CN116338073A - 一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，属于中药检测技术领域。以体积比13:7:2的三氯甲烷‑甲醇‑水的下层溶液为展开剂，展开后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，与匙羹藤叶和大黄对照药材相应位置上检出对应斑点，105℃加热至斑点显色清晰，与黄芪、女贞子对照药材相应位置上检出对应斑点；以体积比为19：2：1的三氯甲烷‑甲醇‑浓氨试液的下层溶液为展开剂，展开后晾干，在与地黄、青风藤和大黄对照药材相应位置上检出相应斑点。本发明只需要一种供试品溶液，两种展开剂，同时鉴别地黄、黄芪、大黄、女贞子、匙羹藤叶、青风藤六种药材，无需价格昂贵的对照品和繁琐的色谱柱分离操作，缩短了薄层鉴别时间，检测效率大大提高。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法。
背景技术
中医药是中华民族的瑰宝，其安全性、有效性和质量可控性是基本要求，质量标准作为话语权，是中医药发展的先锋主导因素。当前，中成药的传统质量控制模式有一定局限性：不同药味需对应不同的供试品处理方法和薄层色谱条件，同时为避免阴性样品的干扰，常常需采用多种分离、纯化手段排除杂质干扰，操作较为繁琐，检验检测工作量较重。
芪蛭益肾胶囊是1.1类中药创新药，处方来源于国医大师临床经验方，是以临床价值为导向，采用中医药理论、人用经验和临床经验相结合的证据体系证明安全有效的药品。具有益气养阴、化瘀通络之功效。用干早期糖尿病肾病气阴两虚证，症见倦怠乏力，口干咽燥、五心烦热、食少纳呆、面色无华、肢体麻木。舌质谈或舌质暗红或有瘀斑瘀点，或少苔，脉细或细涩。是治疗糖尿病肾病的国家一类新药，印证了中医药“治未病”的理论体系。
处方中有十味药材，七种植物药来源。方中黄芪具有补气升阳、益卫固表、利水消肿之功效，为君药；地黄养阴清热、生津止渴，女贞子补肾肝阴，配伍使用为臣药；熟大黄、匙羹藤叶、青风藤-祛风通络、活血泄浊、通利小便，与水蛭、炒僵蚕、土鳖虫三味动物药合用为佐药，车前子利湿、淡渗利水为方中使药。诸药合用共奏益气养阴活血通络之功效。
目前执行标准为国家药品监督管理局药品注册标准YBZ00452021，薄层色谱鉴别有五个项目，且需要对每一味药材都建立一种样品处理方法和展开系统，操作繁琐，检测成本较高，且效率低下。
因此急需开发一种能够对芪蛭益肾胶囊中多药味同时鉴别且操作简便、成本较低的方法具有迫切的现实意义。
发明内容
针对现有薄层色谱检测技术中每一味药材都建立一种样品处理方法和展开系统的问题，本发明提供了一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，只需要制备一种供试品溶液，两种展开剂，就可以同时鉴别地黄、黄芪、大黄、女贞子、匙羹藤叶、青风藤六种药材，操作简单，提高了检测效率，且降低了检测成本。
本发明通过以下技术方案实现：
一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：称取芪蛭益肾胶囊内容物4~6g，乙醇回流提取，离心，上清液蒸干，加水溶解过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取，提取的正丁醇液用浓氨试液洗涤，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，得供试品溶液；
（2）对照药材溶液的制备：分别取匙羹藤叶、黄芪、女贞子、地黄、大黄、青风藤对照药材，乙醇加热回流提取，离心，上清液蒸干，加水溶解过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取，提取的正丁醇液用浓氨试液洗涤，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，得对照药材溶液；
（3）薄层色谱检测：
匙羹藤叶、黄芪、女贞子、大黄共同检测：将匙羹藤叶对照药材溶液、黄芪对照药材溶液、女贞子对照药材溶液、大黄对照药材溶液和供试品溶液分别点于薄层板上，以体积比为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂展开，展开后取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与匙羹藤叶对照药材、大黄对照药材相应位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点；在105℃加热2~3min至斑点显色清晰后，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与黄芪、女贞子对照药材相应的位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点；
