CN111812247B - 一种五味温通除痹胶囊质量评价方法 - Google Patents
一种五味温通除痹胶囊质量评价方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种五味温通除痹胶囊质量评价方法，选择香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2‑甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共计15种成分作为该复方的质量标志物；进行全波长扫描检测，选择在203nm和270nm两种波长下对WWCC(五味温通除痹胶囊)进行UHPLC质量评价；建立并验证该分析方法后，对WWCC样品中的15种质量标志物进行了定量分析，并构建270nm下WWCC指纹图谱，完成对WWCC样品的整体质量评价。这种方法为WWCC综合质量评价提供了独特的思路，为中药复方整体质量评价提供了借鉴与示范作用。
Description
技术领域
本发明属于中药复方质量评价技术领域，具体是涉及一种五味温通除痹胶囊质量评价方法。
背景技术
几千年来，中药在亚洲许多国家，特别是中国，被广泛用于预防和治疗各种疾病。它们的治疗效果归功于从单味中药或复方中药中提取的大量生物活性成分。然而，这些生物活性成分尚未完全阐明。目前，中药复方质量控制的定量分析多采用化学成分，而非潜在的生物活性成分。因此，在质量评价中，迫切需要开发一种适合于寻找生物活性成分而不是化学特征的方法，以保证临床疗效和安全性。然而，由于中药成分的多样性和复杂性，其活性成分的筛选和分析面临诸多挑战。令人欣慰的是，血清药物化学结合超高液相色谱四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)技术为研究中药复杂成分提供了契机。
中药复方五味温通除痹胶囊(Wuwei-Wentong-Chubi Capsule，WWCC)是由茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄和黄芩共5味中药组成，已被国家知识产权局授予专利(专利号：ZL201110095704.8)。类风湿关节炎(RA)属于中医“痹证”范畴，是一种自身免疫性疾病，可引起关节疼痛、肿胀、僵硬，甚至丧失功能，严重影响人体健康。“脾虚湿盛、气血亏虚、阳虚寒凝、痰瘀互结”是RA的中医证候学特征，“寒湿闭阻”是其常见证型。基于“健脾化湿，温阳通络”治则，安徽中医药大学附属第一医院应用WWCC治疗RA患者，其临床症状明显改善。
采用超高效液相色谱(UHPLC)联用紫外(UV)检测器和/或质谱(MS)检测器对中药复方进行质量评价，已被证明是一种普遍而有效的方法。然而，越来越多的研究者认为，中药质量评价的质量标志物应该从在服用汤剂后对治疗效果起主要作用的入血成分中选择，而非从药材本身所含的化学成分中选择。因此，本发明在UHPLC-UV和UHPLC-QTOF-MS技术的基础上，结合血清药物化学，建立了新的定性定量分析策略，实现了复方WWCC全面、综合、可靠的质量评价方法，为临床用药和新药开发提供了进一步的参考。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种利用15种质量标志物通过UHPLC指纹图谱分析评价五味温通除痹胶囊质量的方法。
本发明所采用的技术方案为：一种五味温通除痹胶囊质量评价方法，步骤如下：
(1)质量标志物的选定
选定香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共计15种物质作为质量标志物；
(2)15种质量标志物的全波长扫描
先用空白溶液将UV-2550分光光度计调零，然后将制备的15种标准品母液稀释至适当浓度后，进行全波长扫描检测，得到其吸光度数据；综合15种标准物质的最大吸收波长数据，最终选择203nm和270nm两种波长对复方WWCC进行全面的质量评价；
(3)UHPLC-UV分析方法的建立
样品分析采用UHPLC系统，配备自动进样器、泵、柱温箱、紫外检测器，使用Eclipse型C18柱(1.8μm，2.1mm×100mm，Agilent)，流速为0.4mL/min；柱温和样品室温度分别保持在25℃和10℃；进样量为1μL；
系统I：针对除了茯苓酸之外14种质量标志物，紫外检测器在270nm处进行检测，UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，15％B；7-12min，20％B；14-19min，23％B；25-30min，28％B；32-37min，35％B；39-44min，44％B；49-54min，62％B；55-59min，100％B，59min后停止，平衡系统4min后再进样；
系统II：针对茯苓酸，紫外波长设置为203nm，UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，30％B；6-9min，62％B；10-16min，23％B；16min后停止，平衡系统3min后再进样；
(4)UHPLC-UV分析方法的验证
利用步骤(3)的分析方法，建立线性回归方程，确定检出限和定量限，同时，开展精密度、重复性、稳定性和回收率测试，进行方法学验证，综合评价分析方法的可靠性；
(5)WWCC样品的分析
采用所建立的UHPLC-UV法对多批WWCC样品中的15种质量标志物进行了定量测定，在270nm下对WWCC进行指纹分析，构建其指纹图谱，完成对WWCC的全面质量评价。
本发明的有益效果表现在：
1)、本发明所提出的基于血清药物化学、超高液相色谱四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)结合UHPLC-UV指纹分析技术，是一种新颖的定性和定量方法，可实现五味温通除痹胶囊(WWCC)全面、综合、可靠的质量评价。
2)、本发明取佐剂性关节炎(AA)大鼠给予一定量WWCC灌胃12天后的血样，采用UHPLC-QTOF-MS技术进行分析。根据13种标准品的色谱质谱信息和裂解规律，对大鼠血清中的91种主要成分进行了鉴定和分类。最终靶向香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共15种入血成分作为优选的质量标志物。在定量分析中，选择了上述15种质量标志物，并建立了一种双波长(203nm和270nm)下的UHPLC-UV方法。同时，针对建立的方法进行了日内和日间精密度、重复性和稳定性考察，结果表明相对标准偏差均较低。15种质量标志物在该研究的浓度范围内均表现出良好的线性关系，平均回收率为95.25％～104.53％。
3)、本发明建立了12批WWCC样品的UHPLC指纹图谱。结果表明，12批WWCC样品的相似度均在0.998以上。这种质量评价方法为WWCC综合质量评价提供了独特的思路，也为中医其他复方研究和临床应用提供了进一步的参考和启示。
附图说明
图1是追踪五味温通除痹胶囊入血成分方法(A)、五味温通除痹胶囊质量评价方法(B)的步骤流程图。
图2是正离子模式下，WWCC提取物(A)、大鼠对照组(B)，AA大鼠模型组(C)和WWCC治疗组(D)的总离子流图(QTOF-MS-TIC)。
图3是负离子模式下，WWCC提取物(A)、大鼠对照组(B)，AA大鼠模型组(C)和WWCC治疗组(D)的总离子流图(QTOF-MS-TIC)。
图4是肉桂醇(峰72)、肉桂酸(峰64)和肉桂醛(峰68)的[M+H]+离子一级质谱MS1(A1-C1)和二级质谱MS2(A2-C2)。
