CN116773703A - 生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法以及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法以及鉴别方法。本申请针对生地黄和熟地黄的研究，综合调整超高效液相色谱条件，既能实现生地黄特征图谱的构建又能实现熟地黄特征图谱的构建，且构建所得特征图谱能有效将生地黄和熟地黄鉴别开来，并能有效缩短耗时。
Description
技术领域
本发明属于中药材检测技术领域，涉及一种生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法以及鉴别方法。
背景技术
地黄为玄参科地黄Rehmannia glutinosa Libosch的新鲜或干燥块根，秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，将地黄缓缓烘焙至八成干，即为“生地黄”。熟地黄为生地黄的炮制加工品。生地黄、熟地黄主要包括环烯醚萜苷类、苯乙醇类和紫罗兰酮类化合物，此外还含有三萜类、黄酮类、木脂素类、酚酸类等化合物。生地黄清热凉血，养阴生津，用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血，热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘，阴虚发热，骨蒸劳热，内热消渴；熟地黄性甘，微温，归肝、肾经，功在补血滋阴，益精填髓，用于血虚微黄，心悸怔忡，月经不调，崩漏下血，肝肾阴虚，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，内热消渴，眩晕，耳鸣，须发早白等症。中药材生品与炮制品的性味、功效不同，临床对应治疗的病症亦存在差异，建立生品与炮制品的鉴别方法和质量控制方法，对于临床用药的安全性和有效性具有重要的实际意义。
《中国药典》2015年版地黄含量测定项下指标成分为梓醇、毛蕊花糖苷，《中国药典》2020年版地黄含量测定项下指标成分为梓醇、地黄苷D，《中国药典》2015年版熟地黄含量测定项下指标成分为毛蕊花糖苷，《中国药典》2020年版熟地黄含量测定项下指标成分为地黄苷D，可见《中国药典》中地黄和熟地黄的主要指控指标包括环烯醚萜苷类(梓醇、地黄苷D)和苯乙醇苷类成分(毛蕊花糖苷)。地黄中含有的化学成分复杂，依据《中国药典》2020年版的质控指标，无法有效鉴别生地黄与熟地黄饮片。
中药所含有的化学成分众多，多种化学成分协同发挥药理作用，单一活性成分含量并不能反映其内在质量，也不能反映中医用药所体现的整体疗效。中药特征图谱是中药材中依赖于不同提取方法所得的各种不同化学成分浓度分布的一个整体表征，能反映中药的整体化学信息，可用于鉴别药材原料的真伪，鉴别药材生品与炮制品以及区分植物药材的不同部位，可判断商品药材的质量、监测原料与成品的批间质量稳定性等方面来评价中药质量。地黄相关的传统的中药特征图谱技术方案例如：CN113945674A记载了一种地黄炮制品的特征图谱及分析方法，其以升麻素苷为内标构建了一种地黄炮制品的特征图谱，指认的成分为梓醇、尿苷、腺苷、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、肉苁蓉苷A和毛蕊花糖苷等8个成分，多为核苷类和环烯醚萜苷类成分，地黄中主要的苯乙醇苷类成分除了毛蕊花糖苷外未能有效表征，且缺少生地黄与熟地黄专属性的鉴别成分。《基于标准汤剂的鲜地黄配方颗粒质量标准研究》构建了鲜地黄环烯醚萜苷类成分的UPLC特征图谱和苯乙醇苷类成分的UPLC特征图谱，其中环烯醚萜苷类成分特征图谱共标定了10个共有峰，指认峰3、4、6分别为梓醇、地黄苷D、益母草苷；苯乙醇苷类成分特征图谱共标定了8个共有峰，指认峰1、4、5、6分别为洋地黄叶苷C、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、异毛蕊花糖苷。《一种鲜地黄标准汤剂的特征图谱检测方法》分别构建了鲜地黄标准汤剂环烯醚萜苷类和苯乙醇苷类成分的特征图谱，该方法未能将环烯醚萜苷类成分和苯乙醇苷类成分呈现在同一张色谱图上，操作复杂，检测成本高；此外，鲜地黄未经干燥、发汗以及蒸制等工序，其与生地黄、熟地黄的化学成分存在差异，不能用于生地黄与熟地黄的区分鉴别。另外，还有CN108226313B、张智慧等(基于HPLC指纹图谱与多元统计分析的生地黄与熟地黄差异评价.时珍国医国药2021年第32卷第6期)也记载了地黄相关的检测。然而，传统技术方案整体上存在方法耗时长的问题。
发明内容
基于此，本申请实施例的主要目的在于提供生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，该构建方法耗时短，并且采用该构建方法构建的特征图谱进行生地黄和熟地黄鉴别的耗时也短。
在本申请的第一方面，提供一种生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
制备生地黄或者熟地黄的供试品溶液；
分别采用超高效液相色谱法检测所述的供试品溶液，并将所得供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成生地黄或者熟地黄的特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包含乙腈，所述流动相B包含磷酸浓度为0.08wt％～0.12wt％的磷酸溶液；
采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0min～5min，所述流动相A的体积占比保持0％；
5min～14min，所述流动相A的体积占比由0％上升至16％；
