CN107402258A - 一种人参有效成分含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种符合中药特点的人参有效成分含量测定方法‑标准叠加法。本发明涉及中药质量控制领域，该方法以人参自身提取液为稀释溶液，将需定量研究的目标有效成分标准溶液稀释为系列浓度标准工作溶液后经检测器检测，以确定目标有效成分标准校正曲线，从而对目标有效成分进行含量测定的方法。该方法解决了使用纯溶剂稀释系列浓度标准溶液获得的标准校正曲线，没有考虑基质效应的存在，使得分析物在纯溶剂和中药提取液中检测的环境大不相同，从而影响含量测定方法准确度、重现性及选择性的问题。标准叠加法可最大限度重现目标有效成分在不同检测器时检测环境，从而扣除共洗脱的内源物质对目标有效成分造成的干扰，有效消除基质效应的影响，使人参有效成分含量测定结果更为准确。

Description

一种人参有效成分含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一种适用于人参中有效成分含量测定的方法，该方法以人参自身提取液为稀释溶液，将需定量研究的有效成分标准溶液稀释为系列浓度标准工作溶液后经检测器检测以确定目标分析物标准校正曲线，从而对目标有效成分进行含量测定的方法。

背景技术

人参皂苷Rb1，中文化学名称：(3β，12β)-20-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D吡喃葡萄糖基)氧]-12-羟基达玛脂-24-烯-3-y12-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，英文化学名称：(3β, 12β)-20-[(6-O-β-D-Glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-12- hydroxydammar-24-en-3-yl2-O- β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside。人参皂苷Rb1存在于五加科植物人参的根、茎和叶中，西洋参的根、茎和叶中，三七的根和叶中，以及葫芦科绞股蓝的叶和茎中，分子式为C₅₄H₉₂O₂₃，相对分子质量为1108.26，白色粉末，易溶于水、甲醇和乙醇，可溶于正丁醇、醋酸和乙酸乙酯，不溶于乙醚和苯，CAS号：41753-43-9。

人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg1存在于五加科植物人参的根，三七的根，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，相对分子质量为801.01，白色粉末，易溶于水、甲醇、乙醇，不溶于乙醚、苯。CAS号：22427-39-0。

人参皂苷Re，人参皂苷Re存在于存在于五加科植物人参的根、花蕾、茎、叶和芦头中，西洋参的根中，分子式为C₄₈H₈₂O₁₈，相对分子质量为947.14，无色针状结晶，易溶于甲醇，乙醇，难溶于水。CAS号：51542-56-4。

人参对中枢神经系统、心血管系统、消化系统、免疫系统、内分泌系统和泌尿生殖系统有广泛的作用，从而可提高人体力、智力和增强机体对有害刺激的非特异性抵抗力。其中，人参皂苷Rb1作为一种人参提取物，已经报道被用作为药物的作用包括：保护神经作用，中枢性抗应激作用，增强学习记忆作用，其最受关注的药用价值则体现在对心血管的作用上，它对心率失常具有调节作用，可以促进儿茶酚胺的释放，从而起到强心作用，此外还可以升高血压，抗动脉粥样硬化，促进血浆分泌酮的活性，对肺、心脏缺血性再灌注损伤具有保护作用。

人参临床应用广泛，是传统名贵中药，由于市场需求量较大，目前要用人参大部分为人工栽培品种，由于生长环境的不同，栽培品种中有效成分的含量参差不齐，因此为了确保其临床疗效，建立准确、有效的人参质量控制方法是非常必要的。然而，长期以来，传统的中药质量控制方法是借鉴化学药物质量控制模式，该方法是利用空白溶液制作标准校正曲线，从而对中药中一个或多个指标成分进行含量测定。这种方法在中药研究的发展进程中起着不可替代的作用，直至现在《中华人民共和国药典》仍在使用其作为不同中药品种化学成分含量测定的标准方法。中药，无论是药材、饮片，还是中成药，其成分含量测定结果的准确性依赖于标准校正曲线。如CN105116086A，公开了一种赤芍中芍药苷和芍药内酯苷的HPLC-ELSD含量测定方法，采用ELSD检测器进行HPLC-ELSD检测，分别绘制曲线得到标准曲线方程；又如CN104345110A，公开了一种中药组合物制剂中七种成分含量的测定方法，采用UPLC检测、标准曲线的制定及结果计算。上述实例均说明中药成分检测和含量测定方法已经是药物分析领域较为成熟的定性、定量分析方法，但由于中药是与化学药迥然不同的复杂体系，其中包含不同结构的复杂化学成分，复杂基质中不可预知的干扰化合物与分析物共存，使用纯溶剂稀释的系列浓度标准溶液获得的标准校正曲线，没有考虑到基质效应的存在，使得分析物在纯溶剂和中药提取液中检测的环境大不相同，从而影响含量测定方法准确度、重现性及选择性。同时，中药提取液也与生物体液不同，无目标分析物的空白基质样品难以获得，因而也无法使用生物样品含量测定的基质匹配校正法。因此寻求适合中药特点的含量测定方法，是中药质量控制的关键所在。

