CN109752446A - 一种青钱柳药材的谱鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青钱柳药材的谱鉴别方法，包括如下步骤：（1）采用显微法初步鉴定青钱柳药材；（2）采用薄层色谱法鉴别青钱柳药材活性成分金丝桃苷和异槲皮苷，进行青钱柳的确认判断方法；（3）采用先碳化热解，再用ICP‑MS验证青钱柳的鉴定结果。本发明能够实现高效、准确地鉴别青钱柳药材，弥补了青钱柳药材显微鉴别的空白，结合薄层色谱法再鉴定，创新的采用先碳化热解，再用ICP‑MS验证的方法对青钱柳的鉴定结果验证，对提高和加强青钱柳药材的质量控制、保证产品质量具有重大意义；同时对临床用药的有效性与安全性具有重要指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及药材鉴别技术领域，具体是一种青钱柳药材的谱鉴别方法。
背景技术
青钱柳（Cyclocaryapaliurus（Batal.）Iljin.）是双子叶植物纲（Dicotyledoneae）胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属植物，是我国独有的单种属植物，是国家重点保护的濒危植物之一，属于三类保护植物。现代研究试验表明，青钱柳具有调节血脂、降血糖、增强免疫力等功效。据《中国中药资源纪要》记载，其树皮树叶具有清热解毒、祛痈止痛之功效，其根、茎、枝均可入药。
随着各相关学科领域的深入研究，近年来不断地有青钱柳新的分布的报道，化学成分不断被分离、鉴定，而有关免疫、降血压、血糖和抑制血清胆固醇升高等多方面的药理、药效学研究充分证实了青钱柳的药效。由于青钱柳的特殊生长环境、特殊的地理环境和重要的经济价值，使得人们的研究兴趣倍加强烈。
目前市场流通与销售的青钱柳药材，虽然可以用检验仪器的手段，证明青钱柳的若干标记物的存在，如槲皮素和山柰素的含量，但以上标记物较容易买到，而且不贵，理论上可以用来作为添加剂，所以理化检验既不能检出杂质，也不能辨别赝品。由于青钱柳价格高昂，为了保护消费者的利益，本领域需要建立准确鉴定青钱柳药材的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对目前青钱柳药材显微鉴别的空白，提出了一套以显微鉴别结合薄层色谱鉴别的综合判别方法和指标。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种青钱柳药材的鉴别方法，包括如下步骤：
（1）将未粉碎的待检青钱柳药材1g用二甲基亚砜浸泡1~3小时，再取出用FAA标准液固定，-5~0℃冷冻干燥以后，分别制成表面涂片和横切面涂片以后，依次置于电子显微镜下观测；
如表面涂片能清晰观察到：上表皮不见气孔，下表皮见不定式气孔；上表皮细胞和下表皮细胞形状相似，均呈不规则状；同时，横切面涂片能够清晰观察到：下表皮着生有鳞片、单细胞非腺毛和腺毛；叶脉处表皮内方且具厚角组织；栅栏组织与海绵组织分化明显；叶脉中的维管束为外韧型；可初步判断为青钱柳药材；
（2）采用薄层色谱法鉴别活性成分金丝桃苷和异槲皮苷，包括如下步骤：
（a）取青钱柳待检药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
（b）取青钱柳对照药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
（c）取金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
（d）照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各2μl，然后分别点于同一硅胶G薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯365nm下检视；
如供试品色谱在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，可确认判断为青钱柳药材；
（3）将待检青钱柳药材生片切制均匀，然后将切片的青钱柳生片进行碳化热解处理，依次采用110~120℃油浴焖制1~2小时，转入炒锅100~110℃翻炒1~2小时，降温至90~100℃翻炒1~2小时，转入瓷瓶密闭冷却；
取冷却后的青钱柳生片1g，加入8~10ml硝酸冷消化20~30分钟，再加入0.1ml 500μg/L的金标准溶液，然后进行微波消解处理；
微波消解程序如下：15min将温度平稳升到180℃，然后在该温度维持20min进行消化，消化完全后冷却到50℃左右，再置于赶酸炉中赶酸到剩余1ml左右，把消解样品转移到25或50ml容量瓶中，用超纯水定容，进行ICP-MS检测；
如ICP-MS检测到硒含量为0.187~0.189μg/g，可验证判断为青钱柳药材。
优选地，所述的展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水＝30:3:2。
优选地，所述FAA标准液由38%甲醛5ml、冰醋酸5ml、60%乙醇90ml和甘油5ml组成。
进一步，所述的青钱柳药材5~6月采集于江西省修水县。