14min～21min，所述流动相A的体积占比由16％上升至22％；
21min～28min，所述流动相A的体积占比由22％上升至35％；
28min～34min，所述流动相A的体积占比由35％上升至100％；
34min～36min，所述流动相A的体积占比由100％下降至0％；以及，
36min～40min，所述流动相A的体积占比保持0％。
在本申请的一些实施方式中，所述超高效液相色谱法还包括如下条件中的一个或者多个：
(1)0min～7min，检测波长为200nm～220nm；7min～9.5min，检测波长为260nm～300nm；9.5min～40min，检测波长为200nm～220nm；
(2)柱温为33℃～37℃；以及，
(3)流速为0.25mL/min～0.4mL/min。
在本申请的一些实施方式中，所述供试品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂1对生地黄或者熟地黄进行提取，收集提取液1，制备供试品溶液。
在本申请的一些实施方式中，所述供试品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述提取溶剂1包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)的甲醇溶液；
2)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W，频率35kHz～45kHz，时间为25min～35min；
3)收集所述提取液1的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
4)每1g所述生地黄或者熟地黄对应的所述提取溶剂1的用量为30mL～50mL。
在本申请的一些实施方式中，所述构建方法还包括如下步骤：
提供对照品溶液，采用所述超高效液相色谱法检测所述对照品溶液，并根据所得对照数据对所述特征图谱的色谱峰进行标定；
所述对照品溶液中的对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中，所述对照品溶液包括对照品溶液1和对照品溶液2；
所述对照品溶液1中，溶剂为甲醇浓度为8％～12％(v/v)的甲醇溶液，对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A和益母草苷；
所述对照品溶液2中，溶剂为甲醇，对照品包含5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷；
可选地，每1mL所述对照品溶液1包含腺苷9μg～12μg、梓醇90μg～95μg、地黄苷D60μg～65μg、地黄苷A 50μg～60μg和益母草苷75μg～85μg；
可选地，每1mL所述对照品溶液2包含5-羟甲基糠醛8μg～12μg、洋地黄叶苷C 20μg～25μg、焦地黄苯乙醇苷A1 20μg～25μg、焦地黄苯乙醇苷B1 8μg～10μg、毛蕊花糖苷10μg～15μg和异毛蕊花糖苷3μg～5μg。
在本申请的一些实施方式中，所述生地黄的特征图谱包括18个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷；
所述熟地黄的特征图谱包括20个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷，峰19为5-羟甲基糠醛。
在本申请的第二方面，提供一种生地黄或者熟地黄的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
制备待测地黄样品的待测品溶液；
采用第一方面中所述的超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将所得待测品图谱与第一方面中构建的特征图谱做比较，并根据比较结果鉴别所述待测地黄样品。
在本申请的一些实施方式中，所述待测品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂2对待测地黄样品进行提取，收集提取液2，制备待测品溶液。
在本申请的一些实施方式中，所述待测品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
(A)所述提取溶剂2包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)的甲醇溶液；
(B)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W，频率35kHz～45kHz，时间为25min～35min；
(C)收集所述提取液2的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
(D)每1g所述待测地黄样品对应的所述提取溶剂2的用量为30mL～50mL。
与传统技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请针对生地黄和熟地黄的研究，综合调整超高效液相色谱条件，既能实现生地黄特征图谱的构建又能实现熟地黄特征图谱的构建，且构建所得特征图谱能有效将生地黄和熟地黄鉴别开来，并能有效缩短耗时。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为14批生地黄药材UPLC叠加图谱及其对照特征图谱；
图2为14批熟地黄UPLC叠加图谱及其对照特征图谱；
图3为混合对照品色谱图；其中，3.腺苷；4.梓醇；7.地黄苷D；8.地黄苷A；9.益母草苷；11.洋地黄叶苷C；12.焦地黄苯乙醇苷A1；13.毛蕊花糖苷；14.焦地黄苯乙醇苷B1；15.异毛蕊花糖苷；19.5-羟甲基糠醛；
