CN113484427A - 化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，该测定方法以D‑苦杏仁苷为对照品，以乙腈为流动相A，以磷酸为流动相B，并按照预设的洗脱程序进行洗脱，以使D‑苦杏仁苷峰与L‑苦杏仁苷峰分离，且两者均与基线分离。本发明还公开了上述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法在化湿败毒组合物制备中的应用。本发明的测定方法专属性良好，稳定性好，准确可靠。根据上述方法，可对化湿败毒组合物成品药中D‑苦杏仁苷的含量进行准确测定，从而为化湿败毒组合物的质量控制、配方调整以及制备工艺的选择、工艺参数的控制提供良好的数据基础。

Description

化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法及其应用
技术领域
本发明涉及中药质量检测技术领域，尤其涉及一种化湿败毒组合物中苦杏 仁苷的测定方法及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)感染引起的肺炎疫情，目前已在全球范围 内形成大流行。然而在制备过程中，如何结合工艺放大研究和临床试验用样品 制备，细化工艺参数，加强质量研究，确定活性成分物质基础，进一步保证疗 效成为亟待解决的技术难题。
另一方面，对于苦杏仁而言，其主要成分为苦杏仁苷，具有止咳平喘的药 理作用。然而，针对杏仁有效成分的研究表明，苦杏仁苷具有L型和D型的同 分异构体。其中，D-苦杏仁苷与L-苦杏仁苷互为异构体，其药物活性不同，且 存在显著毒性差异。即成品药中D-苦杏仁苷与L-苦杏仁苷的比例可能影响到相 关的药效和毒性。此外，也有研究表明，D-苦杏仁苷是主要发挥药效的部分， 同时也是主要发挥毒性的组分。D-苦杏仁苷在40℃(也有研究表明为60℃)以 上后会转变为L-苦杏仁苷，会部分弱化苦杏仁的作用。由此来看，准确测定苦 杏仁苷的含量意义重大。
然而，现有技术的测定方法中，要么难以同时检测出D-苦杏仁苷峰与L-苦 杏仁苷峰，要么难以实现D-苦杏仁苷峰和L-苦杏仁苷峰的基线分离。如《HPLC 法测定橘红丸中苦杏仁苷的含量》采用的是甲醇-水(15:85)作为流动相，色谱 图中苦杏仁苷峰为单一峰。又如《HPLC法测定麻杏止咳糖浆中盐酸麻黄碱、苦 杏仁苷的含量》采用的是乙腈-磷酸二氢钾(0.02mol/L，含0.1％磷酸和0.1％三 乙胺)(8:92)作为流动相，色谱图中D-苦杏仁苷峰无法与L-苦杏仁苷峰实现 基线分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种化湿败毒组合物中苦杏仁苷的 测定方法，其可有效测定化湿败毒组合物成品药中D-苦杏仁苷的含量，为产品 质量控制，配方设计和制备工艺设计提供良好的数据基础。
本发明还要解决的技术问题在于，提供化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定 方法在化湿败毒组合物制备中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种化湿败毒组合物中苦杏仁苷的 测定方法，所述化湿败毒组合物主要包括下述组分：麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90 份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒 苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄 2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量；该测定 方法以D-苦杏仁苷为对照品，以乙腈为流动相A，以磷酸为流动相B，并按照 预设的洗脱程序进行洗脱，以使D-苦杏仁苷峰与L-苦杏仁苷峰分离，且两者均 与基线分离；
所述预设的洗脱程序为：
0～5min，流动相A为0％，流动相B为100％；
5～7min，流动相A从0％→3％，流动相B从100％→97％；
7～20min，流动相A从3％→6％，流动相B从97％→94％；
20～23min，流动相A从6％→80％，流动相B从94％→20％；
23～28min，流动相A为80％，流动相B为20％；
28～30min，流动相A从80％→0％，流动相B从20％→100％；
30～35min，流动相A为0％，流动相B为100％。
作为上述技术方案的改进，所述测定方法包括：
(1)取D-苦杏仁苷对照品，加提取溶剂制成对照品溶液；
(2)取化湿败毒组合物，利用提取溶剂提取，制得供试品溶液；
(3)吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到所述化湿 败毒组合物中D-苦杏仁苷的含量；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基 硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B。
作为上述技术方案的改进，所述提取溶剂为稀乙醇或甲醇，所述甲醇的体 积分数为50～70％。
作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，提取方式为加热回流提取，提取 时间为30～60min。
作为上述技术方案的改进，所述供试品溶液由下述方法制得：
