CN103509769A - 一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法 - Google Patents

一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。所述培养基由麦芽糖、酵母浸粉、Ca2+维生素E组成。该方法通过将种子发酵液接种于培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量5%，于25℃，转速140r/min下培养。本发明的发酵方法包括菌株活化、种子发酵液培养和发酵优化。本发明可大大提高淀粉酶产量。

Description

一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法
技术领域
本发明涉及一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。 
背景技术
淀粉酶（amylase）是水解淀粉和糖原酶类的统称，是能够将淀粉和糖原分子水解为糊精和更小的分子的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。淀粉酶广泛应用于燃料乙醇、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一。 
虽然淀粉酶在动植物中都存在，但是由于提取过程复杂、成本较高，因此工业化比较困难。微生物来源的淀粉酶提取工艺简单、成本低、产量高、 
周期短、性质稳定、使用条件温和，因此微生物来源的淀粉酶在工业上得到了广泛应用，特别是在淀粉水解工业中，几乎完全取代了传统的化学水解法。
    α-淀粉酶是指从淀粉分子内部随机切割α-1,4-糖苷键，生成糊精和还原糖的一类酶，由于生成的产物末端葡萄糖残基C-1碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。产α-淀粉酶的微生物很多，但是研究较多的主要是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、放线菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、假单胞菌等。由于蜂球囊菌生活周期短，能够从其中快速得到α-淀粉酶，以适应工业化大生产和样品提纯，从而可以提高该菌的应用。                    
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法。 
本发明首先提供了一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法，其特征在于，所述培养基的原料含有：麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉1-2 g/100mL，Ca2+3×10-3-6×10-3mol/L，VE 0.005-0.010 g/100mL，pH6.8-7.2。 
优选为按重量分数计，麦芽糖4 g/100mL，酵母浸粉2 g/100mL， Ca2+6×10-3mol/L， VE 0.005 g/100mL，pH 7.0。 
其次，本发明还提供了一种蜂球囊菌发酵产淀粉酶的方法，所述方法包含以下步骤： 
（a）将实验室所保存菌株转接至固体培养基上进行平板活化；
（b）将蜂球囊菌接种于种子培养基，于25℃、转速140 r/min条件下培养培养3天，制得种子发酵液；
（c）将步骤（b）中制得的种子发酵液接种于权利要求1或2所述的培养基中，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量为5%，于25℃、转速140 r/min条件下培养。
所述种子培养基PDA的原料含有：按培养基重量计，马铃薯200g/L，蔗糖20g/L。 
本发明采用的蜂球囊菌（梁勤，陈大福，王建鼎. 营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响. 中国生态农业学报, 2001, 9(4): 31-34）。 
采用本发明优化后的培养基，菌龄3d，发酵周期48h，发酵产生结果蜂球囊菌产淀粉酶为41.55U/mL以上。 
本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌发酵生产淀粉酶的培养基，具有淀粉酶产率高，淀粉酶活力高，淀粉酶活性稳定以及重复性好等优点。 
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 
实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
（1）种子培养基配制：马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min， 6层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。高压灭菌121℃,20min。
（2）种子发酵液的制备：将蜂球囊菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于30℃下培养3d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将蜂球囊菌菌块（0.5×0.5cm）接种至种子培养基，25℃，转速140 r/min下培养72h，即为种子发酵液。 
（3）将上述种子培养基按5%接种量接种至装有50mL发酵培养基的三角瓶中（250mL），25℃，转速140 r/min下培养48h。 
（4）酶液的制备：取步骤（3）中的发酵液在4℃下，5000 r/min离心，10min，得上清液即为粗酶液，4℃保存，备用。 
（5）淀粉酶酶活测定：酶活测定方法采用DNS法。酶活定义为：50 ℃，pH 7.5 条件下每分钟从可溶性淀粉中释放1 μmoL 葡萄糖所需的酶量。 
方法：采用DNS 法测定还原糖的含量，方法是将底物（1 ％的淀粉溶液），即将1 g 淀粉溶于100 mL 的pH 7．5，Tris－HCl 缓冲液中加热使其溶解。 对照组（180 μL 底物，加20 μL 缓冲液，混匀）、样品组（180 μL 底物，加20 μL 步骤（4）所制得的酶液，混匀）。 将样品组、对照组均放入50 ℃水浴锅中保温10 min，取出后各加200 μL 的DNS，沸水浴5 min 后取出，用蒸馏水定容至2.5 mL，混匀后520 nm 紫外光下测OD值。酶活计算公式：A＝（[A1－A0]×K＋C0）×V1×N／（V2×t） 
A——样品酶活（u/mL）A1——样品的吸光度值（OD520值）A0——空白对照的吸光度值（OD520值校准为0）K——p-nitrophenol标准曲线的斜率
C0——p-nitrophenol标准曲线的截距N——稀释倍数V1——反应液的体积（2.5 mL）V2——酶液的体积（0.02 mL）t——反应时间（10 min）
（5）标准曲线的制作：
0 0.2g 0.4g 0.6g 0.8g 1.0g 1.2g
0 0.196 0.424 0.636 0.857 1.068 1.244
在波长520 nm处测定吸光值。以葡萄糖含量为横坐标， OD520值为纵坐标绘制标准曲线。，经统计处理得到的线性回归方程，y=0.094x+0.000，R2=0.999。
（6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产淀粉酶的影响 
（a）碳源对酶产量的影响，在含有蛋白胨10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 1 g，NaCl 1 g，pH 7.4的培养基中分别添加20.0 g／L葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、木糖醇、甘露醇、α-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、甲壳素、糊精、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、柠檬酸，以不加任何碳源为对照。0.1MPa，灭菌20min（下同）。各接入5%的种子发酵液，在25℃、140r/min的摇床中培养48h测酶活，结果见表1。
（b）氮源对酶产量的影响，在含有：可溶性淀粉20 g， K2HPO4 1 g，NaCl 1 g，pH 7.4的培养基中分别添加15 g／L的胰蛋白胨、酵母浸粉、甘氨酸、过硫酸铵、蛋白胨、尿素、酸水解酪蛋白、NH4NO3、NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、（NH4）2HPO4，以不加任何氮源为对照。灭菌，各接入5%的种子发酵液，在25℃、140r/min的摇床中培养48h检测酶活性，结果见表2。 
（c）金属离子对产酶的影响，在含有可溶性淀粉20 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，pH7.4的培养基分别添加0.03mol/L（以6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来）KCl、MgCl2·6H2O、NaCl、ZnCl2、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、CaCl2、FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O 、BaCl2·2H2O，以不加任何金属离子为对照。灭菌，各接入5%的种子发酵液，在25℃、140r/min的摇床中培养48h检测酶活性，结果见表3。 
（d）维生素对酶产量的影响，在含有可溶性淀粉20 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 1 g，NaCl 1 g ，pH7.4的培养基中分别添加0.02%叶酸、烟酸、硫胺素VB1、VB4、核黄素VB2、吡哆醇类VB6、抗坏血酸VC、VE，以不加任何维生素为对照。灭菌，各接入5%的种子发酵液，在25℃、140r/min的摇床中培养48h检测酶活性，结果见表4。 
（e）pH对酶产量的影响，在含有可溶性淀粉20 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，K2HPO4 1 g，NaCl 1 g 的培养基中分别调pH值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，以不调节pH值（7.5）为对照。灭菌，各接入5%的种子发酵液，在25℃、140r/min的摇床中培养48h检测酶活性，结果见表5。 
  