图5是肉桂醇(A，峰72)、肉桂酸(B，峰64)和肉桂醛(C，峰68)的[M+H]+离子的MS裂解途径。
图6是黄芩素(峰71)，黄芩苷(峰53)，汉黄芩素(峰81)和汉黄芩苷(峰66)的[M+H]+离子一级质谱MS1(A1-D1)和二级质谱MS2(A2-D2)。
图7是黄芩素(A，峰71)，黄芩苷(B，峰53)，汉黄芩素(C，峰81)和汉黄芩苷(D，峰66)的[M+H]+离子的MS裂解途径。
图8是黄芩素(峰71)，黄芩苷(峰53)，汉黄芩素(峰81)和汉黄芩苷(峰66)的[M-H]-离子一级质谱MS1(A1-D1)和二级质谱MS2(A2-D2)。
图9是黄芩素(A，峰71)，黄芩苷(B，峰53)，汉黄芩素(C，峰81)和汉黄芩苷(D，峰66)的[M-H]-离子的MS裂解途径。
图10是脱水淫羊藿素(A，峰87)，宝藿苷I(B，峰82)，淫羊藿苷(C，峰62)和朝藿定C(D，峰60)的[M+H]+离子一级质谱MS1(A1-D1)和二级质谱MS2(A2-D2)。
图11是脱水淫羊藿素(A，峰87)，宝藿苷I(B，峰82)，淫羊藿苷(C，峰62)和朝藿定C(D，峰60)的[M+H]+离子的MS裂解途径。
图12是脱水淫羊藿素(A，峰87)，宝藿苷I(B，峰82)，淫羊藿苷(C，峰62)和朝藿定C(D，峰60)的[M-H]-或[M+HCOO]-离子一级质谱MS1(A1-D1)和二级质谱MS2(A2-D2)。
图13是脱水淫羊藿素(A，峰87)，宝藿苷I(B，峰82)，淫羊藿苷(C，峰62)和朝藿定C(D，峰60)的[M-H]-或[M+HCOO]-离子的MS裂解途径。
图14是茯苓酸(峰90)的[M+H]+离子和[M-H]-离子一级质谱MS1(A1-B1)和二级质谱MS2(A2-B2)。
图15是茯苓酸(峰90)的[M+H]+离子和[M-H]-离子的MS裂解途径。
图16是吉马酮(峰88)的[M+H]+离子一级质谱MS1(A1)和二级质谱MS2(A2)。
图17是吉马酮(峰88)的[M+H]+离子的MS裂解途径。
图18是15种质量标志物的结构式。
图19是15种质量标志物的全波长紫外吸收图。
图20是15种质量标志物的UHPLC初始色谱图。
图21是WWCC提取物和茯苓酸标准品的UHPLC色谱图。
图22是WWCC提取物、标准品混合溶液和除茯苓酸之外14种标准品的UHPLC色谱图。
图23是12批WWCC样品在270nm处的UHPLC谱图。
图24是在270nm处WWCC样品指纹图谱的共有模式图。
具体实施方式
请参阅图1所示的步骤流程图，本发明首先结合血清药物化学和UHPLC-QTOF-MS技术追踪五味温通除痹胶囊入血成分，然后从入血成分中靶向了15种质量标志物，并对五味温通除痹胶囊的质量作出科学评价。
一、结合血清药物化学和UHPLC-QTOF-MS技术追踪五味温通除痹胶囊(WWCC，由茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄和黄芩组成)入血成分并靶向其质量标志物的方法
(1)利用茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄和黄芩5味中药按处方比例制备复方WWCC，并将WWCC提取物制成冻干粉，用于大鼠灌胃和后期样品分析。
(2)动物模型构建与给药
选取SPF级雄性SD大鼠，于右后足趾皮内注射FCA复制佐剂性关节炎(AA)大鼠模型。WWCC治疗组于注射FCA后第12天进行实验，WWCC汤剂连续灌胃12天。对照组和模型组大鼠给予等量0.9％生理盐水。
(3)血清样本的收集与处理
末次给药后8h，用异氟醚对大鼠进行深度麻醉，腹主动脉采血，室温静置1-2h后离心，取上清液，-80℃储存，备用。分析前，将血清样品与甲醇-乙酸乙酯混合均匀，离心，浓缩干燥处理。干燥后的样品使用甲醇复溶，取2μL试样用于UHPLC-QTOF-MS分析。
(4)基于UHPLC-QTOF-MS技术进行血清成分定性分析
①色谱条件
色谱分析流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈。
梯度洗脱程序为：0-1min，10％B；5-8min，15％B；10-15min，22％B；18-21min，35％B；22-24min，70％B；25-27min，95％B；28-30min，10％B，流速为0.25mL/min。
②质谱条件
质谱分析在正、负离子模式下进行，扫描范围为m/z 50～1200，数据采集速率为0.5s。毛细管电压为2.5kV(ESI+)或2.0kV(ESI-)，源温度为120℃(+)或110℃(-)，锥孔电压为40kV。此外，脱溶剂气流温度为350℃，锥孔气流量为50L/h。
通过锁定喷雾实时调节QTOF-MS中获得的所有离子的质荷比(m/z)，选取亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量化合物，进行正离子模式([M+H]+：m/z 556.2771)和负离子模式([M-H]-：m/z554.2615)检测。
③标准品UHPLC-QTOF-MS分析
选择肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸作为中药桂枝中苯丙素类化合物代表性组分，选择黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷作为中药黄芩中5,7-二羟基异黄酮类化合物代表性组分，选择脱水淫羊藿素、宝藿苷I、朝藿定C以及淫羊藿苷作为中药淫羊藿中8-异戊烯基异黄酮类化合物代表性组分，选择茯苓酸作为中药茯苓中四环三萜酸类化合物代表性组分，选择吉马酮作为中药片姜黄中倍半萜类化合物代表性组分。
取13种标准物质在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测，记录各标准品的保留时间信息，并通过质谱裂解碎片信息分析，总结出不同类型化合物的裂解规律。
④血清样品UHPLC-QTOF-MS分析
将各组血清样品、复方WWCC提取物分别在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测。根据测量值与理论值偏差小于10ppm，同位素拟合程度小于1.0的原则，利用质谱仪自带的质量体系元素组成计算工具，得到各谱峰对应的分子式。最后通过标准品碎片裂解规律和数据相结合，鉴定出复方WWCC入血成分，并从中选择代表性成分作为质量标志物。
二、五味温通除痹胶囊质量评价方法
(1)质量标志物的选定
选定香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共计15种物质作为质量标志物。
(2)15种质量标志物的全波长扫描
先用空白溶液将UV-2550分光光度计调零，然后将制备的15种标准品母液稀释至适当浓度后，进行全波长扫描检测，得到其吸光度数据。综合15种标准物质的最大吸收波长数据，最终选择203nm和270nm两种波长对复方WWCC进行全面的质量评价。
(3)UHPLC-UV分析方法的建立
样品分析采用UHPLC系统，配备自动进样器、泵、柱温箱、紫外检测器，使用Eclipse型C18柱(1.8μm，2.1mm×100mm，Agilent)，流速为0.4mL/min。柱温和样品室温度分别保持在25℃和10℃；进样量为1μL。
系统I：针对除了茯苓酸之外14种质量标志物，紫外检测器在270nm处进行检测，UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，15％B；7-12min，20％B；14-19min，23％B；25-30min，28％B；32-37min，35％B；39-44min，44％B；49-54min，62％B；55-59min，100％B，59min后停止，平衡系统4min后再进样。