地黄、青风藤、大黄共同检测：将地黄对照药材溶液、青风藤对照药材溶液、大黄对照药材溶液和供试品溶液分别点于薄层板上，以体积比为19：2：1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的下层溶液为展开剂展开，展开后取出，晾干，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与地黄对照药材、青风藤对照药材和大黄对照药材相应的位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点。
进一步地，步骤（3）中匙羹藤叶、黄芪、女贞子、大黄共同检测时，展开剂的温度低于10℃，并置于氨蒸汽饱和的展开缸内展开。
进一步地，步骤（1）中每毫升供试品溶液对应2.5g芪蛭益肾胶囊内容物；步骤（2）中每毫升对照药材溶液对应1g对照药材。
进一步地，步骤（1）和步骤（2）中乙醇加热回流提取中乙醇的体积浓度为70%。
进一步地，步骤（1）和步骤（2）中所述的浓氨试液为体积浓度25~28%氨水。
进一步地，所述的薄层板为高效硅胶G薄层板。
进一步地，所述的饱和的正丁醇萃取的次数为2~3次。
进一步地，步骤（3）中点样量为5~10μL。
有益效果
本发明提供的薄层色谱鉴别方法只需要制备一种供试品溶液，两种展开剂，就可以同时鉴别地黄、黄芪、大黄、女贞子、匙羹藤叶、青风藤六种药材，且无需价格昂贵的对照品和繁琐的色谱柱分离操作，实现“一板多鉴”的目的；该方法大大缩短了薄层鉴别时间，检测效率大大提高，减少价格昂贵的对照品和有机试剂的消耗，极大地降低了检测成本；操作相对简便，专属性强，且重现性好，为芪蛭益肾胶囊的薄层色谱鉴别提供新思路，可对现有标准内容进行替代或补充，有利于芪蛭益肾胶囊的质量控制和检验检测，增强了合理性和可靠性。
附图说明
图1为匙羹藤叶与大黄在日光下的薄层色谱鉴别图谱，1~3.供试品溶液、4.黄芪对照药材溶液、5.黄芪甲苷溶液、6.黄芪阴性对照溶液、7.女贞子对照药材溶液、8.女贞子阴性对照溶液、9.匙羹藤叶对照药材溶液、10.匙羹藤叶阴性对照溶液、11.大黄对照药材溶液、12. 大黄阴性对照溶液；
图2为匙羹藤叶与大黄在紫外光灯365nm下的薄层色谱鉴别图谱，1~3.供试品溶液、4.黄芪对照药材溶液、5.黄芪甲苷溶液、6.黄芪阴性对照溶液、7.女贞子对照药材溶液、8.女贞子阴性对照溶液、9.匙羹藤叶对照药材溶液、10.匙羹藤叶阴性对照溶液、11.大黄对照药材溶液、12. 大黄阴性对照溶液；
图3为黄芪和女贞子在日光下的薄层色谱鉴别图谱，1~3.供试品溶液、4.黄芪对照药材溶液、5.黄芪甲苷溶液、6.黄芪阴性溶液、7.女贞子对照药材溶液、8.女贞子阴性对照溶液、9.匙羹藤叶对照药材溶液、10.匙羹藤叶阴性对照溶液、11.大黄对照药材溶液、12.大黄阴性对照溶液；
图4为黄芪和女贞子在紫外光灯365nm下的薄层色谱鉴别图谱，1~3.供试品溶液、4.黄芪对照药材溶液、5.黄芪甲苷溶液、6.黄芪阴性溶液、7.女贞子对照药材溶液、8.女贞子阴性对照溶液、9.匙羹藤叶对照药材溶液、10.匙羹藤叶阴性对照溶液、11.大黄对照药材溶液、12. 大黄阴性对照溶液；
图5为青风藤、地黄和大黄在日光下的薄层色谱鉴别图谱，1~3. 供试品溶液、4.青风藤对照药材溶液、5.青风藤阴性对照溶液、6.地黄对照药材溶液、7.地黄阴性对照溶液、8.大黄对照药材溶液、9.大黄阴性对照溶液；
图6为青风藤、地黄和大黄在紫外光灯365nm下的薄层色谱鉴别图谱，1~3.供试品溶液、4.青风藤对照药材溶液、5.青风藤阴性对照溶液、6.地黄对照药材溶液、7.地黄阴性对照溶液、8.大黄对照药材溶液、9.大黄阴性对照溶液；
图7为不同提取方法的供试品溶液的薄层色谱鉴别图谱，1~5分别为供试品溶液Ⅰ~V；A为在日光下的薄层色谱鉴别图谱，B为在365nm紫外灯下的薄层色谱鉴别图谱；
图8为不同提取方法的供试品溶液加热显色后的薄层色谱鉴别图谱，1~5分别为供试品溶液Ⅰ~V；A为在日光下的薄层色谱鉴别图谱，B为在365nm紫外灯下的薄层色谱鉴别图谱。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
硅胶高效G板（Merck，批号：HX69819242），烟台市化学工业研究所，批号：2021-11-22）；芪蛭益肾胶囊3批次（批号3021077、3021078、3022043），由山东凤凰制药股份有限公司提供。对照药材来源：地黄（批号：121180-202107）、大黄（批号：120984-202203）、匙羹藤叶（批号：121465-200501）、黄芪（批号：120974-201813）、女贞子（批号：121041-202106）、青风藤（批号：121251-201503）均购自中检院。
实施例1
（1）供试品溶液的制备：分别称取芪蛭益肾胶囊内容物（3批次）5g，加70%（体积浓度）乙醇100ml加热回流提取1小时，离心，上清液蒸干，残渣加水50mL加热使其溶解、过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用浓氨试液（体积浓度25%）25ml洗涤一次，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，得供试品溶液；
