CN110146617A - 一种金银花体内代谢产物的识别方法 - Google Patents

一种金银花体内代谢产物的识别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金银花体内代谢产物的识别方法，包括如下步骤：制备金银花醇提物，给实验组动物连续灌胃几天，对照组灌胃等量生理盐水；每次灌胃后禁食8小时，取血样，通过超高效液相色谱‑高分辨质谱联用分析血样，得到包含质量数、保留时间和峰强度的峰值表；对实验组和对照组进行灌胃天数和金银花的双因素方差分析，筛选出只受金银花影响的变量，然后从只受金银花影响的变量中筛选出可能的金银花代谢产物；对可能的金银花代谢产物进行二级质谱分析，通过二级质谱中性丢失80确定为硫酸化代谢产物，中性丢失176确定为葡萄糖醛酸化代谢产物；二级质谱中同时出现中性丢失80和中性丢失176为葡萄糖醛酸苷的硫酸化代谢产物。

Description

一种金银花体内代谢产物的识别方法
技术领域
本发明专利涉及药物分析化学领域，具体涉及一种金银花体内代谢产物的识别方法。
背景技术
中医药学在我国有着几千年的历史，为中华民族的繁衍昌盛做出了不可磨灭的贡献。中医药学有着独特的诊疗方法以及特有的理论体系。随着社会发展与科技进步，医疗模式与消费观念逐步发生改变，“回归自然”、“崇尚自然”的消费潮流正在全球涌起，作为传统医学首要代表的中医药学受到了普遍重视。中药安全、有效、毒副作用小，并以标本兼治而著称，需求量极大且不断增加。金银花是忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，是药食同源的大宗中药材，其品质优劣与大众健康息息相关。金银花药用历史悠久，具有“清热解毒、疏散风热”的功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒和温病发热等症，效果显著。
金银花化学成分复杂，已分离出挥发油、酚酸、环烯醚萜、黄酮以及三萜皂苷等不同结构化学成分，并且新的化学成分不断被发现。金银花中部分化学成分的药代动力学已经得到研究。绿原酸和木犀草苷是中国药典规定的指标成分。金银花中的绿原酸成分，在小鼠的血浆中被吸收，并且快速代谢消失，其最高浓度首先在肝脏中观察到，然后在肾脏、肺、心脏和脾脏中发现。木犀草苷在狗中的消除半衰期为1.5h。这些研究说明金银花中的很多化学成分进入体内后快速代谢成别的化合物，发明人发现已有的研究只关注其原型成分，缺乏金银花体内代谢产物的识别方法。金银花药效活性成分的确定是提高金银花质量标准的关键，而且中药中的化学成分只有进入血液才会起作用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是建立一种金银花体内代谢产物的识别方法。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种金银花体内代谢产物的识别方法，包括如下步骤：
制备金银花醇提物，给实验组动物连续灌胃几天，对照组灌胃等量生理盐水；
每次灌胃后禁食8小时，取血样，通过超高效液相色谱-高分辨质谱联用分析血样，得到包含质量数、保留时间和峰强度的峰值表；
对实验组和对照组进行金银花和灌胃天数的双因素方差分析，筛选出只受金银花影响的变量，然后从只受金银花影响的变量中筛选出可能的金银花代谢产物；
对可能的金银花代谢产物进行二级质谱分析，通过二级质谱中性丢失80确定为硫酸化代谢产物，中性丢失176确定为葡萄糖醛酸化代谢产物；二级质谱中同时出现中性丢失80和中性丢失176为葡萄糖醛酸苷的硫酸化代谢产物。
该识别方法可以从血清或血浆中识别出金银花体内硫酸化和葡萄糖醛酸化代谢产物，为金银花作用机制研究和质量标准提升提供了理论基础和科学依据。
连续灌胃几天是为了考察代谢产物的重现性，以保证代谢产物识别的准确性。
在一些实施例中，所述金银花醇取物为金银花的甲醇/水提取液或乙醇/水提取液，醇与水的体积比为1:0.8-1.2，金银花与醇/水提取液的质量比为3:900-1100。甲醇的水溶液或乙醇的水溶液作为提取剂可有效提取出金银花中主要的药效活性成分，包括绿原酸类、黄酮类、环烯醚萜苷类等成分。
在一些实施例中，所述血样为血清或血浆。
进一步的，所述血样采用提取试剂进行提取，得上清液，冻干、复溶，然后采用复溶试剂进行复溶，复溶后进行超高效液相色谱-高分辨质谱分析，所述提取试剂为乙腈或甲醇。冻干，一是为了浓缩样品，二是为了除去提取试剂，采用高比例的水溶液进行复溶，以减少溶剂效应。
采用乙腈或甲醇对血样进行提取，沉淀蛋白，去除干扰。乙腈或甲醇对金银花中主要药效成分(绿原酸类、黄酮类、环烯醚萜苷类成分)提取效率较高。
进一步的，所述复溶试剂为乙腈/水溶液或甲醇/水溶液，其中水的体积分数为50％-95％。复溶试剂参考流动相的初始组成，水的比例太小，会出现溶剂效应。
在一些实施例中，持续喂养的时间为3-7天。
在一些实施例中，液相色谱-质谱分析中，液相色谱的色谱条件为：色谱柱为超高效液相色谱柱WatersHSS T3 column，2.1×100mm,1.8μm；