系统II：针对茯苓酸，紫外波长设置为203nm，UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，30％B；6-9min，62％B；10-16min，23％B；16min后停止，平衡系统3min后再进样。
(4)UHPLC-UV分析方法的验证
利用步骤(3)的分析方法，建立线性回归方程，确定检出限和定量限，同时，开展精密度、重复性、稳定性和回收率测试，进行方法学验证，综合评价分析方法的可靠性。
(5)WWCC样品的分析
采用所建立的UHPLC-UV法对多批WWCC样品中的15种质量标志物进行了定量测定，在270nm下对WWCC进行指纹分析，构建其指纹图谱，完成对WWCC的全面质量评价。
下面结合具体实施例对本发明作出进一步的详述：
1.1材料和试剂
茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄、黄芩药材购自安徽中医药大学第一附属医院中草药房。色谱用甲醇和乙腈来自德国默克公司；实验用去离子水采用milli-Q净化系统(美国密理博公司)；标准品(黄芩苷、朝藿定C、汉黄芩苷、黄芩素、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸)是购自上海源叶生物技术有限公司，标准品(香豆素、肉桂酸、肉桂醛、肉桂醇、淫羊藿苷)购自上海麦克林生化科技有限公司。各标准品纯度均在97％以上，适用于UHPLC-UV和UHPLC-QTOF-MS分析。
1.2动物与实验设计
1.2.1动物
该方案获得了安徽中医药大学动物实验伦理委员会的批准。SPF级雄性SD大鼠，体重200±20g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可证号：SCXK-2019-003)。大鼠在18-22℃、相对湿度(40-60％)、12h明暗循环、自由采食、饮水条件下进行饲养，同时将环境噪声控制在最低限度。
1.2.2实验设计
WWCC提取物冻干粉的配制：按WWCC处方，茯苓15.0g，桂枝10.0g，淫羊藿10.0g，片姜黄9.0g，黄芩5.0g，共49.0g药材浸泡在392mL乙醇-水中(90∶10，v/v)。将混合溶液加热回流提取1h，用布克纳漏斗进行过滤。再用392mL 90％乙醇回流提取残渣，过滤。将两次过滤后的溶液在真空中浓缩至快干，在-80℃下冷藏24h，真空冷冻48h后制备WWCC提取物冻干粉。
动物组的处理：大鼠随机分为对照组、AA模型组和WWCC治疗组(n＝10)。0.1mL弗氏完全佐剂(FCA，购自美国西格玛公司，密苏里州圣路易斯城)于右后足趾皮内注射，复制AA动物模型。
WWCC治疗组于注射FCA后第12天灌胃汤剂，即将WWCC提取物冻干粉重新溶于0.9％生理盐水中，给药剂量为1.6g/kg，每天1次，连续灌胃12天。对照组和模型组大鼠给予等量0.9％生理盐水。
1.2.3血清样品的收集和制备
第24天，用异氟醚(3mL/kg)对大鼠进行深度麻醉。腹主动脉采血，在室温静置1-2h，13000rpm离心5min，取上清液，-80℃储存，备用。
分析前，取200μL血清样品与4mL甲醇-乙酸乙酯(1∶1，v/v)混合均匀，13000rpm离心3次，在恒温氮气作用下，55℃浓缩干燥处理。干燥后的样品使用0.5mL甲醇复溶，取2μL试样用于UHPLC-QTOF-MS分析。
1.3基于UHPLC-QTOF-MS技术进行血清成分定性分析
1.3.1 UHPLC-QTOF-MS条件
首先用超高效液相色谱法分离大鼠血清中的成分，再用QTOF-MS进行分析。为提高分离效果，对色谱条件以及仪器参数等进行了优化。
色谱条件：
色谱柱：Eclipse Plus C18柱(安捷伦公司，尺寸2.1mm×100mm，1.8μm)。柱温和自动进样器温度分别维持在25℃和10℃。流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈。优化后的UHPLC系统运行梯度洗脱程序为：0-1min，10％B；5-8min，15％B；10-15min，22％B；18-21min，35％B；22-24min，70％B；25-27min，95％B；28-30min，10％B，流速为0.25mL/min。
质谱条件：
仪器采用ACQUITY I超高效液相色谱分析系统，与Xevo G2-XS QTOF-MS检测器(美国马萨诸塞州米尔福德沃特斯公司)相结合。质谱分析在正、负离子模式下进行，扫描范围为m/z50～1200，数据采集速率为0.5s。
优化的QTOF-MS条件为：毛细管电压为2.5kV(ESI+)或2.0kV(ESI-)，源温度为120℃(+)或110℃(-)，锥孔电压为40kV。此外，脱溶剂气流温度为350℃，锥孔气流量为50L/h。
首先以较低的碰撞能量(10V)收集完整的前体离子信息，通过较高的碰撞能量(20～40V)轰击后，前体离子裂解获取碎片离子数据。为保证准确性，通过锁定喷雾实时调节QTOF-MS中获得的所有离子的质荷比(m/z)，选取亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量化合物，进行正离子模式([M+H]+：m/z 556.2771)和负离子模式([M-H]-：m/z 554.2615)检测。在该色谱质谱条件下一般会产生如[M+H]+、[M-H]-或[M+HCOO]-分子加合离子，当施加碰撞能量时，分子加合离子会进一步裂解。
1.3.2血清样品的UHPLC-QTOF-MS分析
将各血清样品、WWCC提取物，分别在上述质谱条件下通过QTOF-MS仪进行检测。正、负离子模式下，WWCC提取物(A)、大鼠对照组(B)，AA大鼠模型组(C)和WWCC治疗组(D)的总离子流图(QTOF-MS-TIC)，分别如图2和3所示。
以测量值与理论值偏差小于10ppm，同位素拟合程度小于1.0为标准，利用质谱仪自带的质量体系元素组成计算工具，得到各谱峰对应的分子式。结果如表1所示。
表1正负离子模式下UHPLC-QTOF/MS技术追踪WWCC入血成分
1.3.3代表性物质的裂解规律
WWCC主要包括多种苯丙素类，四环三萜酸，倍半萜类，5,7-二羟基异黄酮类、8-异戊烯基异黄酮类化合物。通过比较保留时间、分子离子、分子式及碎片分布规律等相关数据，初步鉴定灌胃给予一定量WWCC后，吸收到大鼠血液中的成分。
1.3.3.1苯丙素类成分的鉴别
苯丙素类化合物在负离子模式下没有观察到[M-H]-分子加合离子，而只在正离子模式下观察到[M+H]+分子加合离子。在保留时间22.37min(峰72)、20.01min(峰68)、19.38min(峰64)时，ESI-MS谱在正离子模式下，出现的[M+H]+分子加合离子分别为m/z135、m/z 133、m/z 149。结合它们的分子式，推测这3个峰分别为肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸。
同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸标准品进行质谱分析，其正离子模式下一级质谱和二级质谱如图4所示。通过一级质谱和二级质谱数据，推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图5所示。