Figure DEST_PATH_RE-DEST_PATH_IMAGE001
 
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE003
.
Figure DEST_PATH_RE-DEST_PATH_IMAGE004
从表中可以得出最佳的培养基成分为麦芽糖，酵母浸粉，Ca2+，VE，pH7.0，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。
  
实施例2
正交实验确定最优发酵条件
（1）正交实验确定最佳培养基
在单因素实验确定的培养基基础上，改变各成分的浓度，和pH值，配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表6，将相同量的接种量（5%）菌种接种于250mL，装有50mL培养液，在25℃，转速140 r/min下培养培养48h。然后按实施例1步骤（4）、（5）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。
 
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE006
注:Ij 为各因素水平1的所有酶活力之和，Ⅱj 为各因素水平2的所有酶活力之和，Ⅲj为各因素水平3的所有酶活力之和，Ⅳj为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。
Figure DEST_PATH_RE-DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_RE-DEST_PATH_IMAGE009
正交结果分析表明：最佳因素组合是A4B4C3D1E2，即麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，Ca2+6×10-3mol/L，VE 0.005 g/100mL，pH7.0，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉2 g/100mL，Ca2+6×10-3mol/L，VE 0.005 g/100mL，pH7.0，即A4B4C3D1E2。表7变化因子的极差值R分别为碳源(113.64)、氮源(23.47)、金属离子(23.24)、维生素(20.13和pH(21.77)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与蜂球囊菌产淀粉酶培养基相关，其中碳源的变化对该菌产酶的影响相对其他因素影响要大。相对而言，维生素的改变对产酶的影响较小。 
  (2)正交实验确定最优培养条件
在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，菌龄，培养时间，在25℃，转速140 r/min下培养，各组号的培养时间以表10为准。然后按实施例1步骤（4）、（5）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。
 
Figure DEST_PATH_741174DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_DEST_PATH_IMAGE011
Figure DEST_PATH_384645DEST_PATH_IMAGE012
实施例3
真菌产淀粉酶发酵方法
（1）   发酵种子的制备
（A）菌种和培养基
菌种：蜂球囊菌斜面培养基：PDA培养基
液体种子培养基：PDB培养基。
（B）种子液制备
将斜面上的纯种蜂球囊菌转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL培养基，然后在25℃(温度较低发酵培养同样是为了抑制染菌)，在往复式震荡摇床转速140 r/min下培养培养72h，待菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。
此外接种前可在种子液中加入抗生素，杀灭或者抑制杂菌的生长，从而获得不带杂菌的纯种菌种。 
（2）   发酵培养
发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，Ca2+6×10-3mol/L，VE 0.005 g/100mL，pH7.0配制。
将上一步骤中制备的蜂球囊菌接种于发酵种子液，接种量5%接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液， 
摇床温度：25℃±1℃，摇床转速：140r/min。
发酵周期：48h， 
发酵产生结果蜂球囊菌产淀粉酶为41.55U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。 

Claims (5)

1.一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的培养基及方法，其特征在于，所述培养基的原料含有：麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉1-2g/100mL，Ca2+3×10-3-6×10-3mol/L，VE0.005-0.010g/100mL，pH6.8-7.2。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的原料优选为按重量分数计，麦芽糖4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，Ca2+6×10-3mol/L，VE0.005g/100mL，pH7.0。
3.一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(a)将实验室所保存菌株转接至固体培养基上进行平板活化。
(b)将蜂球囊菌接种于种子培养基，于25C、转速140r/min条件下培养培养3天，制得种子发酵液；
(c)将步骤(b)中制得的种子发酵液接种于如权利要求1所述的培养基中，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量为5％，于25℃±1℃、转速140r/min条件下培养。
4.如权利3所述一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，所述种子培养基为PDA，其原料含有：按培养基重量计，马铃薯200g/L，蔗糖20g/L。
5.如权利3所述一种蜂球囊菌发酵高产淀粉酶的方法，其特征在于，步骤(c)的培养时间为2天。
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