CN106018582B - 从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分及其制备方法与应用 - Google Patents

从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从海洋低值贝类(四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤、毛蚶、青蛤、竹蛏、西施舌等)中分离纯化核苷类化学成分的方法，该方法包括(1)贝类软体水提醇沉上清液的制备；(2)大孔吸附树脂柱粗分离；(3)阳离子交换树脂的分离纯化。本发明提供的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，工艺设计合理，可操作性强，生产周期短，成本低，环保性强，制备得到的核苷类成分纯度高，具有很好的保肝护肝功效，本发明可充分利用四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤等低值贝类资源，具有重要的经济价值。

Description

从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及一种海洋低值贝类，具体涉及一种从海洋低值贝类(四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤、毛蚶、青蛤、竹蛏、西施舌等)中分离纯化得到的核苷类化学成分及其制备方法。
背景技术
江苏沿海面积广阔，在潮间带具有丰富的海洋生物资源，尤其以低值贝类资源如四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤等产量巨大。海洋贝类蛤蜊药用历史悠久，在古代文献中多有其功效的记载，现代研究表明具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等功效。核苷类成分不仅是构成RNA、DNA的基本组成，也是生物氧化和能量代谢中的能源物质和抗病毒、抗肿瘤药物的中间体，特别是维持生物体的抗氧化，保持正常免疫功能，抗感染等方面具有重要的生理活性。目前关于低值贝类资源如四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤等中的核苷类化学成分研究报道较少。现有技术中主要存在的问题是：分离过程步骤较为繁琐，生产周期较长，生产成本较高，并且分离所用氯仿等萃取剂或洗脱剂，环保性差，且分离得到核苷类物质的种类少，纯度低，价值低。
因此，为了充分利用四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤等低值贝类资源，很有必要在现有技术的基础之上，深度开发研究其活性成分，开发其新的应用价值。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种操作简便、绿色环保、综合成本低、生产周期短的从海洋低值贝类中纯化分离核苷类成分的方法。本发明另一个目的是提供从海洋低值贝类中纯化分离核苷类成分的应用。
技术方案，为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分，它包括肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶和2-脱氧鸟苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、2-脱氧肌苷、尿苷、胸苷、2-脱氧尿苷、胞嘧啶、胞苷、鸟苷酸、尿苷酸、肌苷酸、腺苷酸、胞苷酸。
一种从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，包括以下步骤：
(1)贝类软体水提醇沉上清液的制备：
取新鲜的贝类软体，洗净沥干后，称重，加水煎煮，滤过，合并滤液，浓缩，离心去沉淀，得上清液，加入乙醇，静置，抽滤得上清液，上清液浓缩至无醇味，采用电渗析进行脱盐处理；
(2)大孔吸附树脂柱粗分离：
将步骤(1)制备得到的贝类软体水提醇沉上清液，上大孔吸附树脂柱进行层析，先用水进行洗脱除杂，再用体积浓度为5％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得大孔吸附树脂分离物；
(3)阳离子交换树脂的进一步分离：
将步骤(2)制备得到的大孔吸附树脂分离物，上阳离子交换树脂柱，先用水洗杂，再用体积浓度为3％的氨水和体积浓度30％乙醇混合溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得核苷类成分。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，贝类软体为四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤、毛蚶、青蛤、竹蛏或西施舌。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(1)加入3～10倍量水，加热煎煮2～3次，每次20～60min。