当施加20-40V碰撞能量时，肉桂醇二级质谱中出现的m/z 107、m/z 81碎片离子是因为连续丢失CO(Δm＝28)和C2H2(Δm＝26)形成的。m/z 135离子也可以产生一个m/z 77特征碎片离子，这是由图5A中路径a所示的HCHO(Δm＝30)和C2H4(Δm＝28)相继丢失形成。另外，m/z 135也可以产生一个m/z 89特征碎片离子，这是由图5A中路径b所示的H2O(Δm＝18)和C2H4(Δm＝28)相继丢失形成。
肉桂醛二级质谱中出现的m/z 117和m/z 89碎片离子是通过丢失O(Δm＝16)和C2H4(Δm＝28)形成。另外，m/z 133也可以产生一个特征碎片离子m/z 75，这是由图5B中路径b所示的HCHO(Δm＝30)和C2H4(Δm＝28)相继丢失形成。
肉桂酸二级质谱中出现的m/z 131、m/z 103和m/z 75碎片离子，是由图5C路径所示的H2O(Δm＝16)，CO(Δm＝28)和C2H2(Δm＝26)相继丢失形成。
测得的这些标准品的二级质谱中碎片离子信息与表1中记载的数据相吻合。由此可以确定，在保留时间22.37min(峰72)、20.01min(峰68)、19.38min(峰64)时测得的化合物分别为肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸。肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸，同属于苯丙素类成分，均来自WWCC中的中药材--桂枝。
1.3.3.2 5,7-二羟基异黄酮类成分的鉴别
5,7-二羟基异黄酮类化合物，分子结构上具有5,7-二羟基，正离子模式以[M+H]+分子加合离子为基峰，负离子模式下以[M-H]-分子加合离子为基峰。在保留时间21.84min(峰71)、18.33min(峰53)、19.48min(峰81)、23.10min(峰66)时，ESI-MS谱在正离子模式下，出现的[M+H]+分子加合离子分别为m/z 271、m/z 447、m/z 285、m/z 461。ESI-MS谱在负离子模式下，出现的[M-H]-分子加合离子分别为m/z 269、m/z 445、m/z 283、m/z 459。结合它们的分子式，推测这4个峰分别为黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷。
①同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷标准品进行质谱分析，其正离子模式下一级质谱和二级质谱如图6所示。通过一级质谱和二级质谱数据，推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图7所示。
当施加20-40V碰撞能量时，黄芩素的二级质谱显示m/z 271离子裂解成m/z 253和m/z 225两个特征离子，这是因为通过图7A中路径a所示的H2O(Δm＝18)和CO(Δm＝28)中性分子相继丢失形成。由于C6H6和CO分子的丢失，m/z 225离子进一步裂解，形成m/z 147和m/z 119两个高丰度离子。此外，通过RDA重排反应，形成m/z 169特征碎片离子，而通过CO(Δm＝28)和H2O(Δm＝18)中性分子相继丢失，使m/z 169离子进一步裂解，产生m/z 141和m/z 123两个特征离子。另外，m/z 225离子也可以通过C8H6中性分子的丢失，生成m/z 123离子。
黄芩苷的二级质谱显示m/z 447离子通过O-7处葡萄糖醛酸(Δm＝176)的丢失，产生典型的m/z 271黄芩素特征离子。再通过H2O(Δm＝18)、CO(Δm＝28)、C6H6(Δm＝78)和CO(Δm＝28)中性分子相继丢失，使m/z 271离子进一步裂解，产生m/z 253特征离子[M+H-gluA-H2O]+、m/z 225特征离子[M+H-gluA-CO]+、m/z 147特征离子[M+H-gluA-CO-C6H6]+、m/z119特征离子[M+H-gluA-CO-C6H6-CO]+。
汉黄芩素的二级质谱显示m/z 285离子通过图7C中路径b所示的CH3(Δm＝15)的丢失，产生一个m/z 270特征离子。进一步裂解后，H2O和CO中性分子相继丢失，分别产生m/z242离子和m/z 224离子。此外，m/z 285离子通过RDA重排反应，形成m/z 183特征碎片离子。m/z 183离子进一步裂解，分别通过CO(Δm＝28)和CH3(Δm＝15)丢失，得到m/z 157和m/z142两个高丰度离子。
汉黄芩苷的二级质谱显示m/z 461离子通过O-7处葡萄糖醛酸分子(Δm＝176)的丢失，产生典型的m/z 285黄芩苷特征离子。m/z 285离子丢失CH3(Δm＝15)后，形成m/z270特征离子[M+H-gluA-CH3]+。经过进一步裂解后，m/z 270离子经RDA重排反应，得到m/z169离子。同时，m/z 270离子分别通过CO(Δm＝28)和H2O(Δm＝18)丢失，得到m/z 243特征离子[M+H-gluA-CH3-CO]+、m/z 225特征离子[M+H-gluA-CH3-CO-H2O]+。
②同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷标准品进行质谱分析，其负离子模式下一级质谱和二级质谱如图8所示。通过一级质谱和二级质谱数据推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图9所示。
黄芩素的二级质谱显示m/z 269离子裂解形成m/z 223特征离子，这是由于H2O(Δm＝18)和CO(Δm＝28)中性分子的连续丢失造成的。随后，m/z 223离子通过CH2O中性分子的丢失，生成m/z 195高丰度离子。当然，它也可以通过相继丢失两个中性CO分子(Δm＝28)，依次产生m/z 197离子和m/z 169离子。此外，还可经RDA重排反应，形成一个m/z 167特征片段离子。m/z 167离子通过CO(Δm＝28)和H2O(Δm＝18)中性分子的丢失而进一步裂解，导致m/z 141高丰度离子和m/z 123高丰度离子的生成。
当施加20-40V碰撞能量时，黄芩苷的二级质谱显示m/z 445离子通过O-7处葡萄糖醛酸(Δm＝176)的丢失，产生一个m/z 269特征离子。
汉黄芩素的二级质谱显示m/z 283离子通过CH3(Δm＝15)的丢失，形成m/z 268特征离子。然后，通过C7H5O的丢失，得到m/z 163高丰度离子。同时，由于CO(Δm＝28)和H(Δm＝1)的连续丢失，m/z 268特征离子产生m/z 240和m/z 239两个特征离子。
汉黄芩苷的二级质谱显示m/z 459离子，通过O-7处葡萄糖醛酸(Δm＝176)的丢失，产生一个m/z 283特征离子，这是典型的汉黄芩素。m/z 283离子通过CH3(Δm＝15)的丢失，进一步裂解生成m/z 268特征离子。同时，由于CH3(Δm＝15)和C6H5(Δm＝77)相继丢失，m/z 459离子分别产生m/z 445、m/z 366两个特征碎片离子。
测得的这些标准品的二级质谱中碎片离子信息与表1中记载的数据相吻合。由此可以确定，在保留时间21.84min(峰71)、18.33min(峰53)、19.48min(峰81)、23.10min(66)时，测得的化合物分别为黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷。黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷，同属于5,7-二羟基异黄酮类化合物成分，均来自WWCC中的中药材--黄芩。
1.3.3.3 8-异戊烯基异黄酮类成分的鉴别
