CN111337586A - 一种基于代谢组筛选的标记类黄酮评价金银花特性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于代谢组筛选的标记类黄酮评价金银花特性的方法，该方法凭借LC‑MS/MS技术检测金银花不同发育时期花蕾/花朵的类黄酮成分及其含量，定量分析不同发育时期类黄酮差异并筛选药用花蕾期各个发育时期的标记类黄酮物质，从而判断金银花新鲜原材料的类黄酮类别及其含量高低。筛选到芒柄花素和7‑氧甲基槲皮素可作为最佳药用花蕾期(二白期)的特异标记类黄酮物质；6‑姜酚可作为三青期的特异标记类黄酮物质，桃苷元可作为大白期的特异标记类黄酮物质。本发明也为不同栽培地区、不同栽培品种金银花类黄酮的提取和定量检测提供了依据，为判断金银花新鲜样的类黄酮物质特性提供了评价方法。

Description

一种基于代谢组筛选的标记类黄酮评价金银花特性的方法
技术领域
本发明属于中药材植物检测技术领域，涉及植物花器官类黄酮提取技术、仪器分析技术和数据分析技术领域，尤其涉及基于 LC-MS/MS技术检测及筛选金银花药用花蕾期的类黄酮标记物，采用标记类黄酮评价金银花及其加工产品的方法。
背景技术
黄酮类化合物(flavonoids),也称类黄酮，是一组存在于自然界的化合物。类黄酮是苯丙氨酸代谢途径生成的次生代谢物质，绝大多数植物体内都含有类黄酮，它们在植物的生长、发育、抗逆等方面均起着重要的作用。类黄酮还通过抗氧化、自由基清除和对二价阴离子的螯合作用来实现抗细菌、抗病毒、消炎、抗过敏、对紫外线伤害的保护和抑制脂类过氧化、血小板凝聚、毛细血管透性增加等广泛的生物学功能。植物类黄酮代谢组学研究是从整体出发，系统地分析植物中所有类黄酮成分及其随发育阶段、生长环境的变化，有利于全面阐述植物类黄酮成分的物质基础及对植物加工产品、物种/品种的判断等。
金银花(Lonicera japonica)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属 (LoniceraLinn)植物，金银花的花蕾或初开的花是常用中药材，以花蕾为佳，花蕾又以青白色(二白期)、肥大者为佳，具有清热解毒之功效，有悠久的药用历史。其中，类黄酮是中药金银花的主要药用成分之一。研究发现，金银花中的黄酮类化合物具有较高的生物活性，如抗菌、抗病毒、增强机体免疫力、抗氧化及抗自由基、抗癌防癌和抑制脂肪酶等。金银花类黄酮的提取分离纯化已有一些报道，但已有的研究大多通量有限，主要针对少量类黄酮物质开展研究，无法高效、系统、全面地表征金银花的类黄酮物质基础。通过检测药用花蕾期及初开花朵的类黄酮代谢组，筛选出药用花蕾不同发育时期的类黄酮标记物。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于LC-MS/MS联用技术对金银花花蕾/花朵类黄酮代谢组进行测定，用来筛选金银花药用花蕾期标记类黄酮代谢物并以该标记类黄酮评价金银花及其加工产品的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的LC-MS/MS联用技术筛选金银花药用花蕾期标记类黄酮物质的方法，包括以下步骤：类黄酮物质提取液准备，质谱数据采集，质谱数据分析和标记类黄酮物质的筛选。
本发明中，金银花类黄酮物质提取方法为：分别收集三青期、二白期、大白期花蕾和银花期初开花朵，液氮速冻后于-80℃中保存备用。
进一步地，所述金银花类黄酮物质的提取方法为：真空冷冻干燥金银花样品；用研磨仪将冻干样品研磨至粉末状；准确称量冻干粉末，溶解于一定体积的提取液中；混匀后置于4℃下8-14h，期间涡旋三次；离心后取上清，过0.22μm滤膜后保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS 分析。
进一步地，所述金银花冻干粉末用量为100-300mg；所述提取液为60-80％的甲醇水溶液，用量为1-3mL；所述离心转速为 10,000-12,000g，离心时间为10-12min。
本发明中，LC-MS/MS检测的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱和串联质谱。
液相条件主要包括：①色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm；②流动相A：超纯水(0.03-0.05％体积的乙酸)；流动相 B：乙腈(0.03-0.05％体积的乙酸)；③洗脱梯度：0-11min，95-5％流动相A，5-95％流动相B；11-12min，5％流动相A，95％流动相B； 12-12.1min，5-95％流动相A，95-5％流动相B；12.1-15min，95％流动相A，5％流动相B；④流速0.3-0.4mL/min；柱温30-40℃；进样量 2-3μL。