作为优选方案，以上所述从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(1)电渗析方法为，电压15-30V，上样浓度为10-40g(固含)/L，脱盐时间为1-4h。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(2)中大孔吸附树脂为型号为SP207型大孔吸附树脂，上样量是1-3倍柱体积，水洗倍数是2-6倍柱体积；乙醇洗脱液用量是5-20倍柱体积。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(3)最大上样量是10倍柱体积；水洗倍数是3-8倍柱体积；步骤(3)碱性乙醇的洗脱体积是3-8倍柱体积。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(3)阳离子交换树脂为型号001*7型强酸性阳离子交换树脂。
作为优选方案，以上所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，步骤(3)核苷类成分包括肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶和2-脱氧鸟苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、2-脱氧肌苷、尿苷、胸苷、2-脱氧尿苷、胞嘧啶、胞苷、鸟苷酸、尿苷酸、肌苷酸、腺苷酸、胞苷酸等。
本发明制备得到的从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分在制备保肝、护肝、抗氧化的药物或保健品中的应用。
有益效果：本发明制备得到的从海洋低值贝类中分离纯化得到的核苷类成分含有纯度高的肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、2-脱氧鸟苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、2-脱氧肌苷、尿苷、胸苷、2-脱氧尿苷、胞嘧啶、胞苷、鸟苷酸、尿苷酸、肌苷酸、腺苷酸、胞苷酸等，实验结果表明具有很好的保肝、护肝、抗氧化功效。
本发明提供的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，工艺设计合理，可操作性强，生产周期短，成本低，环保性强，制备得到的核苷类成分纯度高，可充分利用四角蛤蜊、菲律宾蛤仔、文蛤、青蛤等低值贝类资源，具有重要的经济价值。
附图说明
图1为核苷成分对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血清ALT影响的柱状图。
图2为核苷成分对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血清AST影响的柱状图。
图3为核苷成分对CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝脏指数影响的柱状图。
图4为核苷成分对CCl4致急性肝损伤模型小鼠血浆中SOD影响的柱状图。
图5为核苷成分对CCl4致急性肝损伤模型小鼠肝脏中MDA影响的柱状图。
具体实施方式
实施例1
一种从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，包括以下步骤：
(1)四角蛤蜊醇沉上清液的制备：取新鲜的四角蛤蜊软体，洗净沥干后，称重，加3倍量水煎煮加热回流2次，每次45min，滤过，合并滤液，浓缩，离心去沉淀，得上清液，加入乙醇使乙醇浓度为80％，静置过夜，抽滤得上清液；上清液浓缩至无醇味，采用电渗析进行脱盐，电压为30V，上样浓度为30g(固含)/L，脱盐时间为1.5h。
(2)大孔吸附树脂柱粗分离：取步骤(1)制备得到的四角蛤蜊软体水提醇沉上清液1.6倍柱体积，上SP207型大孔吸附树脂柱进行层析，先用2-3倍柱体积水进行洗杂，再用8-10倍柱体积的5％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，得大孔吸附树脂分离物；
(3)阳离子交换树脂的进一步分离：将10倍柱体积的大孔吸附树脂分离物上001*7型强酸型阳离子交换树脂，先用4～5倍柱体积水洗杂，再用4～5倍柱体积的3％氨水和30％乙醇混合液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得纯度高的核苷类成分。
(4)核苷类成分的含量测定：精密称取肌苷标准品适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。测定于260nm波长下的吸光度，以肌苷为对照品，计算总核苷的含量。
另取核苷、核苷酸标准品适量，精密称定，进行HPLC分析，测定肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤鸟苷酸等主要成分的含量。
具体色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×250mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇(A)-0.1％乙酸水(B)，梯度洗脱：0～8min，0-2％A；8～30min，2％-6％A；30～40min，6％-10％A；40～50min，10％-30％A；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm，进样体积：10μL。
测量得到核苷成分含量(肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、2-脱氧鸟苷)百分含量为79.8％。
四角蛤蜊经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蛤蜊科动物四角蛤蜊Mactra veneriformisReeve的新鲜软体。