8-异戊烯基异黄酮类化合物，分子结构上具有8-异戊烯基，正离子模式以[M+H]+分子加合离子为基峰，负离子模式下以[M-H]-或[M+HCOO]-分子加合离子为基峰。在保留时间25.27min(峰87)、23.11min(峰82)、18.99min(峰60)时，ESI-MS谱在正离子模式下，出现的[M+H]+分子加合离子分别为m/z 369、m/z 515、m/z 823。ESI-MS谱在负离子模式下，出现的[M-H]-分子加合离子分别为m/z 367、m/z 513、m/z 821。结合它们的分子式，推测这3个峰分别为脱水淫羊藿素、宝藿苷I以及朝藿定C。
在保留时间19.20min(峰62)时，ESI-MS谱在正离子模式下，出现的[M+H]+分子加合离子为m/z 677，ESI-MS谱在负离子模式下，出现的[M+HCOO]-分子加合离子为m/z 721。结合其分子式，推测这个峰为淫羊藿苷。
①同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对脱水淫羊藿素、宝藿苷I、淫羊藿苷以及朝藿定C标准品进行质谱分析，其正离子模式下一级质谱和二级质谱如图10所示。通过一级质谱和二级质谱数据推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图11所示。
脱水淫羊藿素以m/z 369的[M+H]+分子加合离子作为基峰，当施加20-40V碰撞能量时，进一步片段化，通过图11A中途径a可知，由于C4H8(Δm＝56)、CO(Δm＝28)和CH3(Δm＝15)的连续丢失，依次产生m/z 313的[M+H-C4H8]+、m/z 285的[M+H-C4H8-CO]+和m/z 270的[M+H-C4H8-CO-CH3]+。另外，通过RDA重排过程，形成一个m/z 221特征碎片离子。
宝藿苷I的二级质谱显示m/z 515离子通过C-3处鼠李糖分子(Δm＝146)的丢失，产生一个m/z 369特征离子。同时，由于C4H8(Δm＝56)、CO(Δm＝28)和CH4(Δm＝16)的连续丢失，依次产生m/z 313的[M+H-glu-C4H8]+、m/z 285的[M+H-glu-C4H8-CO]+和m/z 270的[M+H-glu-C4H8-CO-CH4]+。
淫羊藿苷的二级质谱显示m/z 677离子通过C-7处葡萄糖分子(Δm＝162)的丢失，产生宝藿苷I典型的m/z 515特征离子。另外，通过C-3处鼠李糖分子(Δm＝146)丢失，产生m/z 531特征离子。随着葡萄糖(Δm＝162)、C4H8(Δm＝56)、CO(Δm＝28)和CH4(Δm＝16)的连续丢失，m/z 531离子进一步裂解，分别产生m/z 369、m/z 313、m/z 285和m/z 270共4个特征离子。
朝藿定C的二级质谱显示m/z 823离子进一步裂解后，随着C-3处两个鼠李糖分子(Δm＝146)分子的连续丢失，产生m/z 531特征离子。m/z 531离子被进一步裂解，由于C-7处葡萄糖分子(Δm＝162)的丢失，产生一个典型的脱水淫羊藿素特征离子m/z 369。当碰撞能量足够时，可通过C4H8(Δm＝56)分子丢失形成的特征离子m/z 313。
②同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对脱水淫羊藿素、宝藿苷I、淫羊藿苷、朝藿定C标准品进行质谱分析，其负离子模式下一级质谱和二级质谱如图12所示。通过一级质谱和二级质谱数据推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图13所示。
在负离子模式下，脱水淫羊藿素以m/z 367的[M-H]-分子加合离子作为基峰。当施加20-40V的碰撞能时，m/z 367离子由于CH3(Δm＝15)的丢失，产生m/z 352特征离子。m/z352特征离子通过C4H7(Δm＝55)的丢失，得到m/z 297高丰度离子，这是由于异戊烯基的裂解所致。另一方面，随着C3H6(Δm＝42)、H(Δm＝1)、CO(Δm＝28)和CO(Δm＝28)的连续丢失，m/z 352离子进一步裂解，依次产生m/z 310、m/z 309、m/z 281和m/z 253共4个特征离子。
宝藿苷I的二级质谱显示m/z 513离子通过C-3处鼠李糖分子(Δm＝147)的丢失，产生m/z 366特征离子。同时，由于异戊烯基的裂解，m/z 366离子通过C4H7(Δm＝55)的丢失，得到一个高丰度的m/z 311离子。另一方面，m/z 366离子进一步裂解，随着CH3(Δm＝15)、CO(Δm＝28)和C4H7(Δm＝55)的连续丢失，依次产生m/z 351、m/z 323和m/z 268共3个特征离子。
淫羊藿苷以m/z 721的[M+HCOO]-分子加合离子作为基峰。当施加20-40V的碰撞能时，由于C-7处葡萄糖分子(Δm＝162)的丢失和C-3处鼠李糖分子(Δm＝146)的丢失，m/z721离子分别产生m/z 513和m/z 529两个特征离子。m/z 529离子进一步裂解，分别丢失葡萄糖(Δm＝162)和CH3(Δm＝15)，得到两个特征离子m/z 367、m/z 514。随着H(Δm＝1)和C7H6O(Δm＝106)的连续丢失，m/z 514离子进一步裂解，依次产生m/z513和m/z 409两个特征离子。
朝藿定C的二级质谱显示，m/z 821离子通过C-7处葡萄糖分子(Δm＝162)的丢失，得到m/z 659离子。如图13D的路径b所示，通过丢失鼠李糖(Δm＝146)，m/z 659离子进一步裂解，形成m/z 513的宝藿苷I特征离子。m/z 513离子通过1,5-H的转移，并丢失C4H6(Δm＝54)，形成m/z 459离子。如果碰撞能足够大，可得到m/z 268离子。当然，通过图13D的路径a途径，从m/z 659得到的m/z 367离子，进一步裂解也可得到m/z 268离子。
测得的这些标准品的二级质谱中碎片离子信息与表1中记载的数据相吻合。由此可以确定，在保留时间25.27min(峰87)、23.11min(峰82)、18.99min(峰60)、19.20min(峰62)时，测得的化合物分别为脱水淫羊藿素、宝藿苷I、朝藿定C以及淫羊藿苷。脱水淫羊藿素、宝藿苷I、朝藿定C以及淫羊藿苷，同属于8-异戊烯基异黄酮类化合物成分，均来自WWCC中的中药材--淫羊藿。
1.3.3.4四环三萜酸的鉴定
四环三萜酸化合物正离子模式以[M+H]+分子加合离子为基峰，负离子模式下以[M-H]-分子加合离子为基峰。在保留时间26.92min(峰90)时，ESI-MS谱在正、负离子模式下出现的[M+H]+、[M-H]-分子加合离子，分别为m/z 529、m/z 527。结合分子式，推测这个峰为茯苓酸。
同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对茯苓酸标准品进行质谱分析，其正、负离子模式下一级质谱和二级质谱如图14所示。通过一级质谱和二级质谱数据推断各标准品的质谱轰击裂解路径如图15所示。
在正离子模式下，当施加20-40V的碰撞能量时，m/z 529离子通过H2O(Δm＝18)的丢失，产生特征离子m/z 511。随后，该离子进一步裂解，通过丢失C7H14(Δm＝98)、C5H12(Δm＝72)、HOAc(Δm＝60)和CH3(Δm＝15)分子，分别形成m/z 413、m/z 438、m/z 451和m/z496共4个特征离子。m/z 438离子通过丢失中性CO2分子(Δm＝44)进一步裂解，形成m/z394高丰度离子。
