CN101040932A - 扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，包括：(1)桃仁供试品制备：(2)梯度洗脱流动相：(3)标准指纹图谱的建立：选取含量最高的苦杏仁苷为指标成分峰；(4)指纹图谱的质量控制a.样品真伪的鉴别各特征峰的相对保留时间，2号峰0.62、4号峰0.89、5号峰1.00，b.样品质量评价，将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以7个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。(5)桃仁采收方法；本发明能全面控制原料的质量，确保产品的质量稳定。
Description
技术领域
本发明属桃仁原料质量控制方法领域，特别是涉及一种扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法。
背景技术
桃仁(Semen Persicae)来源于蔷薇科(Rosaceae)植物桃[Prunus persica(L.)Batsch]的种子。始载于《神农本草经》。性平，味苦、甘。入肺，心、肝、大肠四经。具有活血祛痰，润燥滑肠之功，常用于经闭.症瘕.热病蓄血，肺瘀.肠痫，血滞风痹，跌打损伤所致内外伤瘀血及肠燥便秘等。
《中国植物志》描述桃为落叶乔木，高3～8m。叶互生，叶片长圆针形、椭圆披针形或倒卵状披针形，长7-15厘米，宽2-3.5厘米，先端渐尖，基部宽楔形，上面无毛，下面在脉腋间具少数短柔毛或无毛，叶边具细锯齿或粗锯齿，齿端具腺体或无腺体。花通常单生，先于叶开放，直径约2.2～3.5cm，花梗极短或几无梗；萼筒钟形；花瓣多为5，长圆状椭圆形至宽倒卵形，粉红色，罕为白色；雄蕊20-30，花药绯红色；花柱细长，几与雄蕊等长或稍短；子房被短柔毛。果实形状大小均有不同，卵形、宽椭圆形或近球形等，直径(3)5～7(12)cm，表面有短绒毛，稀无毛，果肉白色、浅绿白色、黄色、橙黄色或红色，核大，离核或粘核。种子1枚，扁卵状心形。花期3～4月，果熟期6～9月。
桃原产中国，各地普遍栽培，北起吉林，南到广东，西自新疆、西藏，东至滨海各省和台湾都有桃的栽培。喜阳光和温暖的气候，在肥沃高燥的砂质壤土中生长最好。怕涝，在低洼碱性土壤中生长不良。幼树抗寒力弱，容易冻梢。耐修剪，寿命较短。
桃仁全国大部分地区有产，主产于四川、云南、陕西、山东、北京、河北、山西、河南、新疆等地。
《中国药典》描述：桃仁呈扁长卵形，长1.2～1.8cm，宽0.8～1.2cm，厚0.2～0.4cm。表面黄棕色至红棕色，密布颗粒状突起。一端尖，中部膨大，另端钝圆稍扁斜，边缘较薄。尖端一侧有短线形种脐，圆端有颜色略深不甚明显的合点，自合点处散出多数纵向维管束。种皮薄，子叶2，类白色，富油性。气微，味微苦。
查阅国内外发表的文献，只有HPLC法测定桃仁中苦杏仁苷的含量，但是没有桃仁指纹图谱分析的报道。因此本发明将弥补指纹图谱研究的空白。同时本方法采用甲醇超声提取方法，防止了水回流提取过程中苦杏仁苷的异构化，同时也使苦杏仁酶失活，提高了分析方法的重复性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀植物药制剂中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，该方法能全面控制原料药材的质量，确保产品的质量稳定。
本发明的技术方案如下：
一种扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤：
(3)松花粉供试品制备
桃仁粉碎，按照四分法取样。称取0.500g桃仁，加入25ml甲醇，超声提取20-60min，取上清液用水稀释1倍后，过0.22-0.45um微孔滤膜，取续滤液进样；
(4)梯度洗脱流动相
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为：
1)梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | A相：水(％) | B相：乙腈(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 30 | 54 | 46 |
柱温：20-40℃，检测波长：210nm，流速：0.8-1.2ml/min，进样量：5-10μl。
(3)标准指纹图谱的建立
选取10批不同批号的样品，进行高效液相色谱指纹图谱分析。对合适样品的HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了7个共有峰，并按出峰时间先后次序进行编号(图1)。
在共有峰里选取了3个特征峰，分别为2号峰、4号峰、5号峰苦杏仁苷。
根据LC-MS-MS的鉴定结果，桃仁的高效液相色谱指纹图谱表达了糖苷类组分的分布特性。选取含量最高的苦杏仁苷作为指标成分峰。
从十批样品的HPLC指纹图谱中按照以下原则选取一批桃仁药材的指纹图谱作为对照指纹图谱(图1)：结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。将指纹图谱和定量测定结果进行对照比较，剔除特别不合理的样品，优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。
(4)指纹图谱的质量控制
a.样品真伪的鉴别
根据公式计算十批药材指纹图谱中各特征峰的相对保留时间RRT，结合两个实验室的验证结果，确定了各特征峰的相对保留时间和范围(如表1所示)。
