CN111505191A - 基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法 - Google Patents

基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，该指纹图谱检测方法包括以下步骤：取绿原酸配制对照品溶液，取低糖型强力枇杷露配制供试品溶液；其中，色谱条件包括：以甲醇和0.02mol/L磷酸氢二钾溶液为流动相分别将所述对照品溶液和供试品溶液过Agilent Eclipse Pluc C18色谱柱并进行梯度洗脱；本发明提供的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法能够有效地对产品进行表征，有利于全面监控产品的质量，避免了低糖型强力枇杷露质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性；本发明提供的低糖型强力枇杷露指纹图谱检测方法，所得指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠，30min即可完成检测。

Description

基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，特别涉及基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法。
背景技术
强力枇杷露包括枇杷叶、罂粟壳、白前、桑白皮、百部、桔梗和薄荷脑七味中药，为淡棕色澄清液体，具有养阴敛肺，镇咳祛痰的作用，常用语久咳劳嗽和支气管炎等，目前，强力枇杷露现行的指纹图谱检测方法不适用于低糖型强力枇杷露，由于糖份的变化，导致已知的指纹图图谱体系的系统适用性较差，很多峰受到干扰，还存在特征峰较少、分离度小、检测时间较长的问题，缺乏对产品质量的全面控制。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法包括以下步骤：
取绿原酸配制对照品溶液，取低糖型强力枇杷露配制供试品溶液；
其中，色谱条件包括：以甲醇和0.02mol/L磷酸氢二钾溶液为流动相分别将所述对照品溶液和供试品溶液过Agilent Eclipse Pluc C18色谱柱并进行梯度洗脱，并且在所述梯度洗脱的过程中控制所述甲醇的体积，使得所述甲醇的体积占所述流动相总量的百分比按照以下比例增加；
在梯度洗脱所述对照品和所述供试品时：
t＝0min-5min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为9％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为91％；
t＝5min-19min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为10％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为90％；
t＝19min-24min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为15％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为85％；
t＝24min-30min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为20％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为80％。
2.进一步地，该低糖型强力枇杷露包括枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗和薄荷脑，制备方法如下：中药组合物除薄荷脑外，其余六味加水煎煮两次，加水量为以上六味中药总重量的8倍，每次2小时，合并煎液，滤过，浓缩，干燥，放入用于承载中药组合物的低糖型掩味载药系统，加热至沸，保持20分钟，静置滤过，加入薄荷脑，搅拌均匀，静置，滤过，混匀，即得低糖型强力枇杷露；
所述用于承载中药组合物的低糖型掩味载药系统主要由蔗糖、纳豆菌提取液、米提取液和水组成，各成分在水中的浓度为：蔗糖8-10g/ml、纳豆菌提取液4％-6％、米提取液2％-3％，所述中药组合物与所述低糖型掩味载药系统的质量比为15-20:80-120，所述纳豆菌提取液的制备方法如下：将纳豆菌活化后接种于液体培养基上，培养后，将菌悬液分离，收集上清液，过滤除菌，母液冻干即得纳豆菌提取物；
米提取液是将大米和紫米进行发酵制得，发酵方法如下：
取质量比为4-6:15-20的大米和紫米混合均匀，粉碎至过80-200目筛，加入清水搅拌均匀，清水的质量为大米和紫米质量的和的12-15倍，再加入β-淀粉酶搅拌均匀，每克大米和紫米的混合物添加18-20个单位的β-淀粉酶，调节pH为5-5.5，在温度为95-98℃条件下保持1-1.5h，再调节pH为3.5-4，在温度为80-85℃条件下保持2-3h，再加入淀粉葡萄糖苷酶，每克大米和紫米的混合物添加50-70个单位的淀粉葡萄糖苷酶，调节温度至60-70℃，pH不变，保持6-8h，取出，在90-92℃条件下灭菌15-20min，冷却至室温，接种松乳菇菌，在温度为25-30℃、转速为80-90r/min条件下培养50-70h制得发酵液，将发酵液经菌丝体胶体磨磨浆得营养浆液，过滤、冻干，即得米提取液。
进一步地，对照品溶液的配制方法为：对照品溶液的配制方法为：取绿原酸对照品，用15％的甲醇制成浓度为0.020mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
进一步地，供试品溶液的配制方法为：取低糖型强力枇杷露，用乙酸乙酯溶液每次15ml萃取3次，取萃取液放置于处理好的C18固相萃取柱上，加水洗脱，再用浓度为15％的甲醇洗脱，收集水洗脱液和甲醇洗脱液，合并，蒸干，残渣加浓度为15％的甲醇溶液，定量转移至5ml容量瓶中，用浓度为15％的甲醇定容，摇匀、滤过，取续滤液，即得。
进一步地，高效液相色谱的色谱柱的柱温为35℃，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm。
进一步地，色谱柱为Agilent Eclipse Pluc C18色谱柱。
其中，色谱柱的大小为4.6×250mm，5μm。
进一步地，用所述指纹图谱检测方法检测的低糖型强力枇杷露的相似度在0.90以上。
进一步地，检测方法为：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录2分钟-30分钟的色谱峰，即得。
本发明还提供了一种低糖型强力枇杷露的检测方法，该方法包括以下步骤：