在负离子模式下，当施加20-40V的碰撞能量时，m/z 527离子进一步裂解，通过连续丢失C3H6(Δm＝42)、C3H6(Δm＝42)和CO(Δm＝28)，分别形成m/z 485、m/z 444和m/z416共3个特征离子。
测得标准品的二级质谱中碎片离子信息与表1中记载的数据相吻合。由此可以确定，在保留时间26.92min(峰90)时，测得的化合物为茯苓酸。茯苓酸属于四环三萜酸化合物成分，来自WWCC中的中药材--茯苓。
1.3.3.5倍半萜类的鉴定
倍半萜类化合物只在正离子模式以[M+H]+分子加合离子为基峰，在保留时间26.05min(峰88)时，ESI-MS谱在正离子模式下，出现的[M+H]+分子加合离子为m/z 219。结合分子式推测这个峰为吉马酮。
同等质谱条件下，利用QTOF-MS质谱仪对吉马酮标准品进行质谱分析，其正离子模式下一级质谱和二级质谱如图16所示。通过一级质谱和二级质谱数据推断标准品的质谱轰击裂解路径如图17所示。
当施加20-40V的碰撞能时，形成3个特征离子，分别是m/z 177的[M+H-C3H6]+、m/z149的[M+H-C3H6-CO]+、m/z 159的[M+H-C3H6-H2O]+。当碰撞能量足够时，还可检测到m/z 133离子，这是由于CH4(Δm＝16)的丢失所致。
测得标准品的二级质谱中碎片离子信息与表1中记载的数据相吻合。由此可以确定，在26.05min(峰88)时测得的化合物为吉马酮。吉马酮属于倍半萜类化合物成分，来自WWCC中的中药材--片姜黄。
1.3.4血清成分的鉴定与归属
结合QTOF-MS分析和标准品的裂解规律，对灌胃给予一定量WWCC后，大鼠血清成分进行了鉴定和分类，共计91种，如表1所示。其中：
峰29、30、36、37、43、83、85、90和91分别来自茯苓。峰9-13、20、22、24、25、40、46、51、58、64、65、68、72、73、78、84和86来自于桂枝。峰2-4、8、14、15、21、26、39、41、45、49、54、55、60-62、69、82和87来自于淫羊藿。峰5-7、19、23、32、33、63、70、74、75、80、88和89来自于片姜黄。峰1、16-18、27、28、31、34-35、38、42、44、47、48、50、52、53、56、57、59、66、67、71、76、77、79和81来自于黄芩。
1.3.5质量标志物的选择
目前，常选用单个或多个体外化学成分作为中药复方质量评价标准，然而，中药复方入血后会发生一系列的反应，体外化学成分往往不能代表其药效活性成分，化学成分的高低并不能真正反映其药效的强弱。因此，选用入血成分作为中药复方质量评价标准，更具有代表性和准确性。同时，针对中药复方的质量评价，也多采用君药或君药联合1-2种臣药的指标成分作为质控标准，较少采用全方药物(君药+臣药+佐药+使药)的评价模式，对其质量进行全方位的综合评价。
因此，利用血清药物化学结合UHPLC-QTOF-MS技术，以全方药物作为研究对象，入血活性成分作为质量标志物，构建中药复方综合评价体系具有重要意义。
本发明中，选择了来源于药材桂枝(cinnamomum cassia)的香豆素(coumarin，峰46)、肉桂酸(cinnamic acid，峰64)、肉桂醛(cinnamaldehyde，峰68)、肉桂醇(cinnamicalcohol，峰72)和2-甲氧基肉桂醛(2-methoxycinnamaldehyde，峰73)，来源于药材黄芩(Scutellaria baicalensis)的黄芩苷(baicalin，峰53)、黄芩素(baicalein，峰71)、汉黄芩素(wogonin，峰81)和汉黄芩苷(wogonoside，峰66)，来源于药材淫羊藿(Epimediumbrevicornu)的朝藿定C(epimedin C，峰60)、淫羊藿苷(icariin，峰62)、宝藿苷I(baohuoside I，峰82)和脱水淫羊藿素(anhydroicaritin，峰87)，来源于药材茯苓(poriacocos)的茯苓酸(pachymic acid，峰90)，以及来源于药材片姜黄(Curcuma wenyujin)的吉马酮(germacrone，峰88)，共15种入血质量标志物对复方WWCC进行全面质量评价。15种质量标志物的结构式如图18所示。
1.4WWCC质量评价
1.4.1标准溶液和混合溶液的制备
精密称定香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮和茯苓酸共15种标准品适量，加90％甲醇定容。所得15种标准物质浓度分别为：0.937mg/mL，0.604mg/mL，0.548mg/mL，1.035mg/mL，0.578mg/mL，0.544mg/mL，0.601mg/mL，0.931mg/mL，0.566mg/mL，0.672mg/mL，0.583mg/mL，0.552mg/mL，0.880mg/mL和0.163mg/mL。
15种标准溶液各吸取100μL，置于10mL容量瓶中，最后用90％甲醇稀释至刻度，得混合样品溶液。
1.4.2 15种质量标志物的紫外吸收光谱
通过UV-2550紫外分光光度计记录15种质量标志物的紫外吸收光谱。精确吸取100μL按照1.4.1节中制备的标准品，置于5mL EP管中，用90％甲醇定容，最后得到稀释50倍的标准溶液。先用空白溶液将UV-2550分光光度计调零，然后将稀释的标准溶液进行全波长扫描检测。
不同物质在不同波长下，具有不同的吸收峰，而在大多数情况下，化合物紫外检测波长的选择未得到充分的考虑。鉴于复方WWCC由茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄、黄芩5种中药组成，含有多种复杂成分，需进一步优选其最佳检测波长。在本发明中，将选择的15种质量标志物用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到其吸光度数据如图19所示。结果如下：
肉桂醇cinnamic alcohol(图19a)，肉桂醛cinnamaldehyde(图19b)，肉桂酸cinnamic acid(图19c)，吉马酮germacrone(图19j)，汉黄芩苷wogonoside(图19h)，汉黄芩素wogonin(图19i)，朝藿定C epimedin C(图19n)以及宝藿苷I baohuoside I(图19m)的最大吸收波长分别位于252nm、290nm、275nm、245nm、277nm、277nm、271nm和272nm处。
香豆素coumarin(图19d)和2-甲氧基肉桂醛2-methoxycinnamaldehyde(图19e)具有两个最大吸收波长。即香豆素在274nm和311nm处，2-甲氧基肉桂醛在287nm和338nm处。
黄芩苷baicalin(图19f)和黄芩素baicalein(图19g)有两个最大吸收波长，即黄芩苷在279nm和316nm处，黄芩素在277nm和325nm处。
有些化合物还具有三个最大吸收波长。如脱水淫羊藿素anhydroicaritin(图19k)在273nm、324nm和373nm处有三个最大的吸收波长，淫羊藿苷icariin(图19l)在271nm、318nm和349nm处有三个最大的吸收波长。
从这14种质量标志物(除茯苓酸)的紫外光谱中可以看到，它们在大约270nm处都有吸收。UHPLC分析选择在此紫外波长下检测，可以更好实现五味药材组成的复方WWCC中四味药材(淫羊藿，黄芩，桂枝和片姜黄)的质量评价。为了实现复方WWCC的全面质量评价，药材茯苓也必须被检测。然而，由于药材茯苓中主要成分茯苓酸pachymic acid(图19o)为四环三萜酸类化合物，它具有末端紫外吸收性质，最大吸收波长在203nm处。因此，在203nm处检测茯苓酸可实现复方WWCC中另一味药材茯苓的质量评价。