取化湿败毒组合物0.8～1.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇20～30mL， 称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的 重量，离心，取上清液8～15mL，回收甲醇至3～6mL后转移至容量瓶中，用70％ 甲醇定容后摇匀滤过，取续滤液，即得。
作为上述技术方案的改进，所述对照品溶液由下述方法制得：
取D-苦杏仁苷对照品，加70％甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。
作为上述技术方案的改进，所述测定方法中，液相色谱仪的色谱柱以十八 烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱仪以乙腈为流动相A，0.2vol％磷酸水溶 液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.28～0.32mL/min，检测波长为210nm，柱 温为18～22℃。
作为上述技术方案的改进，所述测定方法中，液相色谱仪以Agilent SB-AQ C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗 脱，流速为0.3mL/min，检测波长为210nm，柱温为20℃。
作为上述技术方案的改进，所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中 药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
相应的，本发明还公开了上述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法在 化湿败毒组合物制备中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明建立了化湿败毒组合物中D-苦杏仁苷的测定方法，该测定方法专属 性良好，稳定性好，准确可靠。根据上述方法，可对化湿败毒组合物成品药中 D-苦杏仁苷的含量进行准确测定，从而为化湿败毒组合物的质量控制、配方调 整以及制备工艺的选择、工艺参数的控制提供良好的数据基础。
附图说明
图1是对照品溶液的HPLC图；其中，峰1为D-苦杏仁苷峰；
图2是阴性样品溶液的HPLC图；
图3是供试品溶液的HPLC图；其中，峰1为D-苦杏仁苷峰，峰2为L-苦 杏仁苷峰；
图4是D-苦杏仁苷对照品的总离子流图(ESI-模式)；
图5是D-苦杏仁苷对照品溶液的一级质谱图；
图6是D-苦杏仁苷对照品溶液的二级质谱图；
图7是化湿败毒组合物样品的总离子流图(ESI-模式)
图8是化湿败毒组合物样品的一级质谱图；
图9是化湿败毒颗粒样品的二级质谱图(峰保留时间：15.59)；
图10是化湿败毒颗粒样品的二级质谱图(峰保留时间：16.20)；
图11是苦杏仁苷对照品标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实 施方式对本发明作进一步地详细描述。
本发明中，化湿败毒组合物包括以下重量份的组分：
麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广 藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半 夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份， 赤芍5-100份，辅料适量。
其中，麻黄、广藿香、石膏为君药，麻黄、广藿香，辛、苦、温兼气味芳 香，解表平喘，化湿和中；石膏，辛、甘、寒，清泻肺胃郁热兼以生津，三药 相辅，以达解表散寒、芳香化湿、清热平喘之效。炒苦杏仁、法半夏、厚朴、 麸炒苍术、炒草果仁、茯苓共为臣药，炒苦杏仁、法半夏、厚朴，辛、苦、温， 行气降逆，开结平喘；麸炒苍术、炒草果仁，辛烈、苦温，入脾胃经，燥湿健 脾、破戾气所结；茯苓，淡渗除湿健脾；六味药共用以达助君药燥湿健脾，行 气通窍，疏泄腠理，助邪外出之效。以黄芪、赤芍、葶苈子、大黄为佐药，黄 芪，甘温益肺脾气，赤芍，苦、微寒，凉血散瘀，用以治疗疫病后期伤其正气， 气机郁闭导致的血瘀等；葶苈子辛寒，辅助君药石膏清泄肺热，兼以利水，预 防或治疗“湿肺(肺水肿)病变”；大黄，苦寒入大肠经而通腑，肺与大肠相表里， 辅助君药石膏清泄肺热，并配合赤芍凉血活血，四药共为佐药，以达顾护正气、 泻热凉血、活血化瘀之效。以甘草为使药，甘草甘平，调和诸药，配赤芍取芍药甘草汤意缓急。全方共奏解表化湿，清热平喘、益气散瘀之功。本发明化湿 败毒组合物配伍依据核心病机，以解表化湿，清热平喘，祛毒为核心治法，兼 以化瘀通络，益气养阴。疫毒与寒湿相合，恶寒发热，治宜解表化湿祛毒；疫 毒与湿热相合，便溏不爽，倦怠乏力，治宜清热化湿祛毒，兼以益气养阴；闭 阻胸肺，喘憋、胸闷、气短，治宜平喘，兼以化瘀通络。
所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散 剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。优选的为颗粒剂。
本发明提供了一种化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其对任意剂型 的化湿败毒组合物均可以起到良好的检测效果。具体的，在本发明中，化湿败 毒组合物中苦杏仁苷的测定方法包括：