发明内容

为解决上述问题，本发明建立了一种符合中药特点的人参有效成分含量测定方法-标准叠加法。该方法以人参自身提取液为稀释溶液，将需定量研究的目标有效成分标准溶液稀释为系列浓度标准工作溶液后经检测器检测以确定目标有效成分标准校正曲线，从而对目标有效成分进行含量测定的方法。该方法可最大限度重现人参中不同有效成分在不同检测器时检测环境，从而扣除共洗脱的内源物质对其造成的干扰，有效消除基质效应的影响，使含量测定结果更为准确，是一种符合中药特点的人参有效成分含量测定方法，将为人参质量控制研究提供方法支撑。

本发明通过以下步骤实施：

1. 制备待测人参提取液，人参提取液提前方法可参照中华人民共和国药典或其他文献报道方法；

2. 确定标准校正曲线：精密称取标准品适量，用甲醇溶解后，配制目标有效成分标准溶液母液，使用自身药材提取液稀释待测有效成分标准溶液母液，获得系列浓度标准工作溶液，经紫外线、蒸发光散射、质谱等检测器检测，每一标准曲线的确定至少包含6个浓度点，每个浓度测定3次，制作标准校正曲线；

3. 含量测定方法学考察：

① 精确性：选择高、中、低三个浓度的标准工作溶液一天内连续进样6次，计算各目标有效成分测得值的相对标准偏差（R.S.D.）值，计算日内精密度；连续进样三天，每天进样3次考察日间精密度；

② 重现性：取所测人参提取液考察重现性。平行提取5份，经紫外线、蒸发光散射、质谱等检测器检测，计算各目标有效成分测得值的相对标准偏差（R.S.D.）值；

③ 准确度：使用加样回收率考察方法的准确度。取制备人参提取液所用重量的一半样品，加入上述标准工作溶液，按照人参提取液制备方法制备样品，经紫外线、蒸发光散射、质谱等检测器检测，计算各目标分析物的加样回收率，回收率计算公式：回收率(%) = (测得量–样品量)/加入量×100%。

4. 供试品溶液的制备：精密称取上述人参提取液，作为供试品备用；

5. 人参中目标有效成分含量测定：使用建立的标准校正曲线对不同批次样品中的目标有效成分进行定量分析。

本发明的含量测定数据均为实验获得，在实际操作中，只要使用本发明操作步骤进行人参有效成分含量测定，无论所测有效成分含量高低，均属于本发明范围。

附图说明

图1 标准叠加法示意图。目标有效成分峰面积为A_加入前。加入目标有效成分工作标准溶液后，目标有效成分的峰面积为A_加入后，其中A_加入后包括提取物中原目标有效成分峰面积A’_加入前及加入标准品的峰面积A_标准品。

具体实施方式

本发明具体提供了一种人参有效成分的含量测定方法，包括以下步骤：

使用标准叠加法对《中华人民共和国药典》人参含量测定要求项下的四个有效成分，人参皂苷Rg₁（1）、Re（2）、Rb₁（3）、Rd（4）进行定量研究。本实例中主要使用蒸发光散射检测器。通过该实例对本发明的具体实施过程进行说明。

人参样品的色谱分析采用安捷伦1100液相系统（Agilent Technologies, PaloAlto, CA, USA），含在线真空脱气机、二元梯度泵、盘式自动进样器、柱温箱。蒸发光散射检测器（ELSD，Alltech Associates，Deerfield，USA），ELSD的漂移管温度106 °C，载气流速为3.0 L/min。色谱分离采用Aglient Zorbax SB-C18柱（4.6 × 250 mm, 5 μm），柱前加一保护预柱（4.6 × 12.5 mm, 5 μm）；柱温：30 °C；流动相：0.1%甲酸水溶液（A），0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱程序：0-34 min时 20% B，34-42 min 时 20%-29% B，42-66 min时 29%-38% B；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL/min。数据采集和分析采用Chemstation software(Agilent Technologies, USA)。