因此，根据以上15种质量标志物的紫外吸收特征，选择203nm和270nm双波长下分析可实现复方WWCC的全面质量评价。
1.4.3 UHPLC-UV分析方法的建立
样品分析采用UHPLC系统(美国Agilent 1290系列)，配备自动进样器、泵、柱温箱、紫外检测器，使用Eclipse型C18柱(1.8μm，2.1mm×100mm，Agilent)，流速为0.4mL/min。柱温和样品室温度分别保持在25℃和10℃。进样量为1μL。洗脱程序和时间对色谱峰的分离有较大的影响。通过优化洗脱比，延长洗脱时间，实现了色谱峰的有效分离。
最初，除茯苓酸(90)之外的所有质量标志物标准品均在270nm处用UHPLC-UV检测。梯度洗脱设置为：0-5min，15％B；7-12min，20％B；14-19min，23％B；21-26min，28％B；28-33min，35％B；35-40min，45％B；45-50min，65％B；51-55min，100％B。从图20可知，2-甲氧基肉桂醛(tR＝21.19min)、朝藿定C(tR＝21.41min)和淫羊藿苷(tR＝21.70min)的三个色谱峰重叠，不能有效分离。通过将洗脱时间延长至59min，稍微改变洗脱溶剂的极性，成功实现了有效分离。因此，将其作为最终的色谱条件。具体如下：
(1)系统I：紫外检测器在270nm处进行检测，以确保来自中药(肉桂，淫羊藿，片姜黄和黄芩)的所有14种质量标志物获得良好响应，UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，15％B；7-12min，20％B；14-19min，23％B；25-30min，28％B；32-37min，35％B；39-44min，44％B；49-54min，62％B；55-59min，100％B；色谱分析在59min后停止，平衡系统4min后再进样。
(2)系统II：来自中药茯苓的标志物具有末端吸收特性，因此，紫外波长设置为203nm。UHPLC的流动相：A为含0.2％甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5min，30％B；6-9min，62％B；10-16min，23％B；色谱分析在16min后停止，平衡系统3min后再进样。
利用建立的分析方法对WWCC提取物(1.2.2节制备)、标准品混合溶液和15种标准品进行分析，检测结果如图21和图22所示。由图21和22色谱图可知，该色谱条件分离效果较好。
1.4.4 UHPLC-UV方法的验证
1.4.4.1线性关系、检测限和定量限
在上述系统I条件下进行UHPLC-UV分析，通过标绘有关标准物质的峰面积(y)与相应浓度(x)的关系，得到14种质量标志物的线性回归方程。针对茯苓酸，将其原液进一步稀释至一系列适当的浓度，在上述系统II条件下进行分析并建立线性回归方程。此外，15种标准物质的检出限和定量限分别在信噪比(S/N)为3和10时计算，结果如表2所示。
表2 15种质量标志物的回归方程，相关系数，线性范围，检出限和定量限数据
1.4.4.2精密度、重复性、稳定性和回收率
一天内进行了十二次日内精密度测量。为了实现日间测量精度，在连续三天内，每天进行六次测量。记录15种质量标志物的峰面积并计算出其相对标准偏差(RSD)。为测试其重复性，将样品连续进样，进行UHPLC-UV分析。将新制备的样品在0h、1h、3h、6h、12h、24h不同时间间隔进行分析，考察其稳定性。然后，将3h、6h、12h、24h不同时段的色谱图与0h的色谱图进行比较，变异量以相对标准差表示。精密度、重复性和稳定性的结果见表3。
表3建立的HPLC-UV方法的精密度，重复性和稳定性数据
用标准加入法进行了准确度评价的回收率测试。在12批样品中加入了15种已知加标量的标准品。加料样品通过UHPLC-UV测定。每一组数据重复三次。回收率计算如下：
回收率(％)＝(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100。回收率数据见表4。
表4 15种质量标志物的回收率数据
通过表2-4可知：
15种质量标志物的相关系数在理想的浓度范围内均高于0.999，说明峰面积与浓度的相关性较好。15种质量标志物的LOD值为0.056～183.126ng/mL，LOQ值为0.152～533.274ng/mL。保留时间的日内精度和日间精度的相对标准偏差RSD分别在0.11-1.9％、0.31-3.92％之间。新建立的UHPLC-UV方法对质量标志物的分析重现性好，相对稳定，其相对标准偏差为0.22-2.64％。加样回收率实验显示方法的准确性较好，回收率的相对标准偏差在96.8-103.0％之间。
1.4.5样品分析
采用所建立的UHPLC-UV法对12批WWCC样品中的15种质量标志物进行含量测定，结果如表5所示。
表5 12批WWCC中15种质量标志物的含量测定(n＝3,μg/g)
通过表5可知：香豆素、肉桂酸、肉桂醛、朝藿定C、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、2-甲氧基肉桂醛、吉马酮和茯苓酸的含量的RSD％在1.25～4.82之间，12批WWCC样品之间无显著性差异。肉桂醇和淫羊藿苷的含量分别为0.4339～0.5498mg/g和6.0595～8.0979mg/g。二者含量差异最合理的解释是前者具有挥发性，而后者在水解条件下可能转化为其他化合物。另外，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素的含量RSD％在7.74～9.75之间。这可以解释为黄芩苷和汉黄芩苷分子中的糖苷键在高温并且有水存在时被水解，分别转化为黄芩素和汉黄芩素。
1.4.6 12批复方WWCC的色谱指纹图谱
由于在203nm处观察到复方WWCC的特征较少，因此选择在270nm处对12批复方WWCC进行了UHPLC指纹分析，构建其指纹图谱。将样品S1-S12在270nm特征波长下的AIA格式数据传输到中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)中。选取样本S1作为参考图，采用中位数法，将时间窗精确设置为0.1min，通过多点校正和进一步的自动匹配对色谱峰进行分析。从图23可知，12批WWCC样品的色谱图显示朝藿定C的峰面积更适中，保留时间相对稳定。因此，选择朝藿定C的吸光度峰作为参照峰。
表6 12批WWCC样品在270nm处的相似度结果
| Peak | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 | S12 |
| 1 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 |
| 2 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.999 |
| 3 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 |
| 4 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 0.999 | 0.998 | 1 | 0.998 | 0.999 | 0.998 | 0.999 |
| 5 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 1 | 1 | 1 | 0.998 | 1 | 1 | 1 | 0.999 |