正离子模式：流动相A和B分别为含有0.1％甲酸的水溶液和含有0.1％甲酸的乙腈溶液。进样量5μL，流速0.3mL/min。洗脱梯度为0-1min,5％B；1-6min,5-40％B；6-8min,40-60％B；8-15min,60-85％B,15-18min,85-100％B；18-23min,100％B；23-23.1min,100-5％B；23.1-28min,5％B，柱温45℃；
负离子模式下，流动相C和D分别为含有6.5mM碳酸氢铵的水溶液和甲醇/水溶液(95:5,v/v)。进样量5μL。流速0.35ml/min。洗脱梯度为1-3min,2-40％B；3-5min,40-65％B；5-8min,65-92％B；8-12min,92％B；12-13min,100％B；18-18.1min,100-2％B；18.1-23min,2％B，柱温50℃。
金银花化学成分繁多，其代谢产物结构更为复杂，为了增加金银花代谢产物的覆盖度，对血样分别进行正离子模式和负离子模式的超高效液相色谱-高分辨质谱分析。并对两个采集模式下的洗脱梯度、柱温和流速进行了优化，以增加分离度、减小峰展宽、提高峰容量，获得最佳的洗脱条件。流速过快，柱温过高会使得共流出严重，峰重叠，分离度差。流速过慢，柱温过低，会使得峰展宽严重，很多成分洗脱不出来，峰容量减少。同时对色谱柱柱后管路的内径进行了优化，发现对于超高效液相色谱柱，粗内径的管路会使得色谱峰严重拖尾，细内径的管路会大大改善这种情况，选择内径小于等于0.004mm的细内径管路，以保证峰值的准确性。
进一步的，质谱条件为：喷雾器，2.0Bar；干燥气，8L/min；干燥气温度，200℃；离子漏斗，300Vpp；六级杆，60Vpp；传输时间，80μs；毛细管电压正模式下设置为3500V，负模式下设置为3000V；质量数扫描范围为5-1200。对不同代谢产物的二级质谱碰撞能进行了优化，碰撞能设定为20eV-50eV。碰撞能太大，代谢物严重裂解，碎片质量数很小，没有中性丢失的特征，难以实现代谢产物的定性。碰撞能太小，没有有效的碎片离子信息。
更进一步的，在筛选代谢产物时，根据空白背景将噪声设置为1000，信噪比设置为50，其信噪比高于设定值的认为是有效峰，低于设定值的认为是背景、无效峰。即，在对照组中峰响应与信噪比低于阈值，在实验组中峰响应与信噪比高于阈值且高于对照组的峰筛选为外源性的金银花代谢产物。
在一些实施例中，硫酸化代谢产物为：二氢香豆酸-硫酸盐(Dihydrocoumaricacid-sulfate)、二氢咖啡酸-硫酸盐(Dihydrocaffeic acid-sulfate)、二氢阿魏酸-硫酸盐(Dihydroferulic acid-sulfate)、邻苯二酚-硫酸盐(Catechol sulfate)(负离子模式下识别)；
葡萄糖醛酸化代谢产物：芹菜素-葡萄糖醛酸苷(Apigenin-glucuronide)、芹菜素-甲基醚-葡萄糖醛酸苷(Apigenin-methylether-glucuronide)和5-羟基-6-甲氧基吲哚-葡萄糖醛酸苷(5-Hydroxy-6-methoxyindole glucuronide)(正离子模式下识别)；
葡萄糖醛酸苷-硫酸化代谢产物：芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐(Apigenin-glucuronide-sulfate)和异鼠李素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐(Isorhamnetin-glucuronide-sulfate)(正离子模式下识别)。
本发明的有益效果为：
1.本发明首次对金银花体内硫酸化和葡萄糖醛酸化代谢产物进行了质谱鉴定。
2.本发明可快速从复杂的血清或血浆样品中筛选金银花的代谢产物。
3.本方法操作简单、重复性好。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为二氢香豆酸-硫酸盐代谢产物的二级质谱图；
图2为二氢香豆酸-硫酸盐代谢产物的EIC图；
图3为芹菜素-葡萄糖醛酸苷代谢产物的二级质谱图；
图4为芹菜素-葡萄糖醛酸苷代谢产物的EIC图；
图5为芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐代谢产物的二级质谱图；
图6为芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐代谢产物的EIC图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
一种金银花体内代谢产物的识别方法，包括如下步骤：
1)金银花提取：准确称取40g金银花粉末，加入2L的甲醇/水溶液(v/v,1:1)。超声40min，过滤。然后旋蒸浓缩，冻干。金银花冻干粉，用蒸馏水复溶，浓度为1g/mL。
