0g/L柠檬酸、6.0g/L可溶性淀粉，以不加任何碳源为对照。121°灭菌20min(下同)，接入相同体积(2.5mL)的蜜蜂球囊菌菌液，在30℃、150r/min的摇床中培养9h检测酶活性，结果见表1。

(b)氮源对酶产量的影响，在含有葡萄糖6.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，KCl 5g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L的培养基中分别添加11.0g/L酵母浸粉、11.0g/L蛋白胨、11.0g/L牛肉浸膏、11.0g/L酵母提取粉、11.0g/L酵母浸膏、11.0g/L甘氨酸、11.0g/L(NH₄)₂HPO₄、11.0g/L(NH₄)₂SO₄、11.0g/L NH₄NO₃、11.0g/L KNO₃、11.0g/L NaNO₃、11.0g/L尿素、11.0g/L胰蛋白胨、11.0g/L干酪素、11.0g/L酸水解酪蛋白、11.0g/L过硫酸铵，以不加任何氮源为对照。121°灭菌20min，接入相同体积(2.5mL)的蜜蜂球囊菌菌液，在30℃、150r/min的摇床中培养9h检测酶活性，结果见表2。

(c)金属离子对产酶的影响，在含有蛋白胨8.0g/L、葡萄糖6.0g/L的培养基分别添加0.126036mol/L(以6(a)中含有的金属离子按其浓度换算得来)NaCl、0.126036mol/LMgCl₂·6H₂O、0.126036mol/L CaCl₂、0.126036mol/L MnCl₂·4H₂O、0.126036mol/L KCl、0.126036mol/L BaCl₂·2H₂O、0.126036mol/L ZnCl₂、0.126036mol/L CuCl₂、0.126036mol/L FeCl₂·4H₂O、0.126036mol/L FeCl₃·6H₂O，以不加任何金属离子为对照。121°灭菌20min，接入相同体积(2.5mL)的蜜蜂球囊菌菌液，在30℃、150r/min的摇床中培养9h检测酶活性，结果见表3。

(d)维生素对酶产量的影响，在含有蛋白胨8.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，KCl 5g/L，NaNO₃3g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖6.0g/L的培养基中分别添加1mL/L泛酸VB₅、1mL/L吡哆酸VB₆、1mL/L硫胺素VB₁、1mL/L核黄素VB₂、1mL/L抗坏血酸V_C、1mL/L叶酸VB₁₁、1mL/L烟酸VB₃，以不加任何维生素为对照。121°灭菌20min，接入相同体积(2.5mL)的蜜蜂球囊菌菌液，在30℃、150r/min的摇床中培养9h检测酶活性，结果见表4。

(e)pH对酶产量的影响，在含有蛋白胨8.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，KCl 5g/L，NaNO₃3g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，葡萄糖6.0g/L的培养基，分别调节pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9。121°灭菌20min，接入相同体积(2.5mL)的蜜蜂球囊菌菌液，在30℃、150r/min的摇床中培养9h检测酶活性，结果见表5。

表1不同碳源对酶产量的影响

表2不同氮源对酶产量的影响

表3不同金属离子对酶产量的影响

表4不同维生素对酶产量的影响

表5不同pH对酶产量的影响

从表中可以得出最佳的培养基成分为L-阿拉伯糖，酵母浸粉，Mn²⁺，烟酸，pH为7.5接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。

实施例2

正交实验确定最优发酵条件

(1)正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤(1)、(2)。见表5，将相同量的接种量(5％)菌种接种于250mL锥形瓶中，装有50mL培养液，在30℃，转速150r/min下培养培养9h。然后按实施例1步骤(3)、(4)测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表5蜜蜂球囊菌葡甘聚糖酶五因子四水平(4⁵)正交实验设计

表6蜜蜂球囊菌葡甘聚糖酶五因子四水平(4⁵)正交实验设计实验结果

注:Ⅰ1为各因素水平1的所有酶活力之和，Ⅱ2为各因素水平2的所有酶活力之和，Ⅲ3为各因素水平3的所有酶活力之和，Ⅳ4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。表7培养基优化验证试验

正交结果分析表明：最佳因素组合是A₄B₃C₄D₁E₁，即L-阿拉伯糖24g/L，酵母浸粉22g/L，Mn²⁺1.92mol/L，烟酸0.005g/L，pH 7.1，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括L-阿拉伯糖24g/L，酵母浸粉22g/L，Mn²⁺1.92mol/L，烟酸0.005g/L，pH 7.1，即A₄B₃C₄D₁E₁。表6变化因子的极差值R分别为碳源(2405.16)、氮源(1675.59)、金属离子(6756.93)、维生素(1472.6)和pH(1259.67)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与蜜蜂球囊菌产葡甘聚糖酶培养基相关，尤其是金属离子的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言，pH的改变对产酶的影响较小。

实施例3

真菌产葡甘聚糖酶发酵方法

(1)发酵种子的制备

(A)菌种和培养基

菌种：蜜蜂球囊菌

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：PDB培养基。

(B)种子液制备

将斜面上的纯种蜜蜂球囊菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL培养基，然后在30℃(温度较发酵培养同样是为了抑制染菌)，在往复式震荡摇床转速150r/min下培养培养1d，带菌丝生长健壮。

(2)发酵培养

发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即L-阿拉伯糖24g/L，酵母浸粉22g/L，Mn²⁺1.92mol/L，烟酸0.005g/L，pH 7.1，配制。

摇床温度：30℃±0.1℃，

发酵周期：9h，

发酵产生结果蜜蜂球囊菌葡甘聚糖酶为969.59U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（a）将蜜蜂球囊菌接种种子培养基，制得发酵种子液，接种量为10%；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基，接种量5%，于30℃，转速150 r/min下培养9 h。

2.根据权利要求1所述的蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：步骤（1）所述的种子培养基的原料为：将200 g土豆加水750 mL熬汁，加20 g葡萄糖，稀释至1000mL。

3.根据权利要求1所述的蜜蜂球囊菌发酵产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：步骤（2）中所述培养基的原料含有L-阿拉伯糖 3~24g/L，酵母浸粉 5.5~44g/L，Mn²⁺ 0.03~1.92mol/L，烟酸 0.005~0.04g/L，控制培养基pH 为7.1~7.7。

4.根据权利要求3所述的蜜蜂球囊菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法，其特征在于：所述培养基的原料含有L-阿拉伯糖 24g/L，酵母浸粉 22g/L，Mn²⁺ 1.92 mol/L，烟酸 0.005g/L；培养基pH为 7.1。