图4为OPLS-DA得分图；
图5为OPLS-DA的VIP值得分图；
图6为实施例2中生地黄、熟地黄、待测样品S1的UPLC叠加图谱；
图7为实施例2中生地黄、熟地黄、待测样品S2的UPLC叠加图谱。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
本申请中，熟地黄饮片的制备包括如下步骤：将地黄饮片，蒸至黑润，取出，晒至约八成干，切厚片，干燥。
本申请的第一方面
本申请提供一种生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
制备生地黄或者熟地黄的供试品溶液；
分别采用超高效液相色谱法检测所述的供试品溶液，并将所得供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成生地黄或者熟地黄的特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包含乙腈，所述流动相B包含磷酸浓度为0.08wt％～0.12wt％的磷酸溶液；
采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0min～5min，所述流动相A的体积占比保持0％；
5min～14min，所述流动相A的体积占比由0％上升至16％；
14min～21min，所述流动相A的体积占比由16％上升至22％；
21min～28min，所述流动相A的体积占比由22％上升至35％；
28min～34min，所述流动相A的体积占比由35％上升至100％；
34min～36min，所述流动相A的体积占比由100％下降至0％；以及，
36min～40min，所述流动相A的体积占比保持0％。
可选地，所述超高效液相色谱法还包括如下条件中的一个或者多个：
(1)0min～7min，检测波长为200nm～220nm(例如为200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220nm)；7min～9.5min，检测波长为260nm～300nm(例如为260、265、270、275、280、285、290、295、300nm)；9.5min～40min，检测波长为200nm～220nm(例如为200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220nm)；
(2)柱温为33℃～37℃(例如为33、34、35、36、37℃)；以及，
(3)流速为0.25mL/min～0.4mL/min(例如为0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4mL/min)。
可选地，所述供试品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂1对生地黄或者熟地黄进行提取，收集提取液1，制备供试品溶液。
可选地，所述供试品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述提取溶剂1包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)(例如为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35％)的甲醇溶液；
2)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W(例如为200、220、230、240、250、260、270、280、290、300W)，频率35kHz～45kHz(例如为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45kHz)，时间为25min～35min(例如为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35min)；
3)收集所述提取液1的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
4)每1g所述生地黄或者熟地黄对应的所述提取溶剂1的用量为30mL～50mL(例如为30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50mL)。
可选地，所述构建方法还包括如下步骤：
提供对照品溶液，采用所述超高效液相色谱法检测所述对照品溶液，并根据所得对照数据对所述特征图谱的色谱峰进行标定；
所述对照品溶液中的对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷中的一种或者多种。
可选地，所述对照品溶液包括对照品溶液1和对照品溶液2；
所述对照品溶液1中，溶剂为甲醇浓度为8％～12％(v/v)(例如为8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％)的甲醇溶液，对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A和益母草苷；
所述对照品溶液2中，溶剂为甲醇，对照品包含5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷；
可选地，每1mL所述对照品溶液1包含腺苷9μg～12μg(例如为9、9.5、10、10.5、11、11.5、12μg)、梓醇90μg～95μg(例如为90、91、92、93、94、95μg)、地黄苷D 60μg～65μg(例如为60、61、62、63、64、65μg)、地黄苷A 50μg～60μg(例如为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60μg)和益母草苷75μg～85μg(例如为75μg、76μg、77μg、78μg、79μg、80μg、81μg、82μg、83μg、84μg、85μg)；