实施例2
一种从菲律宾蛤仔中分离纯化核苷类成分的方法，包括以下步骤：
(1)菲律宾蛤仔醇沉上清液的制备：取新鲜的菲律宾蛤仔软体，洗净沥干后，称重，加3倍量水加热回流2次，每次60min，滤过，合并滤液，浓缩，离心去沉淀，得上清液，加入乙醇使乙醇浓度为75％，静置过夜，抽滤得上清液。上清液浓缩至无醇味，采用电渗析进行脱盐，电压为20V，上样浓度为20g(固含)/L，脱盐时间为2h。
(2)大孔吸附树脂柱粗分离：取步骤(1)制备得到的菲律宾蛤仔软体水提醇沉上清液2倍柱体积，上SP207型大孔吸附树脂柱进行层析，先用3倍柱体积水进行洗杂，再用8倍柱体积的5％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，得大孔吸附树脂分离物；
(3)阳离子交换树脂的进一步分离：将8倍柱体积的大孔吸附树脂分离物上001*7型强酸型阳离子交换树脂，先用5倍柱体积水洗杂，再用5倍柱体积的3％氨水和30％乙醇混合液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得纯度高的核苷类成分。
(4)核苷类成分的含量测定：精密称取肌苷标准品适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。测定于260nm波长下的吸光度，以肌苷为对照品，计算总核苷的含量。
另取核苷、核苷酸标准品适量，精密称定，进行HPLC分析，测定肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤鸟苷酸等主要成分的含量。
具体色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×250mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇(A)-0.1％乙酸水(B)，梯度洗脱：0～8min，0-2％A；8～30min，2％-6％A；30～40min，6％-10％A；40～50min，10％-30％A；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm，进样体积：10μL。
测量得到核苷成分含量(肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、2-脱氧鸟苷)百分含量为74.5％。
菲律宾蛤仔经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为帘蛤科动物菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的新鲜软体。
实施例3
一种从毛蚶中分离纯化核苷类成分的方法，包括以下步骤：
(1)毛蚶醇沉上清液的制备：取新鲜的毛蚶软体，洗净沥干后，称重，加4倍量水加热回流2次，每次50min，滤过，合并滤液，浓缩，离心去沉淀，得上清液，加入乙醇使乙醇浓度为80％，静置过夜，抽滤得上清液。上清液浓缩至无醇味，采用电渗析进行脱盐，电压为30V，上样浓度为34g(固含)/L，脱盐时间为1.5h。
(2)大孔吸附树脂柱粗分离：取步骤(1)制备得到的毛蚶软体水提醇沉上清液1.5倍柱体积，上SP207型大孔吸附树脂柱进行层析，先用4倍柱体积水进行洗杂，再用10倍柱体积的5％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，得大孔吸附树脂分离物；
(3)阳离子交换树脂的进一步分离：将9倍柱体积的大孔吸附树脂分离物上001*7型强酸型阳离子交换树脂，先用4倍柱体积水洗杂，再用8倍柱体积的3％氨水和30％乙醇混合液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得纯度高的核苷类成分。
(4)核苷类成分的含量测定：精密称取肌苷标准品适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。测定于260nm波长下的吸光度，以肌苷为对照品，计算总核苷的含量。
另取核苷、核苷酸标准品适量，精密称定，进行HPLC分析，测定肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤鸟苷酸等主要成分的含量。
具体色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge C18(4.6×250mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇(A)-0.1％乙酸水(B)，梯度洗脱：0～8min，0-2％A；8～30min，2％-6％A；30～40min，6％-10％A；40～50min，10％-30％A；流速：0.5mL/min；检测波长：254nm，进样体积：10μL。
测量得到核苷成分含量(肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、2-脱氧鸟苷)百分含量为72.8％。
毛蚶经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蚶科动物毛蚶Scapharcasubcrenata的新鲜软体。
实施例4核苷类成分对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用评价
1、实验分组：