质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度为500-600℃；质谱电压 5000-5500V；帘气20-25psi；碰撞诱导电离高；每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
本发明还提供了金银花类黄酮代谢组的质谱数据处理方法，具体如下：
(1)代谢物定性：主要基于代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。其中部分物质定性分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH+离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物结构解析参考MassBank、KNAPSAcK、HMDB、MoTo DB和METLIN等已有的质谱公共数据库。
(2)代谢物定量：利用三重四级杆质谱的多反应监测模式 (multiple reactionmonitoring，MRM)进行分析。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度 (CPS)，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。
进一步地，对预处理后的数据进行主成分分析(PCA)、相关性分析(Cor)正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)、差异倍数分析，并从复杂的数据中判断筛选差异积累的标记代谢物，差异判断标准为fold change≥2和fold change≤0.5，且VIP≥1。
通过对金银花4个发育阶段类黄酮代谢组的差异分析，筛选到芒柄花素和7-氧甲基槲皮素可作为最佳药用花蕾期(二白期)的特异标记类黄酮物质；6-姜酚可作为三青期的特异标记类黄酮物质，桃苷元可作为大白期的特异标记类黄酮物质。
本发明还提供一种药用金银花花蕾期检测方法，包括如下步骤：
1)利用所述的基于LC-MS/MS技术筛选金银花类黄酮物质的方法检测金银花花蕾中的类黄酮物质特性；
2)根据提取的类黄酮物质的类别，选择对应的金银花花蕾期的发育时期，若所提取的目标类黄酮物质为芒柄花素、7-氧甲基槲皮素中的一种，则选用的花蕾期为二白期；类黄酮物质为6-姜酚，则选用的花蕾期为三青期；类黄酮物质为桃苷元，则选用的花蕾期为大白期；
3)采用三青期、二白期和大白期和银花期的金银花作为检测材料，能从新鲜样品上判断金银花不同发育时期含有的类黄酮物质的种类和含量，进而提前判断针对金银花不同类型类黄酮物质进行后续加工选用金银花新鲜材料的最佳时期。
本发明还提供一种药用金银花质量判定方法，包括如下步骤：
1)利用所述的基于LC-MS/MS技术筛选金银花类黄酮物质的方法检测金银花花蕾中的类黄酮标记物质；
2)根据类黄酮物质在不同发育时期间倍数的显著差异性，筛选特定发育时期对应的特异标记类黄酮物质，二白期的类黄酮标记物为芒柄花素、7-氧甲基槲皮素中的一种；三青期的类黄酮标记物为6-姜酚，大白期的类黄酮标记物为桃苷元。
本发明还提供了利用筛选出来的标记类黄酮物质和含量变化，检测/鉴定不同发育时期金银花类黄酮标记物的思路和理论依据。尤其作为判断不同产区、不同品种金银花类黄酮积累水平差异的关键代谢指标，以及检测金银花加工产品中原材料类别及含量高低的参考依据。
本发明首次利用LC-MS/MS技术对不同发育阶段金银花的类黄酮物质进行了检测和分析。本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次建立了一套高效、快速和重复性好的金银花类黄酮高通量检测方法，为筛选反映不同发育阶段金银花特性的类黄酮标记物提供了依据。
2、本发明虽以金银花为例，但对整个植物花器官及其它组织类黄酮的高通量检测、标记类黄酮的筛选和一些药用植物的评价等都具有重要的意义。
3、本发明应用前景广阔，可以利用标记物判断/评价金银花不同产区、不同品种间的差异，以及评价金银花加工产品原材料的类别及含量高低。
4、本发明通过对金银花药用期不同发育阶段进行区分，有利于细分不同发育时期的类黄酮含量特性，体现金银花类黄酮物质随着发育阶段的变化特点，从而深入了解金银花花发育期间的特性变化。
附图说明