可选地，每1mL所述对照品溶液2包含5-羟甲基糠醛8μg～12μg(例如为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12μg)、洋地黄叶苷C 20μg～25μg(例如为20、21、22、23、24、25μg)、焦地黄苯乙醇苷A1 20μg～25μg(例如为20、21、22、23、24、25μg)、焦地黄苯乙醇苷B1 8μg～10μg(例如为8、8.5、9、9.5、10μg)、毛蕊花糖苷10μg～15μg(例如为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15μg)和异毛蕊花糖苷3μg～5μg(例如为3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5μg)。
在本申请的一些实施方式中，所述生地黄的特征图谱包括18个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷；
所述熟地黄的特征图谱包括20个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷，峰19为5-羟甲基糠醛。
本申请的第二方面
本申请提供一种生地黄或者熟地黄的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
制备待测地黄样品的待测品溶液；
采用第一方面中所述的超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将所得待测品图谱与第一方面中构建的特征图谱做比较，并根据比较结果鉴别所述待测地黄样品。
可选地，所述待测品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂2对待测地黄样品进行提取，收集提取液2，制备待测品溶液。
可选地，所述待测品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
(A)所述提取溶剂2包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)(例如为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35％)的甲醇溶液；
(B)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W(例如为200、220、230、240、250、260、270、280、290、300W)，频率35kHz～45kHz(例如为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45kHz)，时间为25min～35min(例如为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35min)；
(C)收集所述提取液2的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
(D)每1g所述待测地黄样品对应的所述提取溶剂2的用量为30mL～50mL(例如为30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50mL)。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
1.仪器与试剂
H-class型超高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；TS7700型分光测色仪(深圳市三恩时科技有限公司)；ME204E型(1/1万)电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；XP26型(1/100万)电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q-Direc型超纯水系统(德国默克股份有限公司)。
2.熟地黄的制备
取生地黄药材，照《中国药典》2020年版蒸法(通则0213)蒸至黑润，取出，晒至约八成干时，切厚片，干燥，即得。
3.色谱条件
Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)；流动相乙腈(A)-0.1wt％磷酸(B)，梯度洗脱，0～5min，0％(A)；5～14min，0％～16％(A)；14～21min，16％～22％(A)；21～28min，22％～35％(A)；28～34min，35％～100％(A)；34～36min，100％～0％(A)；36～40min，0％(A)；检测波长：0～7min，203nm；7～9.5min，280nm；9.5～40min，203nm；柱温35℃；流速0.3mL/min。
3.1色谱条件的优化
3.1.1检测波长的确定
分别取生地黄药材、熟地黄饮片粉末约0.5g，精密称定，至具塞锥形瓶中；分别精密加入30％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，称定重量，用30％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液，即得生地黄供试品溶液与熟地黄供试品溶液。所述的甲醇百分含量均为体积百分含量，按上述色谱条件进样分析，记录190～400nm范围内的吸收光谱。