进一步，用所述横切面涂片观察到的栅栏组织位于上表皮下方，由一层细胞构成，细胞排列紧密整齐。
进一步，用所述横切面涂片观察到的海绵组织细胞大小不等，细胞间隙大，排列疏松。
进一步，用所述横切面涂片观察到的下表皮着生的鳞片呈荷叶状。
与现有技术相比，本发明的优点在于能够实现高效、准确地鉴别青钱柳药材，弥补了青钱柳药材显微鉴别的空白，结合薄层色谱法再鉴定，创新的采用先碳化热解，再用ICP-MS验证的方法对青钱柳的鉴定结果验证，对提高青钱柳药材的质量控制、保证产品质量具有重大意义；同时对临床用药的有效性与安全性具有重要指导意义。
本发明方法选用金丝桃苷和异槲皮苷作为双对照鉴别成分，并对供试品溶液的制备方法进行了优化，展开剂的组分与比例进行了探讨研究，获得展开剂最佳组合，得到三种检视条件下多信息图谱，并且每一种信息斑点的分离效果均比较理想，方法准确、可靠，重现性好；能够有效提高展开速度，加快了青钱柳药材的鉴别速度，缩短了质量控制的时间，提高了质量控制的效率。
以金丝桃苷和异槲皮苷作为对照品，以乙酸乙酯-甲酸-水＝30:3:2为展开剂，对青钱柳进行鉴别的薄层色谱法特征明显，专属性强。
本发明将切片的青钱柳生片进行碳化热解处理，依次采用110~120℃油浴焖制1~2小时，转入炒锅100~110℃翻炒1~2小时，降温至90~100℃翻炒1~2小时，转入瓷瓶密闭冷却；上述ICP-MS检测前的预处理方法，有利于微量元素硒的含量成倍提高（参见说明书实施例该方面的对比试验），进而有利于对青钱柳药材鉴定结果准确验证，同时结果确实表明方法的验证效果显著。
附图说明
图1 青钱柳药材上表皮显微照片；
图2 青钱柳药材下表皮显微照片；
图3 青钱柳药材横切面显微照片；
图4 青钱柳药材在紫外光灯365nm下的薄层TLC图；
图5 青钱柳药材在紫外光灯254nm下的薄层TLC图；
图6 青钱柳药材显色后，日光下的薄层TLC图；
图4-6同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，a-供试品溶液；b-对照药材溶液，c-对照品溶液。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例做详细说明。
一种青钱柳药材的鉴别方法，包括如下步骤：
（1）将未粉碎的待检青钱柳药材1g用二甲基亚砜浸泡2小时，再取出用FAA标准液固定，-5~0℃冷冻干燥以后，分别制成表面涂片和横切面涂片以后，依次置于电子显微镜下观测；所述FAA标准液由38%甲醛5ml、冰醋酸5ml、60%乙醇90ml和甘油5ml组成；所述青钱柳药材5月采集于江西省修水县；
如表面涂片能清晰观察到：上表皮不见气孔，下表皮见不定式气孔；上表皮细胞和下表皮细胞形状相似，均呈不规则状；同时，横切面涂片能够清晰观察到：下表皮着生有鳞片、单细胞非腺毛和腺毛；叶脉处表皮内方且具厚角组织；栅栏组织与海绵组织分化明显；叶脉中的维管束为外韧型；可初步判断为青钱柳药材；所述栅栏组织位于上表皮下方，由一层细胞构成，细胞排列紧密整齐；所述海绵组织细胞大小不等，细胞间隙大，排列疏松；所述鳞片呈荷叶状；
（2）采用薄层色谱法鉴别活性成分金丝桃苷和异槲皮苷，包括如下步骤：
（a）取青钱柳待检药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
（b）取青钱柳对照药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
（c）取金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
（d）照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各2μl，然后分别点于同一硅胶G薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯365nm下检视；所述的展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水＝30:3:2；
如供试品色谱在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，可确认判断为青钱柳药材；
（3）将待检青钱柳药材生片切制均匀，然后将切片的青钱柳生片进行碳化热解处理，依次采用110~120℃油浴焖制1~2小时，转入炒锅100~110℃翻炒1~2小时，降温至90~100℃翻炒1~2小时，转入瓷瓶密闭冷却；
取冷却后的青钱柳生片1g，加入8~10ml硝酸冷消化20~30分钟，再加入0.1ml 500μg/L的金标准溶液，然后进行微波消解处理；
微波消解程序如下：15min将温度平稳升到180℃，然后在该温度维持20min进行消化，消化完全后冷却到50℃左右，再置于赶酸炉中赶酸到剩余1ml左右，把消解样品转移到25或50ml容量瓶中，用超纯水定容，同时，制备不加样品的消解空白，每种样品做3份平行，进行ICP-MS检测；
如ICP-MS检测到硒含量为0.187~0.189μg/g，可验证判断为青钱柳药材。
ICP-MS测试条件：
以硒单元素标准物质（浓度1μg/ml）作为在线内标，Ked模式下进行检测，ICP-MS仪器条件如表1所示；