(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径 为2.1mm，粒径为1.8μm，Agilent SB-AQ C18)；以乙腈为流动相A，0.2vol％ 磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为 20℃；流速为0.3mL/min。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7000。
流动相按如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0003062962530000051
(2)对照品溶液的制备：取D-苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％ 甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备：取化湿败毒组合物约1.0g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称 定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离心，取上清液10mL，回收70％甲醇至 适量，转移至5mL容量瓶中，加相应的溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
(4)分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各lμL，注入液相色谱仪【安 捷伦1290(DAD)高效液相色谱仪或赛默飞vanquish(VWD)高效液相色谱仪)】 测定，即得。
基于上述测定方法，可准确测定化湿败毒组合物成品中D-苦杏仁苷的含量。 进而为化湿败毒组合物药效研究，质量控制，配方调整以及制备工艺的选择、 工艺参数的控制提供良好的数据基础。
具体的，根据文献研究表明，苦杏仁中，D-苦杏仁苷是主要发挥药效的部 分。因此，可根据本发明测定得到的D-苦杏仁苷的含量对D-苦杏仁苷含量与化 湿败毒组合物药效之间的关系进行深入研究。从而对化湿败毒组合物的药效发 挥的具体机理进行深入研究。
此外，也可通过D-苦杏仁苷的测定为化湿败毒组合物成品设定相应的控制 标准，为维持化湿败毒组合物的质量稳定提供良好的基础。具体的，在本发明 中，通过大量的研究表明，现有的化湿败毒组合物中D-苦杏仁苷的含量应维持 在1.4～4.1mg/g。
具体的，根据文献研究表明，麻黄与苦杏仁相配伍，可有效促进D-苦杏仁 苷的溶出，并且麻黄可有效促进苦杏仁苷的立体代谢，从而降低其毒性。在此 基础上，在保证药效的基础上，可对现有化湿败毒组合物中麻黄、苦杏仁的比 例进行研究，以提升药效。同样的，也可对其他药物与苦杏仁配伍后D-苦杏仁 苷的溶出量进行研究，进而对相应药物与苦杏仁的配比进行调节，以提升药效。 即通过本发明中化湿败毒组合物中D-苦杏仁苷含量的测定，可为化湿败毒组合 物配方调整提供数据基础。
具体的，根据文献研究表明，在自然界中并不存在L-苦杏仁苷，L-苦杏仁 苷是在D-苦杏仁苷加热过程(＞40℃)中所产生的。可见，提取温度对两者的 含量有较大的影响。此外，文献研究也表明在酸性环境、碱性环境下两者存在 的比例是不同的。因此，可根据上述信息对提取工艺进行选择与优化，如可考 虑选择提取温度较低的回流提取工艺代替现有的煎煮，或可以在提取过程中加 入少量可挥发性的酸、碱以调整提取产物中两者的比例。即通过本发明中化湿 败毒组合物中D-苦杏仁苷含量的测定，可为化湿败毒组合物的备工艺的选择、 工艺参数的控制提供良好的数据基础。
以下对本发明中苦杏仁苷的测定方法进行方法学考察：
1 样品前处理考察
1.1 提取溶剂的选择
考察不同的提取溶剂【100％甲醇、70％甲醇、50％甲醇、70％乙醇、稀乙醇 (参中国药典第三部通则和指导原则试液部分)】。取化湿败毒颗粒(批号 J2004007，广东一方制药有限公司)研细，称取约1.0g，共10份，精密称定， 置具塞锥形瓶中，分别精密加入上述溶剂25mL，称定重量，超声处理(功率 300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重 量，离心，取上清液10mL，回收溶剂至适量，转移至5mL容量瓶中，加相应的溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，测定结果见表2。
表2不同提取溶剂的测定结果表
Figure BDA0003062962530000071
从表2看出，采用70％甲醇作为提取溶剂时，苦杏仁苷含量最高，故选择 70％甲醇作为提取溶剂。
1.2提取方法的选择
考察不同提取方法(超声处理、加热回流提取)。取化湿败毒颗粒(批号 J2004007，广东一方制药有限公司)研细，称取约1.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，分别加热回流/超声处理30min(功 率300W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离 心，取上清液10mL，回收70％甲醇至适量，转移至5mL容量瓶中，加70％甲 醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，测定结果见表3。