实验结果：在检测波长203nm左右，生地黄、熟地黄饮片样品溶液可以检测到的色谱峰最多，且主要色谱峰响应较高，5-羟甲基糠醛在检测波长280nm时响应较高，因此选择程序波长，其中0～7min时，203nm为检测波长，7～9.5min时，280nm为检测波长，9.5min～40min，203nm为检测波长。
3.2.2色谱柱的优化
取同一生地黄药材、熟地黄饮片供试品溶液，分别选择常用色谱柱WatersCORTECS UPLC T3(2.1×150mm，1.6μm)、Waters HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)和AgilentSB(100mm×2.1mm，1.8μm)，按上述色谱条件，进样测定，比较不同色谱柱的分离效果。
实验结果，Waters CORTECS UPLC T3柱和Waters HSS T3柱对样品分离效果较好，基线平稳，Waters HSS T3柱分离效果最佳，最终选择Waters HSS T3色谱柱为生地黄、熟地黄特征图谱使用柱。
3.2.3流动相的优化
取同一当生地黄药材、熟地黄饮片供试品溶液，分别考察流动相乙腈-0.1wt％冰醋酸、乙腈-0.1wt％磷酸、乙腈-0.1wt％甲酸为洗脱系统，按上述色谱条件进样分析。
实验结果，0.1wt％磷酸溶液作为流动相时，特征图谱峰信息较丰富，分离效果和响应值优于其他流动相，最终选择0.1wt％磷酸溶液为流动相。
3.2.4不同柱温考察
取同一生地黄药材、熟地黄饮片供试品溶液，采用同一色谱柱和液相色谱仪，按照上述色谱条件，分别在不同柱温(33℃、34℃、35℃、36℃、37℃)下进样，记录色谱图。
结果表明，35℃柱温时样品分离度较高、峰形对称，能够满足分析要求，因此选择35℃柱温进行分析。
3.2.5不同流速考察
取生地黄药材、熟地黄饮片供试品溶液，按照上述色谱条件，分别用不同流速(0.25mL/min、0.30mL/min、0.40mL/min)，进样测定，记录色谱图。
结果表明，用上述3种流速对样品进行检测时，不同流速对各色谱峰的分离情况和相对峰面积有一定的影响，但对特征图谱各特征峰的相对保留无显著影响，因此固定流速为0.3mL/min。
4.溶液的制备
4.1对照品溶液的制备
取腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷对照品适量，精密称定，加10％(v/v)甲醇制成每1mL含腺苷10.50129μg、梓醇93.807μg、地黄苷D 63.8499μg、地黄苷A 54.3900μg、益母草苷80.81565μg的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
取5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛10.4986μg、洋地黄叶苷C23.7367μg、焦地黄苯乙醇苷A1 23.5984μg、焦地黄苯乙醇苷B1 8.3895μg、毛蕊花糖苷13.78323μg、异毛蕊花糖苷3.82010μg的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
4.2供试品溶液的制备
取生地黄药材(或熟地黄)粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加30％(v/v)甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，放冷，用30(v/v)％甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
5.生地黄、熟地黄UPLC特征图谱的建立
5.1精密度试验
取生地黄供试品(D1)，按“4.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件连续进样6次，以峰7(地黄苷D)作为参照峰(S)，计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.01％～0.17％，相对峰面积的RSD为0.45％～3.92％，表明仪器精密度良好。
5.2稳定性试验
取生地黄供试品溶液，按“3”项下色谱条件分别在0、2、4、8、16、24h依次进样测定，以峰7(地黄苷D)作为参照峰(S)，计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.02％～1.08％，相对峰面积的RSD为0.11％～4.71％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
5.3重复性试验
取同一批生地黄供试品(D1)6份，按“4.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件进样测定，以峰7(地黄苷D)作为参照峰(S)，计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.01％～0.69％，相对峰面积RSD为0.75％～4.52％，表明该方法重复性较好。
5.4生地黄、熟地黄UPLC特征图谱的建立
按“4.2”项下方法制备14批生地黄药材供试品溶液和熟地黄供试品溶液，进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，建立14批生地黄、熟地黄的特征图谱，经系统自动匹配，生成对照特征图谱(R)。