取ICR的雄性小鼠随机分成6个组，每组12只，分别为正常对照组，联苯双酯阳性药组(150mg/kg)，CCl4模型组和本发明实施例1制备得到的核苷成分(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg共3个剂量组)。
2、实验方法：
正常对照组和CCl4模型组灌胃给予0.2mL/10g的蒸馏水，各给药组分别灌胃给予0.2mL/10g的各剂量核苷成分，连续灌胃七天后，于第七天灌胃给药一个小时后，正常对照组的小鼠按照体重0.2mL/10g来腹腔注射花生油溶液，其它六个组的小鼠都是按照体重0.2mL/10g腹腔注射含有0.1％CCl4的花生油溶液。禁食(不禁水)16h，称量体重，取血后，测定血清中谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的水平。取血后，将小鼠立即进行解剖，迅速取出整个肝脏组织，称量总肝脏重量，同时取一小块约0.5g的肝组织用生理盐水制成10％的肝匀浆，低温离心后吸取上清部位，用黄嘌呤氧化酶法测定肝匀浆上清部位中SOD活力，用硫代巴比妥酸法测定肝匀浆上清部位中MDA含量。
3、实验结果：
如图1至图3的实验结果表明，本发明制备得到的核苷成分具有明显的预防并减轻CCl4诱导引起小鼠急性肝损伤，能有效的缓解因CCl4引起的小鼠肝细胞的损伤，能减轻因肝细胞损伤引起的血清中ALT及AST含量的上升，抑制CCl4诱导的化学性肝损伤小鼠肝脏指数的升高，同时能提高SOD，表明本发明纯化得到的核苷成分可开发成保肝活性的药品或保健品，具有重要的应用价值。
实施例5核苷类成分对小鼠急性肝损伤氧化应激的保护作用评价
1、实验分组：
取ICR的雄性小鼠随机分成7个组，每组12只，分别为正常对照组，联苯双酯阳性药组(150mg/kg)，CCl4模型组和本发明实施例1制备得到的核苷成分(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg共4个剂量组)。
2、实验方法：
正常对照组和CCl4模型组灌胃给予0.2mL/10g的蒸馏水，各给药组分别灌胃给予0.2mL/10g的各剂量核苷成分，连续灌胃七天后，于第七天灌胃给药一个小时后，正常对照组的小鼠按照体重0.2mL/10g来腹腔注射花生油溶液，其它六个组的小鼠都是按照体重0.2mL/10g腹腔注射含有0.1％CCl4的花生油溶液。禁食(不禁水)16h，称量体重，取血后，测定血清中超氧化歧化酶SOD的水平。取血后，将小鼠立即进行解剖，迅速取出肝脏组织，取约0.5g的肝组织用生理盐水制成10％的肝匀浆，低温离心后吸取上清部位，用黄嘌呤氧化酶法测定血清与肝匀浆上清部位中SOD活力，用硫代巴比妥酸法测定肝匀浆上清部位中MDA含量，用BCA法测定其中蛋白含量。
3、实验结果：
自由基是启动脂质过氧化的关键性因素，肝脏损伤越严重，其自由基含量越多。MDA含量常反映了机体内脂质过氧化的程度，间接显示体内过氧化的程度。而SOD活力可显示机体清除氧自由基的能力，故通常将MDA与SOD的测定相互配合。如图4、图5的实验结果表明，本发明制备得到的核苷成分能显著提高CCL4所致的小鼠急性肝损伤中S0D活力，显著降低MDA含量，故说明核苷类成分具有明显的抗氧化作用，表明本发明纯化得到的核苷成分可开发成抗氧化活性的药品或保健品，具有重要的应用价值。
应当指出的是，以上具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。本领域的普通技术人员，根据此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims (4)

1.一种从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)贝类软体水提醇沉上清液的制备：
取新鲜的贝类软体，洗净沥干后，称重，加水煎煮，滤过，合并滤液，浓缩，离心去沉淀，得上清液，加入乙醇，静置，抽滤得上清液，上清液浓缩至无醇味，采用电渗析进行脱盐处理，电渗析方法为，电压15-30V，上样浓度为10-40g/L，脱盐时间为1-4h；
(2)大孔吸附树脂柱粗分离纯化：
将步骤(1)制备得到的贝类软体水提醇沉上清液，上SP207型大孔吸附树脂柱进行层析，上样量是1～3倍柱体积，先用水进行洗脱除杂，水洗倍数是2-6倍柱体积，再用体积浓度为5％乙醇水溶液进行洗脱，乙醇洗脱液用量是5-20倍柱体积，收集洗脱液，减压浓缩，得大孔吸附树脂分离物；
(3)阳离子交换树脂分离纯化：
将步骤(2)制备得到的大孔吸附树脂分离物，上001*7型强酸性阳离子交换树脂柱，先用水洗杂，再用体积浓度为3％的氨水和体积浓度30％乙醇混合溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，即得包括肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶和2-脱氧鸟苷的核苷类成分。
2.根据权利要求1所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，其特征在于，贝类软体为四角蛤蜊、菲律宾蛤仔或文蛤。
3.根据权利要求1所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，其特征在于，步骤(1)加入3～10倍量水，加热煎煮2～3次，每次20～60min。
4.根据权利要求1所述的从海洋低值贝类中分离纯化核苷类成分的方法，其特征在于，步骤(3)最大上样量是10倍柱体积；水洗倍数是3-8倍柱体积；步骤(3)碱性乙醇的洗脱体积是3-10倍柱体积。
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