表3不同提取方法的测定结果表
Figure BDA0003062962530000081
从表3看出，超声提取与加热回流提取比较，加热回流方式提取苦杏仁苷 含量更高，故采用加热回流提取。
1.3提取时间的选择
考察不同提取时间(15分钟、30分钟、60分钟)。取化湿败毒颗粒(批号 J2004007，广东一方制药有限公司)研细，称取约1.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，分别加热回流15/30/60min，放冷， 再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离心，取上清液10mL，回收70％甲 醇至适量，转移至5mL容量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液， 即得，测定结果见表4。
表4不同提取时间的测定结果表
Figure BDA0003062962530000082
从表4看出，当提取时间为15分钟、30分钟和60分钟，苦杏仁苷含量没 有明显差异，为了提取完全，选择提取时间为30分钟。
2 样品方法学验证
2.1 专属性考察
制备缺炒苦杏仁的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制备阴性溶液。 将阴性溶液、供试品溶液和对照品溶液分别注入液相色谱仪，进行测试。测试 结果如图1～图3所示。由图中可以看出，供试品溶液的色谱中存在与对照品溶 液色谱相同保留时间的色谱峰，且阴性溶液无干扰，故该方法专属性良好。
此外，发明人还对色谱图中的峰1与峰2进行了色谱峰指认研究，具体如 下：
2.2色谱峰指认研究
2.2.1仪器与药剂
仪器：赛默飞QE Focus液质联用仪
试药：化湿败毒颗粒(批号：J2004007，广东一方制药有限公司)，乙腈(默 克公司)；磷酸；水为超纯水，其它试剂均为分析纯；
对照品为中国食品药品检定研究院提供的批号为110820-20180的苦杏仁苷 (D-苦杏仁苷，纯度88.2％)。
2.2.2色谱条件
色谱柱：Agilent SB-AQ C18(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相：以乙腈为流 动相A，0.2vol％磷酸溶液为流动相B，按表1规定进行梯度洗脱；流速：0.3 mL/min；柱温：20℃。
2.2.3质谱条件
氮气作为质谱离子源的雾化和干燥气；电喷雾电离负离子模式；喷雾电压：3.0kV；Lens电压：65V；脱溶剂气温度：400℃；鞘气压力：50Arb；辅助气压 力：15Arb；质荷比范围：120-700；数据采集模式：centroid。
2.2.4参照物溶液的制备
取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含0.2mg的溶 液，即得。
2.2.5供试品溶液的制备
取化湿败毒颗粒研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲 醇补足减失的重量，离心，取上清液10mL，回收70％甲醇至适量，转移至5mL 容量瓶中，加相应的溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.6测定方法
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入液相色谱质谱仪。测定， 即得。
2.2.7色谱峰的指认
采用上述色谱和质谱分析条件，分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测。 通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及与对照品进行比对，确定化湿败 毒颗粒色谱图中D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷化合物。其中，D-苦杏仁苷与对照品 D-苦杏仁苷的色谱保留行为及质谱精确分子量信息进行了比对验证。
根据对照品溶液与供试品溶液的色谱保留行为，一级和二级质谱图完全一 致，化湿败毒颗粒中D-苦杏仁苷色谱峰和L-苦杏仁苷色谱峰得到了明确的化学 指认。D-苦杏仁苷对照品溶液总离子流图见图4，化湿败毒颗粒样品总离子流图 见图7。色谱峰的在色谱图中的保留时间、名称、CAS号、分子式和结构式见 表5。在图7中，化湿败毒颗粒样品两个色谱峰，保留时间分别为15.59和16.20 分钟，提取相应色谱峰的质谱图发现，两个色谱峰的一级质谱图和二级质谱图 基本一致。根据对照品指认，15.59分钟的色谱峰为L-苦杏仁苷，16.20分钟的 色谱峰为D-苦杏仁苷。两个色谱峰的分子式同为C20H27NO11，质荷比456.15为其[H]-离子。
表5色谱峰指认结果表
Figure BDA0003062962530000101
2.3线性范围考察
取苦杏仁苷对照品16.491mg，置10mL量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含 苦杏仁苷1454.506μg的对照品贮备溶液；精密量取上述对照品贮备溶液1mL， 分别置2mL、5mL、10mL、25mL、50mL、100mL容量瓶稀释，得到不同浓度 级别苦杏仁苷的对照品溶液。