（2）对照药材溶液的制备：分别取匙羹藤叶、黄芪、女贞子、地黄、大黄、青风藤对照药材各2g，加70%乙醇100ml加热回流提取1小时，离心，上清液蒸干，残渣加水50mL加热使其溶解、过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用浓氨试液（体积浓度25%）25ml洗涤一次，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，得对照药材溶液；
（3）阴性对照溶液的制备：取芪蛭益肾胶囊处方中分别除去地黄、大黄、匙羹藤叶、黄芪、女贞子、青风藤的其他药味，按处方比例制成缺地黄、大黄、匙羹藤叶、黄芪、女贞子、青风藤的阴性对照样品，取阴性对照样品按步骤（1）供试品溶液的制备方法分别制得地黄阴性对照溶液、大黄阴性对照溶液、匙羹藤叶阴性对照溶液、黄芪阴性对照溶液、女贞子阴性对照溶液、青风藤阴性对照溶液；
（4）薄层色谱检测：
匙羹藤叶、黄芪、女贞子、大黄共同检测：将供试品溶液（3批次）、黄芪对照药材溶液、黄芪甲苷溶液、黄芪阴性对照溶液、女贞子对照药材溶液、女贞子阴性对照溶液、匙羹藤叶对照药材溶液、匙羹藤叶阴性对照溶液、大黄对照药材溶液和大黄阴性对照溶液分别点于薄层板（高效硅胶G薄层板）上，点样量：5μl，以体积比为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂（展开剂的温度为4℃），置氨蒸汽饱和的展开缸内展开，上行展开8cm，展开后取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，其薄层色谱鉴别图谱分别如图1和图2所示；在日光下，供试品溶液色谱1~3中检出与匙羹藤叶对照药材相对应的绿色斑点，检出与大黄对照药材相对应的黄色斑点，紫外光灯365nm下检测出与大黄对照药材相对应的蓝色荧光斑点；在105℃加热至斑点显色清晰后，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，其薄层色谱鉴别图谱分别如图3和图4所示，日光下供试品溶液色谱1~3中检出与黄芪对照药材相对应的斑点，在紫外光灯365nm下检测和黄芪对照药材、女贞子对照药材相对应的荧光斑点；
地黄、青风藤和大黄共同检测：将供试品溶液（3批次）、青风藤对照品溶液、青风藤阴性对照溶液、地黄对照品溶液、地黄阴性对照溶液、大黄对照品溶液和大黄阴性对照溶液分别点于薄层板（高效硅胶G薄层板）上，点样量：5μl，以体积比为19：2：1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（体积浓度25%）的下层溶液为展开剂展开，上行展开8cm，展开后取出，晾干，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，其薄层色谱鉴别图谱分别如图5和图6所示；日光下检测出与地黄对照药材相对应的斑点，在紫外光等365nm下检测出与青风藤对照药材、地黄对照药材相对应的荧光主斑点。
实施例2
供试品溶液的制备方法考察：
（1）称取芪蛭益肾胶囊内容物5g，加70%乙醇100ml加热回流提取1小时，离心，上清液蒸干，残渣加水50ml加热使溶解，过滤，滤液用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，用浓氨试液25ml洗涤一次，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液Ⅰ；
（2）称取芪蛭益肾胶囊内容物5g，加70%乙醇100ml加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml使均匀分散，用三氯甲烷提取3次，每次30ml，弃去三氯甲烷液，水液蒸干，残渣加温水40ml使均匀分散，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，分取正丁醇层，蒸干，残渣加三氯甲烷10ml使均匀分散，加在中性氧化铝柱（100～120目，10g，内径为10～15mm）上，以三氯甲烷50ml洗脱，弃去三氯甲烷液，再用40%甲醇50ml洗脱，收集40%甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为供试品溶液Ⅱ；
（3）称取芪蛭益肾胶囊内容物5g，加70%乙醇100ml加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml加热使溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液Ⅲ；