2)动物实验：准备SD大鼠14只，适应性喂养1周后，随机分成2组，实验组和对照组。实验组每天喂食3g/kg金银花(以初始金银花量计算)，对照组喂食等量生理盐水。在第1天、第3天和第5天灌胃后8小时禁食，从眼球采血样。制备血浆样品。
3)血浆提取：取200μL血浆加入800μL乙腈溶液.将混合物涡旋1分钟，然后离心10分钟，取上清液400μL冻干。用100μL水/乙腈溶液(v/v,19:1)复溶。
4)液相色谱-质谱分析条件：使用超高效液相色谱(UPLC,ACQUITY,H-Class,Waters)-高分辨飞行时间质谱(ImpactⅡ,Bruker)。使用色谱柱为WatersHSS T3column(2.1×100mm,1.8μm)。正离子模式下，流动相A和B分别为含有0.1％甲酸的水溶液和含有0.1％甲酸的乙腈溶液。进样量5μL。流速0.3mL/min。洗脱梯度为0-1min,5％B；1-6min,5-40％B；6-8min,40-60％B；8-15min,60-85％B,15-18min,85-100％B；18-23min,100％B；23-23.1min,100-5％B；23.1-28min,5％B.柱温45℃。负离子模式下，流动相C和D分别为含有6.5mM碳酸氢铵的水溶液和甲醇/水溶液(95:5,v/v)。进样量5μL。流速0.35ml/min。洗脱梯度为1-3min,2-40％B；3-5min,40-65％B；5-8min,65-92％B；8-12min,92％B；12-13min,100％B；18-18.1min,100-2％B；18.1-23min,2％B。柱温50℃。质谱条件如下。喷雾器，2.0Bar；干燥气，8L/min；干燥气温度，200℃；离子漏斗300Vpp；六级杆，60Vpp；传输时间，80μs；毛细管电压正模式下设置为3500V，负模式下设置为3000V；质量数扫描范围为5-1200。二级质谱碰撞能设定为20eV-50eV。
5)金银花代谢产物筛选
将采集得到的样品数据通过XCMS软件得到包含有质量数、保留时间和强度的峰值表。正离子模式下得到7110个变量，负离子模式下得到4370个变量，通过双因素方差分析筛选只受金银花影响的变量、只受时间影响的变量、同时受金银花和时间影响的变量。在正离子模式下，筛选出568个只受金银花影响的变量。在负离子模式下，筛选出393个只受金银花影响的变量。根据质谱的空白背景，将噪声值设置为1000，信噪比设置为50。从只受金银花影响的变量中筛选可能的金银花体内代谢产物。
6)金银花代谢产物定性
根据二级质谱数据，中性丢失80确定为硫酸化代谢产物，中性丢失176确定为葡萄糖醛酸。二级质谱中同时出现中性丢失80和中性丢失176为葡萄糖醛酸苷的硫酸化代谢产物。定性出9个硫酸化和葡萄糖醛酸化代谢产物。在正离子模式下定性出5个代谢产物，负离子模式下定性出4个代谢产物。
硫酸化代谢产物：在负离子模式下定性出二氢香豆酸-硫酸盐(1.2min)、二氢咖啡酸-硫酸盐(0.9min)、二氢阿魏酸-硫酸盐(1.3min)、邻苯二酚-硫酸盐(2.5min)4个硫酸化代谢产物。二氢香豆酸-硫酸盐测定质量数为245.0116，与理论值的误差为3ppm，子离子是165.0539,121.0661,119.0506和106.0422(碰撞能35eV)(图1)。子离子165.0539由中性丢失硫酸盐(NL 80)得到,子离子121.0661,119.0506 and 106.0422是二氢香豆酸的二级质谱特征。二氢香豆酸-硫酸盐的提取离子流图(EIC)见图2。同样的，二氢咖啡酸-硫酸盐的测定质量数是261.0066，与理论值的误差为1ppm，子离子是181.0521,137.0613,121.0303和109.0303(碰撞能35eV)。子离子181.0521由中性丢失硫酸盐得到,子离子137.0613,121.0303和109.0303是二氢咖啡酸的二级质谱特征。它们是绿原酸和异绿原酸的代谢产物。
葡萄糖醛酸化代谢产物：在正离子模式下，定性出芹菜素-葡萄糖醛酸苷(5.8min)和芹菜素-甲基醚-葡萄糖醛酸苷(5.2min)和5-羟基-6-甲氧基吲哚-葡萄糖醛酸苷(4.9min)3个葡萄糖醛酸化代谢产物。芹菜素-葡萄糖醛酸苷的测定质量数为447.0926，与理论值的误差为1ppm，子离子为271.0601,243.066,215.0712 and 153.0185(碰撞能50eV)(图3)，子离子271.0601是中性丢失葡萄糖醛酸(176)得到的芹菜素,子离子243.066,215.0712 and 153.0185是芹菜素的二级质谱特征。芹菜素-葡萄糖醛酸苷的EIC图见图4。