分别精密吸取不同浓度苦杏仁苷对照品溶液(每1mL中含苦杏仁苷分别为 14.545μg、29.090μg、58.180μg、145.451μg、290.901μg、727.253μg、1454.506μg) 进行测定，按上述色谱条件测定，并以峰面积(Y)对苦杏仁苷浓度(X)进行 回归，绘制标准曲线。苦杏仁苷的线性曲线为：y＝0.0535x+0.0652，R2＝0.9999； 结果表明苦杏仁苷在14.545～1454.506μg/mL浓度范围内，峰面积与浓度线性关 系良好，结果见表6和图11。
表6线性关系考察测定结果表
Figure BDA0003062962530000111
2.4精密度考察
取同一浓度的对照品溶液(浓度：82.061μg/mL)，精密吸取同一对照品溶 液1μl，按前述下色谱条件重复进样测定6次，苦杏仁苷峰面积的相对标准偏差 RSD＜3％(见表7)，表明仪器精密度良好。
表7精密度考察测定结果表
Figure BDA0003062962530000112
2.5稳定性考察
取同一批化湿败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有限公司)制 成供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液1μl，分别于0，2，4，6，8，12，24 小时各进样1次，测定苦杏仁苷的峰面积，相对标准偏差RSD＜5％(见表8)， 表明供试品溶液在24小时内稳定。
表8稳定性考察测定结果表
Figure BDA0003062962530000121
2.6重复性考察
取同一批化湿败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有限公司)制 成6份供试品溶液，进行测定，测定苦杏仁苷含量的相对标准偏差RSD＜5％(表 9)，表明方法重复性良好。
表9重复性考察测定结果表
Figure BDA0003062962530000122
2.7中间精密度考察
由本项目组两位分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批化湿 败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有限公司)，用同一根色谱柱， 按正文方法制成6份供试品溶液，进行测定，苦杏仁苷含量的相对标准偏差 RSD<5％，表明该方法中间精密度较好。结果见表10。
表10中间精密度考察测定结果表
Figure BDA0003062962530000131
2.8回收率试验
采用加样回收法，取化湿败毒颗粒(批号J2004007，广东一方制药有限公 司)研细，称取约0.5g，精密称定，平行6份，置于具塞锥形瓶中，分别精密 加入苦杏仁苷对照品溶液(浓度：1378.831μg/mL)1mL，再精密加入70％甲醇 25mL，按拟定的供试品制备方法制备供试品溶液6份。按色谱条件进行测定， 按以下公式计算回收率，结果表明本法具有良好的加样回收率。结果见表11。
回收率＝(测得总量-样品中的量)/对照品加入量×100％
表11加样回收率试验测定结果表
Figure BDA0003062962530000132
2.9耐用性试验
2.9.1不同色谱柱耐用性考察
考察不同色谱柱对苦杏仁苷含量测定的影响，采用3根同品牌不同编号色 谱柱【Agilent SB-AQ C18(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱】，编号分别是BH266、 BH137、BH268。取同一批化湿败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有 限公司)制成2份供试品溶液，用上述3根色谱柱对样品进行测定。测定结果 见表12。
表12不同色谱柱苦杏仁苷含量测定结果表
Figure BDA0003062962530000141
结果显示，比较不同色谱柱的分离效果及含量值，各色谱柱分离效果良好， 含量RSD值均小于5％，表明该分析方法在不同色谱柱下分析耐用性良好。
2.9.2不同柱温耐用性考察
考察不同的柱温(18℃、20℃和22℃)对苦杏仁苷含量测定的影响。取同 一批化湿败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有限公司)按正文方法 制成2份供试品溶液，在上述3种柱温条件下对样品进行测定。结果见表13。
表13不同柱温下苦杏仁苷含量测定结果表
Figure BDA0003062962530000142
比较不同柱温条件下的分离效果及含量值，可以看出，各色谱柱分离效果 良好，含量RSD值均小于5％，表明该分析方法在不同柱温下分析耐用性良好。
2.9.3不同流速耐用性考察
考察不同流速(每分钟分别为0.28mL、0.30mL和0.32mL)对苦杏仁苷含 量测定的影响。同一批化湿败毒颗粒样品(批号J2004007，广东一方制药有限 公司)按正文方法制成2份供试品溶液，在上述3种流速下对样品进行测定。 结果见表14。
表14不同流速下苦杏仁苷含量测定结果表
Figure BDA0003062962530000151
比较不同流速的分离效果及含量值，可以看出，各色谱柱分离效果良好， 含量RSD值均小于5％，表明该分析方法在不同流速下分析耐用性良好。
2.10不同厂家、不同批次化湿败毒颗粒中苦杏仁苷含量的测定
化湿败毒颗粒研发过程中，分别在中国中医科学院西苑医院制剂室、华颐 药业有限公司以及广东一方制药有限公司三处进行了批量生产，用已建立的苦 杏仁苷含量测定方法对三个厂家的化湿败毒颗粒进行测定，结果见表15。