14批生地黄特征图谱共标定18个共有峰，熟地黄特征图谱共标定20个共有峰，通过对照品比对，确定峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷，峰19为5-羟甲基糠醛(5-HMF)。由结果可知，熟地黄特征图谱的峰19(5-HMF)、峰20由生地黄药材炮制后产生。
14批生地黄药材特征图谱共有峰的相对保留时间、相对峰面积分别见表1、表2。14批熟地黄饮片特征图谱共有峰的相对保留时间、相对峰面积分别见表3、表4。
14批生地黄、熟地黄的UPLC叠加图谱及对照图谱R分别见图1、图2，混合对照品图谱见图3。
表1、14批生地黄药材特征图谱相对保留时间
表2、14批生地黄药材特征图谱相对峰面积
表3、14批熟地黄特征图谱相对保留时间
表4、14批熟地黄特征图谱相对峰面积
5.5相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件，以对照特征图谱R为参照，14批生地黄药材样品相似度为0.949～0.996，14批熟地黄样品相似度为0.827～0.990，表明14批生地黄药材、熟地黄特征图谱相似度较高，熟地黄炮制过程稳定可行。
5.6生地黄、熟地黄特征图谱共有峰峰面积的差异性分析
14批生地黄、熟地黄特征图谱各共有峰的峰面积经标准化处理后，采用SPSS 20.0软件进行配对样本t检验，结果见表5。其中，
峰19(5-HMF)在生地黄药材中未检出，为炮制后产生，峰20存在于部分生地黄中，但非生地黄特征图谱的共有峰。峰2、峰3、峰6、峰10～峰14、峰16～峰18峰面积不符合正态分布规律，故以上色谱峰采取两配对样本的Wilcoxon符号平均秩检验。
配对样本t检验结果表明，生地黄与熟地黄特征图谱共有峰中峰4、峰5、峰7～峰9、峰15的峰面积差异具有统计学意义。
两配对样本的Wilcoxon符号平均秩检验结果表明，峰3、峰6、峰11～峰14、峰16～峰18在生地黄与熟地黄组别间的差异有统计学意义。
炮制后，熟地黄特征图谱峰3～峰9、峰11～峰14、峰17～峰18的峰面积降低，峰15、峰16的峰面积增加，峰1、峰2、峰10峰面积无明显规律，峰19、峰20为炮制后产生。
因此，除峰1、峰2、峰10以外，其他共有峰(峰3～峰9、峰11～峰20)均可作为生地黄与炮制品熟地黄鉴别的特征性指标。
表5、生地黄与熟地黄特征图谱共有峰配对样本t检验结果(x±s)
| 峰号 | 生地黄 | 熟地黄 |
| 峰1 | 839703±315959 | 911110±211257 |
| 峰4 | 2147141±895120 | 877838±444347** |
| 峰5 | 26514±5920 | 17073±3737** |
| 峰7 | 241490±31203 | 196334±21167** |
| 峰8 | 68273±16136 | 56213±12339** |
| 峰9 | 180772±65134 | 103259±38492** |
| 峰15 | 22381±9786 | 39490±14735** |
表6、生地黄与熟地黄特征图谱共有峰两配对样本的Wilcoxon符号平均秩检验结果(x±s)
注：与生地黄药材比较，＊＊表示P＜0.01，＊表示P＜0.05。
5.7正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)
将14批生地黄药材、熟地黄样品各共有峰的峰面积经标准化处理后导入Simca14.0软件，采用OPLS-DA，在OPLS-DA得分图中每个点分别代表一个样品，点与点之间的距离代表各个样品之间存在的差异程度。OPLS-DA得分图见图4，OPLS-DA的VIP值得分图见图5。由图4可见，14批生地黄、熟地黄在OPLS-DA模型中分类聚集明显，14批生地黄(D1～D14)聚为一类，14批熟地黄(SD1～SD14)聚为一类。结果表明。其中R2Y为0.946，Q2是0.896，表示该模型拟合程度和预测能力良好。对OPLS-DA模型中变量的重要度(VIP)进行分析，选择VIP值大于1的化学成分作为区分生地黄生品及炮制品熟地黄的重要特征峰，依次为峰4(梓醇)、峰19(5-羟甲基糠醛)、峰1、峰2，提示这些色谱峰峰面积是影响生地黄药材和熟地黄差异的主要因素。
综合配对样本t检验、两配对样本的Wilcoxon符号平均秩检验、正交偏最小二乘判别分析结果，峰4(梓醇)、峰19(5-羟甲基糠醛)是影响生地黄药材和熟地黄差异的主要因素。
实施例2
本实施例提供一种生地黄或熟地黄的鉴别方法，具体如下：
取生地黄供试品(D1)，参照实施例1中项4下方法制备生地黄供试品溶液，参照实施例中项3下的色谱条件进样测定，得生地黄特征图谱D1。
取熟地黄供试品(SD1)，参照实施例1中项4下方法制备熟地黄供试品溶液，参照实施例中项3下的色谱条件进样测定，得熟地黄特征图谱SD1。
取待测样品2批，参照实施例1中项4下方法制备待测样品供试品溶液，参照实施例中项3下的色谱条件进样测定，得待测品图谱S1、S2。
将2批待测品图谱与生地黄特征图谱D1、熟地黄特征图谱SD1做比较，根据比较结果鉴别得S1为生地黄样品，S2为熟地黄样品。见图6和图7。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
制备生地黄或者熟地黄的供试品溶液；
分别采用超高效液相色谱法检测所述的供试品溶液，并将所得供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，生成生地黄或者熟地黄的特征图谱；
所述超高效液相色谱法的条件包括：
固定相为T3色谱柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包含乙腈，所述流动相B包含磷酸浓度为0.08wt％～0.12wt％的磷酸溶液；
采用梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：