按照基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法建立低糖型强力枇杷露的标准图谱；
将待检测的低糖型强力枇杷露样品按照所述基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法进行检测，获得高效液相图谱，以建立待检测低糖型强力枇杷露样品的指纹图谱；
将低糖型强力枇杷露样品的指纹图谱与标准图谱进行对比，通过图谱中的色谱峰参数来评价或控制低糖型强力枇杷露的质量。
本发明提供的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法能够有效地对产品进行表征，有利于全面监控产品的质量，本发明建立了低糖型强力枇杷露HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了12个共有峰，建立的指纹图谱技术含量高，12个共有峰中4号峰为药材百部的特征性成分；5号峰为药材百部的特征性成分；8号峰为药材金银花的特征性成分绿原酸；10号峰为药材桑白皮的特征性成分；避免了低糖型强力枇杷露质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性；本发明提供的低糖型强力枇杷露指纹图谱检测方法，所得指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠，30min即可完成检测。
附图说明
图1.为本发明的低糖型强力枇杷露的共有指纹图谱；
图2a-f.为本发明的低糖型强力枇杷露的精密度HPLC指纹图谱；
图3a-f.为本发明的低糖型强力枇杷露的重复性HPLC指纹图谱；
图4a-f.为本发明的低糖型强力枇杷露的稳定性HPLC指纹图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的具有特征性的某类或者数类成分的色谱谱图，在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或者中成药的质量具有很重要的意义。
下面对本发明实施例的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法进行具体说明。
实施例1
本实施例的低糖型强力枇杷露组分包括枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗和薄荷脑；
本实施例的低糖型强力枇杷露指纹图谱的检测方法如下：
A.配制对照品溶液：取绿原酸对照品，用15％的甲醇制成浓度为0.020mg/ml的溶液，即得对照品溶液；
B.配制供试品溶液：取低糖型强力枇杷露，用乙酸乙酯溶液每次15ml萃取3次，取萃取液放置于处理好的C18固相萃取柱上，加水洗脱，再用浓度为15％的甲醇洗脱，收集水洗脱液和甲醇洗脱液，合并，蒸干，残渣加浓度为15％的甲醇溶液，定量转移至5ml容量瓶中，用浓度为15％的甲醇定容，摇匀、滤过，取续滤液，即得；
C.测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录2分钟-30分钟的色谱峰，高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇和0.02mol/L磷酸氢二钾溶液为流动相，梯度洗脱，流动相甲醇和0.02mol/L磷酸氢二钾溶液的比例变化如下：
t＝0min-5min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为9％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为91％；
t＝5min-19min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为10％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为90％；
t＝19min-24min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为15％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为85％；
t＝24min-30min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为20％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为80％；
高效液相色谱的色谱柱的柱温为35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm-325nm；
理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于50000；
用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得低糖型强力枇杷露的指纹图谱，图谱中有12个共有峰，由这12个共有峰构成低糖型强力枇杷露的指纹特征，作为低糖型强力枇杷露的标准指纹图谱，见图1。
实施例2
本实施例的低糖型强力枇杷露组分包括枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗和薄荷脑；
供试品溶液的制备：用乙酸乙酯溶液每次15ml萃取3次，取萃取液放置于处理好的C18固相萃取柱上，加水洗脱，再用浓度为15％的甲醇洗脱，收集水洗脱液和甲醇洗脱液，合并，蒸干，残渣加浓度为15％的甲醇溶液，定量转移至5ml容量瓶中，用浓度为15％的甲醇定容，摇匀、滤过，取续滤液，即得；
精密度试验：取绿原酸，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积比值RSD小于2.0％，利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点矫正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，结果见图2a-f；相似度分别为98.5％、98.7％、97.9％、98.4％、97.7％、97.7％。
重复性试验：精密称取同一批低糖型强力枇杷露6份，按照以上方法制备供试品溶液，分别进样，对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积比值RSD小于2.0％，利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点矫正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，结果见图3a-f；相似度分别为98.5％、98.6％、95.8％、98.3％、98.7％、99.1％。