图1为本发明实施例1中四个发育阶段的金银花花蕾/花朵。其中， a：展示三青期花蕾(S3)；b：展示二白期花蕾(S4)；c：展示大白期花蕾(S5)；d：展示银花期花朵(S6)。
图2为本发明实施例3中各组样品及质控样品(mix)的主成分分析(PCA)得分图。
图3为本发明实施例3中各组样品及质控样品(mix)的相关性聚类图。
图4为本发明实施例3中四组样品两两比较的正交偏最小二乘法 -判别分析(OPLS-DA)得分图。a：三青期(S3)与二白期(S4)组间分析结果(R2X＝0.872,R2Y＝1和Q2Y＝0.999)；b：三青期(S3) 与大白期(S5)组间分析结果(R2X＝0.888,R2Y＝1和Q2Y＝0.999)；c：三青期(S3)与银花期(S6)组间分析结果(R2X＝0.943,R2Y＝1 和Q2Y＝1)；d：二白期(S4)与大白期(S5)组间分析结果(R2X＝0.873, R2Y＝1和Q2Y＝0.994)；e：二白期(S4)与银花期(S6)组间分析结果(R2X＝0.926,R2Y＝1和Q2Y＝1)；f：大白期(S5)与银花期(S6) 组间分析结果(R2X＝0.925,R2Y＝1和Q2Y＝0.999)。
图5为本发明本发明实施例3中四组样品两两比较的差异类黄酮物质火山图。a：三青期(S3)与二白期(S4)组间分析结果；b：三青期(S3)与大白期(S5)组间分析结果；c：三青期(S3)与银花期(S6)组间分析结果；d：二白期(S4)与大白期(S5)组间分析结果；e：二白期(S4)与银花期(S6)组间分析结果；f：大白期(S5) 与银花期(S6)组间分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例中涉及的试剂和标准品均为色谱纯，试剂购自Merck公司 (https://www.merck.com/index.html)，标准品购自BioBioPha公司 (http://www.biobiopha.com/)或Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)。
实施例1类黄酮提取液制备
(1)不同发育阶段金银花花蕾/花朵采集
根据前人的报道(Xiaofei Shang等，2011，Journal of Ethnopharmacology)将金银花花蕾形成后分为6个代表性时期，分别为幼蕾期(the juvenile bud stage)、三青期(the third green stage)、二白期(the second white stage)、大白期(the completewhite stage)、银花期(the silver flowering stage)和金花期(the gold floweringstage)。根据其他研究者的报道(Jie Wu等，2015，Scientific Reports)，幼蕾期可再细分为米蕾期和初蕾期。具体形态特征如表1所示。
表1金银花(Lonicera japonica)花发育各个时期的形态特征
Figure RE-GDA0002483426500000061
Figure RE-GDA0002483426500000071
分别收集并称取三青期、二白期、大白期、银花期的金银花花蕾 /花朵(图1)2-3g，每组样品准备3个生物学重复，液氮速冻后于-80℃中保存备用。
(2)金银花花蕾/花朵类黄酮的提取
真空冷冻干燥金银花样品；用研磨仪(MM，Retsch)将冻干样品研磨(30Hz，1.5min)至粉末状；准确称取100mg粉末，溶解于 1.0mL 70％(v/v)的甲醇水溶液中；溶解后放在4℃的冰箱中12h，期间涡旋三次以提高提取率；以转速10,000g将提取混合物离心10 min，吸取上清；用微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤样品后保存于进样瓶中，作为LC-MS/MS检测的提取液。并用所有样本提取物混合制备形成质控样本(QC)，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。
实施例2基于LC-MS/MS对金银花类黄酮样品的检测
数据采集仪器系统包括超高效液相色谱和串联质谱。
液相条件主要包括：①色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm；②流动相A：超纯水(含0.04％体积的乙酸)；流动相B：乙腈(含0.04％体积的乙酸)；③洗脱梯度：0-11min，95-5％流动相 A，5-95％流动相B；11-12min，5％流动相A，95％流动相B；12-12.1min，5-95％流动相A，95-5％流动相B；12.1-15min，95％流动相A， 5％流动相B；④流速0.3-0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL。