| 6 | 0.999 | 1 | 0.999 | 0.999 | 1 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 |
| 7 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 |
| 8 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.998 | 0.999 | 0.998 | 0.999 |
| 9 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 1 | 1 | 1 | 0.999 |
| 10 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 1 | 0.999 | 0.999 | 1 | 1 | 0.999 | 1 |
| 11 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.998 | 1 | 0.999 | 1 | 0.999 |
| 12 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1 | 0.999 | 1 |
表6是12批WWCC样品在270nm处的相似度结果，其相似度均大于0.998，说明样品在270nm波长处各批次间基本保持稳定。另外，从相似度评价软件中导出270nm处WWCC指纹图谱的共有模式图，如图24所示。
Claims (1)
1.一种五味温通除痹胶囊质量评价方法，其特征在于，步骤为：
（1）结合血清药物化学和UHPLC-QTOF-MS技术追踪五味温通除痹胶囊入血成分并靶向其质量标志物
（a）利用茯苓、桂枝、淫羊藿、片姜黄和黄芩5味中药按处方比例制备复方五味温通除痹胶囊，并将五味温通除痹胶囊提取物制成冻干粉，用于大鼠灌胃和后期样品分析；
（b）动物模型构建与给药
选取SPF级雄性SD大鼠，于右后足趾皮内注射FCA复制佐剂性关节炎大鼠模型；五味温通除痹胶囊治疗组于注射FCA后第12天进行实验，五味温通除痹胶囊汤剂连续灌胃12天；对照组和模型组大鼠给予等量0.9%生理盐水；
（c）血清样本的收集与处理
末次给药后8 h，用异氟醚对大鼠进行深度麻醉，腹主动脉采血，室温静置1-2 h后离心，取上清液，-80 ℃储存，备用；分析前，将血清样品与甲醇-乙酸乙酯混合均匀，离心，浓缩干燥处理；干燥后的样品使用甲醇复溶，取2 μL试样用于UHPLC-QTOF-MS分析；
（d）基于UHPLC-QTOF-MS技术进行血清成分定性分析
①色谱条件
色谱分析流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；
梯度洗脱程序为：0-1 min，10% B；5-8 min，15% B；10-15 min，22% B；18-21 min，35%B；22-24 min，70% B；25-27 min，95% B；28-30 min，10% B，流速为0.25 mL / min；
②质谱条件
质谱分析在正、负离子模式下进行，扫描范围为m/z 50~1200，数据采集速率为0.5 s；正离子模式下毛细管电压为2.5 kV，源温度为120 ℃；负离子模式下毛细管电压为2.0 kV，源温度为110 ℃；锥孔电压为40 kV，脱溶剂气流温度为350 ℃，锥孔气流量为50 L/h；
通过锁定喷雾实时调节QTOF-MS中获得的所有离子的质荷比m/z，选取亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量化合物，进行正离子模式[M+H]+：m/z 556.2771和负离子模式[M-H]-：m/z554.2615检测；
③标准品UHPLC-QTOF-MS分析
选择肉桂醇、肉桂醛以及肉桂酸作为中药桂枝中苯丙素类化合物代表性组分，选择黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素以及汉黄芩苷作为中药黄芩中5,7-二羟基异黄酮类化合物代表性组分，选择脱水淫羊藿素、宝藿苷I、朝藿定C以及淫羊藿苷作为中药淫羊藿中8-异戊烯基异黄酮类化合物代表性组分，选择茯苓酸作为中药茯苓中四环三萜酸类化合物代表性组分，选择吉马酮作为中药片姜黄中倍半萜类化合物代表性组分；
取13种标准物质在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测，记录各标准品的保留时间信息，并通过质谱裂解碎片信息分析，总结出不同类型化合物的裂解规律；
④血清样品UHPLC-QTOF-MS分析
将各组血清样品、复方五味温通除痹胶囊提取物分别在上述质谱条件下，通过QTOF-MS仪进行检测；根据测量值与理论值偏差小于10 ppm，同位素拟合程度小于1.0的原则，利用质谱仪自带的质量体系元素组成计算工具，得到各谱峰对应的分子式；最后通过标准品碎片裂解规律和数据相结合，鉴定出复方五味温通除痹胶囊入血成分，并从中选定香豆素、黄芩苷、朝藿定C、淫羊藿苷、肉桂酸、汉黄芩苷、肉桂醛、黄芩素、肉桂醇、2-甲氧基肉桂醛、汉黄芩素、宝藿苷I、脱水淫羊藿素、吉马酮、茯苓酸共计15种物质作为质量标志物；
（2）15种质量标志物的全波长扫描
先用空白溶液将UV-2550分光光度计调零，然后将制备的15种标准品母液稀释至适当浓度后，进行全波长扫描检测，得到其吸光度数据；综合15种标准物质的最大吸收波长数据，最终选择203 nm和270 nm两种波长对复方五味温通除痹胶囊进行全面的质量评价；
（3）UHPLC-UV分析方法的建立
样品分析采用UHPLC系统，配备自动进样器、泵、柱温箱、紫外检测器，使用Eclipse 型C18柱，1.8 μm，2.1 mm×100 mm，Agilent，流速为0.4 mL/ min；柱温和样品室温度分别保持在25 ℃和10 ℃；进样量为1μL；
系统I：针对除了茯苓酸之外14种质量标志物，紫外检测器在270 nm处进行检测，UHPLC的流动相：A为含0.2%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5 min，15% B；7-12min，20% B；14-19 min，23% B；25-30 min，28% B；32-37 min，35% B；39-44 min，44% B；49-54 min，62% B；55-59 min，100% B，59 min后停止，平衡系统4 min后再进样；
系统II：针对茯苓酸，紫外波长设置为203 nm，UHPLC的流动相：A为含0.2%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件设置为：0-5 min，30% B；6-9 min，62% B；10-16 min，23% B；16 min后停止，平衡系统3 min后再进样；
（4）UHPLC-UV分析方法的验证
利用步骤（3）的分析方法，建立线性回归方程，确定检出限和定量限，同时，开展精密度、重复性、稳定性和回收率测试，进行方法学验证，综合评价分析方法的可靠性；
（5）五味温通除痹胶囊样品的分析
采用所建立的UHPLC-UV法对多批五味温通除痹胶囊样品中的15种质量标志物进行了定量测定，在270nm下对五味温通除痹胶囊进行指纹分析，构建其指纹图谱，完成对五味温通除痹胶囊的全面质量评价。
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