0min～5min，所述流动相A的体积占比保持0％；
5min～14min，所述流动相A的体积占比由0％上升至16％；
14min～21min，所述流动相A的体积占比由16％上升至22％；
21min～28min，所述流动相A的体积占比由22％上升至35％；
28min～34min，所述流动相A的体积占比由35％上升至100％；
34min～36min，所述流动相A的体积占比由100％下降至0％；以及，
36min～40min，所述流动相A的体积占比保持0％。
2.根据权利要求1所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法还包括如下条件中的一个或者多个：
(1)0min～7min，检测波长为200nm～220nm；7min～9.5min，检测波长为260nm～300nm；9.5min～40min，检测波长为200nm～220nm；
(2)柱温为33℃～37℃；以及，
(3)流速为0.25mL/min～0.4mL/min。
3.根据权利要求1或者2所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂1对生地黄或者熟地黄进行提取，收集提取液1，制备供试品溶液。
4.根据权利要求3所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述提取溶剂1包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)的甲醇溶液；
2)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W，频率35kHz～45kHz，时间为25min～35min；
3)收集所述提取液1的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
4)每1g所述生地黄或者熟地黄对应的所述提取溶剂1的用量为30mL～50mL。
5.根据权利要求1、2或者4所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括如下步骤：
提供对照品溶液，采用所述超高效液相色谱法检测所述对照品溶液，并根据所得对照数据对所述特征图谱的色谱峰进行标定；
所述对照品溶液中的对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷中的一种或者多种。
6.根据权利要求5所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述对照品溶液包括对照品溶液1和对照品溶液2；
所述对照品溶液1中，溶剂为甲醇浓度为8％～12％(v/v)的甲醇溶液，对照品包含腺苷、梓醇、地黄苷D、地黄苷A和益母草苷；
所述对照品溶液2中，溶剂为甲醇，对照品包含5-羟甲基糠醛、洋地黄叶苷C、焦地黄苯乙醇苷A1、焦地黄苯乙醇苷B1、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷；
可选地，每1mL所述对照品溶液1包含腺苷9μg～12μg、梓醇90μg～95μg、地黄苷D60μg～65μg、地黄苷A50μg～60μg和益母草苷75μg～85μg；
可选地，每1mL所述对照品溶液2包含5-羟甲基糠醛8μg～12μg、洋地黄叶苷C 20μg～25μg、焦地黄苯乙醇苷A1 20μg～25μg、焦地黄苯乙醇苷B1 8μg～10μg、毛蕊花糖苷10μg～15μg和异毛蕊花糖苷3μg～5μg。
7.根据权利要求5所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，
所述生地黄的特征图谱包括18个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷；
所述熟地黄的特征图谱包括20个特征峰，其中，峰3为腺苷，峰4为梓醇，峰7为地黄苷D，峰8为地黄苷A，峰9为益母草苷，峰11为洋地黄叶苷C，峰12为焦地黄苯乙醇苷A1，峰13为毛蕊花糖苷，峰14为焦地黄苯乙醇苷B1，峰15为异毛蕊花糖苷，峰19为5-羟甲基糠醛。
8.一种生地黄或者熟地黄的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括如下步骤：
制备待测地黄样品的待测品溶液；
采用权利要求1或者2所述的超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将所得待测品图谱与权利要求1至7中任一项构建的特征图谱做比较，并根据比较结果鉴别所述待测地黄样品。
9.根据权利要求8生地黄或者熟地黄的鉴别方法，其特征在于，所述待测品溶液的制备步骤包括：
采用提取溶剂2对待测地黄样品进行提取，收集提取液2，制备待测品溶液。
10.根据权利要求9所述的生地黄或者熟地黄的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述待测品溶液的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
(A)所述提取溶剂2包含甲醇浓度为25％～35％(v/v)的甲醇溶液；
(B)提取的方式包括：超声提取；可选地，超声提取的条件包括：功率为200W～300W，频率35kHz～45kHz，时间为25min～35min；
(C)收集所述提取液2的方式包括：膜过滤；可选地，膜过滤采用的过滤膜的孔径为0.2μm～0.3μm；以及，
(D)每1g所述待测地黄样品对应的所述提取溶剂2的用量为30mL～50mL。
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