（4）称取芪蛭益肾胶囊内容物5g，加70%乙醇100ml加热回流提取1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水50ml加热使溶解，过滤，滤液用稀盐酸调节pH值至2，再用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液Ⅳ，合并酸水层，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液V；
将步骤（1）~（4）中4种方法获得的供试品溶液Ⅰ~V点于薄层板（高效硅胶G薄层板）上，点样量：5μl，以13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水为展开剂（展开剂的温度4℃），置氨蒸汽饱和的展开缸内展开，上行展开8cm，展开后取出，晾干，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，其薄层色谱鉴别图谱如图7（A，日光下；B，365nm紫外灯下）所示；然后喷以10%硫酸乙醇溶液，显色，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，其薄层色谱鉴别图谱如图8（A，日光下；B，365nm紫外灯下）所示，由图7和图8可知，步骤（1）制备的供试品溶液斑点信息丰富，值得进一步考察，因此确认采用该方法制备的供试品溶液。
Claims (8)
1.一种芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：称取芪蛭益肾胶囊内容物4~6g，乙醇回流提取，离心，上清液蒸干，加水溶解过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取，提取的正丁醇液用浓氨试液洗涤，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，得供试品溶液；
（2）对照药材溶液的制备：分别取匙羹藤叶、黄芪、女贞子、地黄、大黄、青风藤对照药材，乙醇加热回流提取，离心，上清液蒸干，加水溶解过滤，滤液用水饱和的正丁醇萃取，提取的正丁醇液用浓氨试液洗涤，取正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，得对照药材溶液；
（3）薄层色谱检测：
匙羹藤叶、黄芪、女贞子、大黄共同检测：将匙羹藤叶对照药材溶液、黄芪对照药材溶液、女贞子对照药材溶液、大黄对照药材溶液和供试品溶液分别点于薄层板上，以体积比为13:7:2的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液为展开剂展开，展开后取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与匙羹藤叶对照药材、大黄对照药材相应位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点；在105℃加热2~3min至斑点显色清晰后，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与黄芪、女贞子对照药材相应的位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点；
地黄、青风藤、大黄共同检测：将地黄对照药材溶液、青风藤对照药材溶液、大黄对照药材溶液和供试品溶液分别点于薄层板上，以体积比为19：2：1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的下层溶液为展开剂展开，展开后取出，晾干，分别置于日光和365nm紫外灯下检视，在与地黄对照药材、青风藤对照药材和大黄对照药材相应的位置上，检出相对应的斑点和荧光斑点。
2.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（3）中匙羹藤叶、黄芪、女贞子、大黄共同检测时，展开剂的温度低于10℃，并置于氨蒸汽饱和的展开缸内展开。
3.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（1）中每毫升供试品溶液对应2.5g芪蛭益肾胶囊内容物；步骤（2）中每毫升对照药材溶液对应1g对照药材。
4.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中乙醇加热回流提取中乙醇的体积浓度为70%。
5.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中所述的浓氨试液为体积浓度25~28%氨水。
6.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述的薄层板为高效硅胶G薄层板。
7.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述的饱和的正丁醇萃取的次数为2~3次。
8.根据权利要求1所述的芪蛭益肾胶囊的薄层色谱检测方法，其特征在于，步骤（3）中点样量为5~10μL。
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