质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度为500℃；质谱电压5500 V；帘气25psi；碰撞诱导电离高；每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
实施例3金银花花蕾/花朵类黄酮检测结果分析
(1)类黄酮代谢物定性定量分析
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。主要基于代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。代谢物结构解析参考MassBank、KNAPSAcK、HMDB、MoTo DB和METLIN 等已有的质谱公共数据库。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。
(2)样本质控分析
在仪器分析的过程中，首尾及每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，判断代谢物提取和检测的重复性。结果显示代谢物检测总离子流的曲线重叠性高，即保留时间和峰强度均一致，表明质谱对同一样品不同时间检测时，信号稳定性较好。
(3)主成分及相关性分析
对所有样本(包括质控样品)预处理后的数据进行主成分分析，以便初步了解各组样本之间的总体差异和组内的变异度大小。本实施例3中组间变异度大，组内变异度小(图2)。并对所有样品的数据进行相关性分析，由图3可见，各组样品的组内相关性都很高，二白期 (S4)与大白期(S5)的相关性也很高。
(4)正交偏最小二乘法判别分析
正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结合了正交信号矫正(OSC) 和PLS-DA方法，能够将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，进一步展示各组之间的差异，在对任意两组的数据进行分析时，获得的模型均为出色的模型(图4)。再对OPLS-DA进行排列验证(n＝200，即进行200次排列实验)，R2’和Q2’均小于原始模型的R2和Q2，显示模型均有意义，可根据VIP值分析筛选差异代谢物。
(5)组间差异分析
通过分析比较各组样品间类黄酮代谢物的定量数据，以VIP≥1、 fold change≥2或≤0.5为标准，获得组间的差异类黄酮数量，整体结果如表2所示。通过火山图(VolcanoPlot)可以快速地查看代谢物在两组样品中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。样品间差异代谢物火山图见图5。
表2组间差异类黄酮统计结果
Figure RE-GDA0002483426500000091
备注：S4_vs_S3表示S4/S3，其余类似。
实施例4金银花药用花蕾期类黄酮差异代谢物分析和标记类黄酮筛选
(1)三青期(S3)与其它时期相比的显著差异类黄酮物质
将三青期与二白期、大白期和银花期相比较的显著差异物质作交集，共有12种显著差异类黄酮，其中6-姜酚在三青期中的含量均显著高于其它三个时期；同时，只有(S6 vsS3)出现最大的倍数变化，下调7.43倍，显著高于其他比较组的差异倍数。故6-姜酚可作为三青期(S3)的标记类黄酮(表3)。
(2)二白期(S4)与其它时期相比的显著差异类黄酮物质
将二白期与三青期、大白期和银花期相比较的显著差异物质作交集，共有5种显著差异类黄酮，其中(S4 vs S3)中的芒柄花素和7-氧甲基槲皮素出现较大的倍数变化，分别上调4.99和3.81倍；同时， (S5 vs S4)和(S6 vs S4)中的芒柄花素分别下调0.002和0.33倍， (S5 vs S4)和(S6 vs S4)中的7-氧甲基槲皮素分别下调0.25和0.21 倍。这些差异倍数比较结果，表明芒柄花素和7-氧甲基槲皮素在二白期中的含量均显著高于其它三个时期。故芒柄花素和7-氧甲基槲皮素可作为二白期(S4)的标记类黄酮(表3)。
(3)大白期(S5)与其它时期相比的显著差异类黄酮物质
将大白期与三青期、二白期和银花期相比较的显著差异物质作交集，共有3种显著差异类黄酮，其中(S5 vs S3)和(S5 vs S4)桃苷元出现较大的倍数变化，分别上调2.70和2.67倍；同时，(S6 vs S5) 中的桃苷元下调0.29倍。这些差异倍数比较结果，表明在大白期中的桃苷元含量均显著高于其它三个时期。故桃苷元可作为大白期的标记类黄酮(表3)。