表1 桃仁药材HPLC指纹图谱鉴别峰相对保留时间及范围
| 峰号 | 2 | 4 | 5 |
| 归属RRT范围 | -0.60±0.03 | -0.88±0.03 | 苦杏仁苷1.00- |
根据实验条件对待测样品进行测定，得出样品的HPLC色谱图，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该药材。
b.样品质量评价
将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以7个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
本发明的另一种技术方案：
一种扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，包括：
桃仁采收方法，夏秋间采摘成熟果实。果实采摘后，取出果核，除净果肉及核壳，取出种子，晒干。
本发明的有益效果如下：
1、考察了供试品溶液的稳定性，结果表明，在室温下，24小时之内，桃仁供试品溶液保持稳定。同时考察公司贮藏的样品在1年内的稳定性，发现相似度大于0.9。
2、将指纹图谱与药材GAP基地的建设结合起来，在药材生产中就开始控制药材的质量，这样保证了指纹图谱的实施，并真正运用于药材质量控制。经过对药材基地十批桃仁药材的指纹图谱相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的桃仁指纹图谱质控方法，灵敏度高，重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以桃仁质量进行科学，有效的评价证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业药材鉴别和质量控制的需求。
附图说明
图1桃仁HPLC标准指纹图谱
图2桃仁样品指纹图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
桃仁粉碎，按照四分法取样。称取0.500g桃仁，加入25ml甲醇，超声提取20min，取上清液用水稀释1倍后，过0.22um微孔滤膜，取续滤液进样。色谱柱为Alltima柱(250*4.6mm，5um)；流动相A相为水，B相为乙腈；线性梯度洗脱：0-30min，5％-46％B；流速1.0ml/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量20ul。
在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即苦杏仁苷对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；色谱柱柱效以苦杏仁苷计不少于30,000理论塔板数。药材样品指纹图谱见图2，特征峰的相对保留时间与相对峰面积见表1。
通过对十批以上桃仁药材的相似度进行计算，发现9批药品材相似度在0.9-1.0之间。说明建立的桃仁指纹图谱质控方法，操作简便，方法可靠，证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业药材鉴别和质量控制的需求。
Claims (4)
1.一种扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤：
(1)桃仁供试品制备
桃仁粉碎，按照四分法取样，称取0.500g桃仁，加入25ml甲醇，超声提取20-60min，取上清液用水稀释1倍后，过0.22-0.45um微孔滤膜，取续滤液进样；
(2)梯度洗脱流动相
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱条件为：柱温：20-40℃，检测波长：210nm，梯度洗脱：0-30min，95-54％A、5-46％B，流速：0.8-1.2ml/min，进样量：5-10μl；
(3)标准指纹图谱的建立
确定7个共有峰，选取3个特征峰，分别为2号峰、4号峰、5号峰苦杏仁苷，选取含量最高的苦杏仁苷为指标成分峰；
(4)指纹图谱的质量控制
a.样品真伪的鉴别
特征峰的相对保留时间RRT，2号峰0.60、4号峰0.88、5号峰1.00，
各特征峰存在，相对保留时间吻合，则确定为该桃仁；
b.样品质量评价
将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行比较。以7个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
2.根据权利要求所述的扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于：所述步骤3确定疗效的药材的指纹图谱，含量在平均值附近的样品的指纹图谱。
3.根据权利要求所述的扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于：所述步骤3选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。
4.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中桃仁原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于：所述的桃仁采收方法，夏秋间采摘成熟果实。果实采摘后，取出果核，除净果肉及核壳，取出种子，晒干。
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