人参药材粉碎到均匀粒度，过40目筛。取粉末1.0 g，根据《中华人民共和国药典》（2010版）提取。取提取液4 °C保存待用，取10 μL进样。

标准溶液及标准曲线的制备

精密称取4种标准品适量，用70%甲醇溶解后，配置混合标准溶液母液备用。

标准叠加法：用人参药材提取液代替70%甲醇溶剂将混合标准溶液母液稀释成系列浓度，即取混合标准溶液母液3 μL、药材提取液 57 μL到0.2 mL离心管。换言之，即将混合标准溶液加入到药材提取液中。另外，取药材提取液 60 μL到0.2 mL离心管作为对照样品。

测定由药材提取液制得的标准工作溶液，至少6个浓度，每个浓度测定3次，同时测定对照样品3次。标准曲线以标准工作溶液中所含化合物峰面积的对数为纵坐标，进样标准工作溶液中所含待测化合物对照品量的对数为横坐标进行线性回归，得回归方程。

标准叠加法示意图见图1，首先，HPLC-ELSD分析作为参照的药材提取液，测得目标皂苷峰面积分别记为A_加入前；相同色谱条件下，HPLC-ELSD分析加入工作标准溶液的药材提取液，此时测得目标皂苷的峰面积记为A_加入后，其中A_加入后包括原提取物目标皂苷的峰面积（A’_加入前）与加入相应目标皂苷标准品的峰面积（A_标准品）。因提取物中目标皂苷的浓度不变，因此两次检测所得对数值相等，如公式（1）。根据公式（1），可计算得到加入标准溶液中目标皂苷的峰面积A_标准品，如公式（2）；最终，以加入标准溶液中化合物的峰面积的对数，即标准工作溶液及对照样品所测得的两次化合物峰面积之差的对数，为纵坐标，加入标准品量为横坐标进行线性回归，得回归方程，见公式（3，4）。

A_加入前=A’_加入前 (1)

A_标准品=A_加入后-A’_加入前=A_加入后-A_加入前(2)

Log A_标准品=Log（A_加入后-A_加入前） (3)

Log A_标准品& Log（加入标准品量 ）(4)

精确性、重现性和准确度

用标准品溶液考察日内和日间精密度。一天内连续进样6次，计算各色谱峰峰面积对数的R.S.D值，考察日内精密度；连续进样3天，每天进样3次考察日间精密度。

取药材来考察方法的重现性。平行提取5份人参药材，计算各成分峰面积对数的R.S.D值。

用加样回收率来考察方法的准确度。取0.5 g人参药材加入烧瓶，再加入合适浓度的工作标准溶液。回收率计算公式如下回收率(%) = (测得量–样品量)/加入量×100%。

标准叠加法用于不同来源的12批人参药材中四个人参皂苷的定量分析。

结论

该发明可用于任意人参品种中任意一个有效成分的含量测定。准确定量是中药质量控制的重要部分，然而，中药中与目标分析物共洗脱的“未知”内源化合物可能会引起基质效应，从而严重干扰目标分析物定量测定的可靠性和选择性。基质效应影响的程度取决于检测器的机制。对于任意检测器，如紫外线、蒸发光散射、质谱等检测器，当目标有效成分含量测定过程中存在明显的基质效应，则可选择标准叠加法消除机制效应。该方法可最大限度重现目标有效成分在检测器中的检测环境，从而扣除共洗脱的内源物质对其检测造成的干扰，有效消除基质效应的影响，使人参中有效成分含量测定结果更为准确，是一种符合中药特点的人参有效成分含量测定方法，将为人参质量控制研究提供方法支撑。

Claims (4)

1.一种用于检测人参中有效成分含量的分析方法，包括以下步骤：

（1）精密称取标准品适量，用甲醇溶解后，配制混合标准溶液母液备用；

（2）用人参药材提取液将混合标准溶液母液稀释成系列浓度标准工作溶液，取药材提取液作为对照样品；

（3）制作标准校正曲线；

（4）人参中有效成分含量测定。

2.如权利要求1所述一种用于检测人参中有效成分含量的分析方法，其中有效成分为人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd。

3.如权利要求1所述一种用于检测人参中有效成分含量的分析方法，其中所述系列浓度标准工作溶液可为1~6个浓度，或6个以上浓度，应能确保目标分析物标准校正曲线准确、可靠。

4.如权利要求1所述一种用于检测人参中有效成分含量的分析方法，其中含量测定中使用检测器为任意用于中药含量测定研究检测器，优选紫外检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器。