表1 ICP-MS仪器条件
| 操作参数 | 数值 | 操作参数 | 数值 |
| Nebulizer gas flow | 0.95 | Detector | Dual |
| Auxiliary gas flow | 1.1 | Sweeps/reading | 5 |
| Plasma gas flow | 18 | Reading/replicate | 1 |
| ICP RF power | 1600 | Replicates | 4 |
| Analog stage voltage | -1742 | Dwell time | 60ms |
| Pulse stage voltage | 800 | Integration time | 500ms |
| Cell gas | 4 |
ICP-MS检测结果如表2所示；
表2 ICP-MS检测结果
| 标号组 | 样品1 | 样品2 | 样品3 | 空白1 | 空白2 | 空白3 |
| 结果（μg/g） | 0.189 | 0.187 | 0.188 | 0.047 | 0.046 | 0.047 |
另外对本方法进行了耐用性试验，包括不同薄层板，低温及高湿环境对分离情况的影响，结果表明不同厂家薄层板和温度、湿度条件对上述均没有影响。
上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将未粉碎的待检青钱柳药材1g用二甲基亚砜浸泡1~3小时，再取出用FAA标准液固定，-5~0℃冷冻干燥以后，分别制成表面涂片和横切面涂片以后，依次置于电子显微镜下观测；
如表面涂片能清晰观察到：上表皮不见气孔，下表皮见不定式气孔；上表皮细胞和下表皮细胞形状相似，均呈不规则状；同时，横切面涂片能够清晰观察到：下表皮着生有鳞片、单细胞非腺毛和腺毛；叶脉处表皮内方且具厚角组织；栅栏组织与海绵组织分化明显；叶脉中的维管束为外韧型；可初步判断为青钱柳药材；
（2）采用薄层色谱法鉴别活性成分金丝桃苷和异槲皮苷，包括如下步骤：
（a）取青钱柳待检药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
（b）取青钱柳对照药材1g，研细，添加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
（c）取金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
（d）照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各2μl，然后分别点于同一硅胶G薄层板上，加入展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯365nm下检视；
如供试品色谱在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，可确认判断为青钱柳药材；
（3）将待检青钱柳药材生片切制均匀，然后将切片的青钱柳生片进行碳化热解处理，依次采用110~120℃油浴焖制1~2小时，转入炒锅100~110℃翻炒1~2小时，降温至90~100℃翻炒1~2小时，转入瓷瓶密闭冷却；
取冷却后的青钱柳生片1g，加入8~10ml硝酸冷消化20~30分钟，再加入0.1ml 500μg/L的金标准溶液，然后进行微波消解处理；
微波消解程序如下：15min将温度平稳升到180℃，然后在该温度维持20min进行消化，消化完全后冷却到50℃左右，再置于赶酸炉中赶酸到剩余1ml左右，把消解样品转移到25或50ml容量瓶中，用超纯水定容，进行ICP-MS检测；
如ICP-MS检测到硒含量为0.187~0.189μg/g，可验证判断为青钱柳药材。
2.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，所述的展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水＝30:3:2。
3.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，所述FAA标准液由38%甲醛5ml、冰醋酸5ml、60%乙醇90ml和甘油5ml组成。
4.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，所述的青钱柳药材5~6月采集于江西省修水县。
5.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，用所述横切面涂片观察到的栅栏组织位于上表皮下方，由一层细胞构成，细胞排列紧密整齐。
6.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，用所述横切面涂片观察到的海绵组织细胞大小不等，细胞间隙大，排列疏松。
7.根据权利要求1所述的一种青钱柳药材的鉴别方法，其特征在于，用所述横切面涂片观察到的下表皮着生的鳞片呈荷叶状。
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