表3三青期(S3)、二白期(S4)、大白期(S5)和银花期(S6)的30种主要类黄酮物质差异倍数列表
Figure RE-GDA0002483426500000101
Figure RE-GDA0002483426500000111
Figure RE-GDA0002483426500000121
备注：FC表示差异倍数；up表示上调；down表示下调。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种药用金银花花蕾期的类黄酮代谢标记物，其特征在于，二白期标志物为芒柄花素、7-氧甲基槲皮素中的一种；三青期标记物为6-姜酚；大白期标记物为桃苷元。
2.一种基于LC-MS/MS技术筛选金银花类黄酮物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：金银花花器官类黄酮物质的提取，质谱数据采集，质谱数据处理。
3.根据权利要求2所述的方法，所述金银花花器官类黄酮物质的提取方法为：真空冷冻干燥样品并研磨至粉末状，溶解于提取液中，混匀低温放置8-14h，离心后取上清，过滤备用。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述提取液为60-80％的甲醇水溶液，金银花样品冻干粉末与提取液的质量体积比为：5-20％；所述离心转速为10,000-12,000g，离心时间为10-12min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱和串联质谱，液相条件主要包括：
流动相A：含有0.03-0.05％体积乙酸的超纯水；流动相B：含有0.03-0.05％体积乙酸的乙腈；
洗脱梯度：0-11min，95-5％流动相A，5-95％流动相B；11-12min，5％流动相A，95％流动相B；12-12.1min，5-95％流动相A，95-5％流动相B；12.1-15min，95％流动相A，5％流动相B；
流速0.3-0.4mL/min；柱温30-40℃；进样量2-3μL；
质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度为500-600℃；质谱电压5000-5500V；帘气20-25psi；碰撞诱导电离高；每个离子对根据去簇电压和碰撞能进行扫描检测。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，质谱数据处理方法包括：主要基于代谢物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析；利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成代谢物的相对定量。
7.一种基于LC-MS/MS技术筛选金银花不同花蕾期类黄酮代谢标记物的方法，其特征在于，利用权利要求2-6任一项所述的方法对三青期、二白期、大白期和银花期的类黄酮物质进行检测和分析，所述分析方法包括主成分分析、相关性分析、正交偏最小二乘法-判别分析和差异倍数分析，通过样品间的比较分析，从复杂数据中筛选出药用花蕾期差异积累的类黄酮物质。
8.一种药用金银花花蕾期检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用权利要求2-6任一项所述的方法检测金银花花蕾中的类黄酮物质特性；
2)根据提取的类黄酮物质的类别，选择对应的金银花花蕾期的发育时期，若所提取的目标类黄酮物质为芒柄花素、7-氧甲基槲皮素中的一种，则选用的花蕾期为二白期；类黄酮物质为6-姜酚，则选用的花蕾期为三青期；类黄酮物质为桃苷元，则选用的花蕾期为大白期；
3)采用三青期、二白期和大白期和银花期的金银花作为检测材料，能从新鲜样品上判断金银花不同发育时期含有的类黄酮物质的种类和含量，进而提前判断针对金银花不同类型类黄酮物质进行后续加工选用金银花新鲜材料的最佳时期。
9.一种药用金银花质量判定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用权利要求2-6任一项所述的方法检测金银花花蕾中的类黄酮标记物质；
2)根据类黄酮物质在不同发育时期间倍数的显著差异性，筛选特定发育时期对应的特异标记类黄酮物质，二白期的类黄酮标记物为芒柄花素、7-氧甲基槲皮素中的一种；三青期的类黄酮标记物为6-姜酚，大白期的类黄酮标记物为桃苷元。
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