表15不同厂家化湿败毒颗粒苦杏仁苷测定结果
Figure BDA0003062962530000152
上述结果显示，7批大生产的苦杏仁苷含量范围为2.49～2.98mg/g。按照均 值的±50％作为上下限，暂定本品苦杏仁苷的含量限度为1.4～4.1mg/g。
综上所述，本发明建立了化湿败毒组合物中D-苦杏仁苷的测定方法，该测 定方法专属性良好，稳定性好，准确可靠。根据上述方法，可对化湿败毒组合 物成品药中D-苦杏仁苷的含量进行准确测定，从而为化湿败毒组合物的质量控 制、配方调整以及制备工艺的选择、工艺参数的控制提供良好的数据基础。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，所述化湿败毒组合物主要包括下述组分：麻黄3-60份，炒苦杏仁4.5-90份，生石膏7.5-150份，甘草1.5-30份，广藿香5-100份，厚朴5-100份，麸炒苍术7.5-150份，炒草果仁5-100份，法半夏4.5-90份，茯苓7.5-150份，大黄2.5-50份，黄芪5-100份，葶苈子5-100份，赤芍5-100份，辅料适量；其特征在于，该测定方法以D-苦杏仁苷为对照品，以乙腈为流动相A，以磷酸为流动相B，并按照预设的洗脱程序进行洗脱，以使D-苦杏仁苷峰与L-苦杏仁苷峰分离，且两者均与基线分离；
所述预设的洗脱程序为：
0～5min，流动相A为0％，流动相B为100％；
5～7min，流动相A从0％→3％，流动相B从100％→97％；
7～20min，流动相A从3％→6％，流动相B从97％→94％；
20～23min，流动相A从6％→80％，流动相B从94％→20％；
23～28min，流动相A为80％，流动相B为20％；
28～30min，流动相A从80％→0％，流动相B从20％→100％；
30～35min，流动相A为0％，流动相B为100％。
2.如权利要求1所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括：
(1)取D-苦杏仁苷对照品，加提取溶剂制成对照品溶液；
(2)取化湿败毒组合物，利用提取溶剂提取，制得供试品溶液；
(3)吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定得到所述化湿败毒组合物中D-苦杏仁苷的含量；其中，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B。
3.如权利要求2所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述提取溶剂为稀乙醇或甲醇，所述甲醇的体积分数为50～70％。
4.如权利要求2所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，提取方式为加热回流提取，提取时间为30～60min。
5.如权利要求2所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述供试品溶液由下述方法制得：
取化湿败毒组合物0.8～1.5g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇20～30mL，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，离心，取上清液8～15mL，回收甲醇至3～6mL后转移至容量瓶中，用70％甲醇定容后摇匀滤过，取续滤液，即得。
6.如权利要求2所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述对照品溶液由下述方法制得：
取D-苦杏仁苷对照品，加70％甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。
7.如权利要求1所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述测定方法中，液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，液相色谱仪以乙腈为流动相A，0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.28～0.32mL/min，检测波长为210nm，柱温为18～22℃。
8.如权利要求7所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述测定方法中，液相色谱仪以Agilent SB-AQ C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，0.2vol％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3mL/min，检测波长为210nm，柱温为20℃。
9.如权利要求1所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法，其特征在于，所述化湿败毒组合物被制成中药制剂，所述中药制剂为颗粒剂、汤剂、散剂、胶囊剂、口服液、片剂或丸剂。
10.如权利要求1～9任一项所述的化湿败毒组合物中苦杏仁苷的测定方法在化湿败毒组合物制备中的应用。
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