葡萄糖醛酸苷-硫酸化代谢产物：在正离子模式下，定性出芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐(4.9min)和异鼠李素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐(5.3min)2个葡萄糖醛酸-硫酸化代谢产物.芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐测定质量数为527.0500，与理论值的误差为2ppm,子离子为351.0167和271.0601(碰撞能38eV)(图5)。527和子离子351相差176,说明有葡萄糖醛酸，子离子351和271相差80，说明有硫酸盐。芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐的EIC图见图6。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种金银花体内代谢产物的识别方法，其特征在于：包括如下步骤：
制备金银花醇提物，给实验组动物连续灌胃几天，对照组灌胃等量的生理盐水；
灌胃后禁食8小时，取血样，通过超高效液相色谱-高分辨质谱分析血样，得到包含质量数、保留时间和峰强度的峰值表；
对实验组和对照组进行金银花和灌胃时间的双因素方差分析，筛选出只受金银花影响的变量，从只受金银花影响的变量中筛选出可能的金银花代谢产物；
对可能的金银花代谢产物进行二级质谱分析，通过二级质谱中性丢失80确定为硫酸化代谢产物，中性丢失176确定为葡萄糖醛酸化代谢产物；二级质谱中同时出现中性丢失80和中性丢失176为葡萄糖醛酸苷的硫酸化代谢产物。
2.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：所述金银花醇取物为金银花的甲醇/水提取液或乙醇/水提取液，醇与水的体积比为1:0.8-1.2，金银花与醇/水提取液的质量比为3:900-1100。
3.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：所述血样为血清或血浆。
4.根据权利要求3所述的识别方法，其特征在于：所述血样采用提取试剂进行提取，得上清液，冻干、复溶，然后采用复溶试剂进行复溶，复溶后进行液相色谱-质谱分析，所述提取试剂为乙腈或甲醇。
5.根据权利要求4所述的识别方法，其特征在于：所述复溶试剂为乙腈/水溶液或甲醇/水溶液，其中水的体积分数为50％-95％。
6.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：连续灌胃的时间为3-7天。
7.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：液相色谱-质谱分析中，液相色谱的色谱条件为：色谱柱为超高效液相色谱柱WatersHSS T3 column，2.1×100mm,1.8μm；
正离子模式：流动相A和B分别为含有0.1％甲酸的水溶液和含有0.1％甲酸的乙腈溶液。进样量5μL，流速0.3mL/min。洗脱梯度为0-1min,5％B；1-6min,5-40％B；6-8min,40-60％B；8-15min,60-85％B,15-18min,85-100％B；18-23min,100％B；23-23.1min,100-5％B；23.1-28min,5％B，柱温45℃；
负离子模式下，流动相C和D分别为含有6.5mM碳酸氢铵的水溶液和甲醇/水溶液(95:5,v/v)，进样量5μL，流速0.35ml/min，洗脱梯度为1-3min,2-40％B；3-5min,40-65％B；5-8min,65-92％B；8-12min,92％B；12-13min,100％B；18-18.1min,100-2％B；18.1-23min,2％B，柱温50℃。
8.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：质谱条件为：喷雾器，2.0Bar；干燥气，8L/min；干燥气温度，200℃；离子漏斗，300Vpp；六级杆，60Vpp；传输时间，80μs；毛细管电压正模式下设置为3500V，负模式下设置为3000V；质量数扫描范围为5-1200，二级质谱碰撞能设定为20eV-50eV。
9.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：在筛选金银花代谢产物时，根据空白背景将噪声设置为1000，信噪比设置为50。
10.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于：硫酸化代谢产物为：二氢香豆酸-硫酸盐、二氢咖啡酸-硫酸盐、二氢阿魏酸-硫酸盐、邻苯二酚-硫酸盐；
葡萄糖醛酸化代谢产物：芹菜素-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-甲基醚-葡萄糖醛酸苷和5-羟基-6-甲氧基吲哚-葡萄糖醛酸苷；
葡萄糖醛酸苷-硫酸化代谢产物：芹菜素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐和异鼠李素-葡萄糖醛酸苷-硫酸盐。
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