稳定性试验：精密称取低糖型强力枇杷露1份，按以上方法制备供试品溶液，分别在时间0.2、4、8、16、24、48h进样分析，对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积比值RSD小于2.0％，利用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将HPLC图谱导入，经多点矫正和数据匹配，以平均数法生成对照图谱，结果见图4a-f，相似度分别为97.5％、97.9％、98.5％、98.9％、98.4％、98.7％。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱检测方法包括以下步骤：
取绿原酸配制对照品溶液，取低糖型强力枇杷露配制供试品溶液；
其中，色谱条件包括：以甲醇和0.02mol/L磷酸氢二钾溶液为流动相分别将所述对照品溶液和供试品溶液过Agilent Eclipse Pluc C18色谱柱并进行梯度洗脱，并且在所述梯度洗脱的过程中控制所述甲醇的体积，使得所述甲醇的体积占所述流动相总量的百分比按照以下比例增加；
在梯度洗脱所述对照品和所述供试品时：
t＝0min-5min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为9％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为91％；
t＝5min-19min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为10％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为90％；
t＝19min-24min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为15％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为85％；
t＝24min-30min时，所述甲醇占所述流动相总体积的百分比为20％，所述0.02mol/L磷酸氢二钾溶液占所述流动相总体积的百分比为80％。
2.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述低糖型强力枇杷露包括枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗和薄荷脑，所述低糖型强力枇杷露的制法如下：中药组合物除薄荷脑外，其余六味加水煎煮两次，加水量为以上六味中药总重量的8倍，每次2小时，合并煎液，滤过，浓缩，干燥，放入用于承载中药组合物的低糖型掩味载药系统，加热至沸，保持20分钟，静置滤过，加入薄荷脑，搅拌均匀，静置，滤过，混匀，即得低糖型强力枇杷露；
所述用于承载中药组合物的低糖型掩味载药系统主要由蔗糖、纳豆菌提取液、米提取液和水组成，各成分在水中的浓度为：蔗糖8-10g/ml、纳豆菌提取液4％-6％、米提取液2％-3％，所述中药组合物与所述低糖型掩味载药系统的质量比为15-20:80-120，所述纳豆菌提取液的制备方法如下：将纳豆菌活化后接种于液体培养基上，培养后，将菌悬液分离，收集上清液，过滤除菌，母液冻干即得纳豆菌提取物；
米提取液是将大米和紫米进行发酵制得，发酵方法如下：
取质量比为4-6:15-20的大米和紫米混合均匀，粉碎至过80-200目筛，加入清水搅拌均匀，清水的质量为大米和紫米质量的和的12-15倍，再加入β-淀粉酶搅拌均匀，每克大米和紫米的混合物添加18-20个单位的β-淀粉酶，调节pH为5-5.5，在温度为95-98℃条件下保持1-1.5h，再调节pH为3.5-4，在温度为80-85℃条件下保持2-3h，再加入淀粉葡萄糖苷酶，每克大米和紫米的混合物添加50-70个单位的淀粉葡萄糖苷酶，调节温度至60-70℃，pH不变，保持6-8h，取出，在90-92℃条件下灭菌15-20min，冷却至室温，接种松乳菇菌，在温度为25-30℃、转速为80-90r/min条件下培养50-70h制得发酵液，将发酵液经菌丝体胶体磨磨浆得营养浆液，过滤、冻干，即得米提取液。
3.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的配制方法为：取绿原酸对照品，用15％的甲醇制成浓度为0.020mg/ml的溶液，即得对照品溶液。
4.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的配制方法为：取低糖型强力枇杷露，用乙酸乙酯溶液每次15ml萃取3次，取萃取液放置于处理好的C18固相萃取柱上，加水洗脱，再用浓度为15％的甲醇洗脱，收集水洗脱液和甲醇洗脱液，合并，蒸干，残渣加浓度为15％的甲醇溶液，定量转移至5ml容量瓶中，用浓度为15％的甲醇定容，摇匀、滤过，取续滤液，即得。
5.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱的柱温为35℃，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm。
6.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent Eclipse Pluc C18色谱柱。
7.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，用所述指纹图谱检测方法检测的低糖型强力枇杷露的相似度在0.90以上。
8.如权利要求1所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述检测方法为：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录2分钟-30分钟的色谱峰，即得。
9.一种低糖型强力枇杷露的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
按照权利要求1-8任一项所述的基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法建立低糖型强力枇杷露的标准图谱；
将待检测的低糖型强力枇杷露样品按照所述基于高效液相色谱的低糖型强力枇杷露的指纹图谱检测方法进行检测，获得高效液相图谱，以建立待检测低糖型强力枇杷露样品的指纹图谱；
将低糖型强力枇杷露样品的指纹图谱与标准图谱进行对比，通过图谱中的色谱峰参数来评价或控制低糖型强力枇杷露的质量。
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