CN115201391B - 一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，包括：1)依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据；2)依据组织样品的LC‑MS/MS分析数据和GC‑MS/MS分析数据，确定代谢物及其第二维度定性结果数据；3)确定同组代谢物的第三维度定性结果数据；4)建立空间代谢组数据库。本发明进一步提供上述空间代谢组数据库。本发明提供的一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，能够确保数据库完整性及准确性。
Description
技术领域
本发明属于质谱分析的技术领域，涉及一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，具体涉及一种通过原位一级质谱测定、连续切片组织匀浆GCMS和LCMS色谱质谱联用测定、原位二级质谱测定等对组织连续冰冻切片样本中代谢物进行多维度定性，从而建立代谢物注释的空间代谢组数据库的方法。
背景技术
空间代谢组技术由于其样本制备简单、能同时对上千种分子进行定性、定量、定位，被认为有望成为新一代疾病诊断的分子影像技术。随着2020年空间转录组被Naturemethods当选为年度技术，空间代谢组技术近年来呈现快速发展的势头，市场容量不断扩大，业务量持续不断增长，拥有广阔的发展前景。但是由于质谱扫描速度的限制，目前空间代谢组采集主要基于一级质谱采集且前端缺乏色谱的分离，因此在缺乏保留时间和二级质谱的情况下，当前存在的主要问题为：仅用MS1定性，定性准确度低，仅能实现分子式的确定及部分代谢物注释，而原位二级由于质谱扫描速度的限制，存在通量低的情况，而且原位电离的加和离子情况目前也没有太多报道说明存在的情况，当前针对空间代谢组分析也没有特别完善的数据库支持。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，通过对组织连续冰冻切片样本分别进行原位质谱分析、GC-MS/MS及LC-MS/MS代谢组分析、原位二级质谱分析等多平台多维度协同分析，基于定性结果建立不同组织类型样本的空间代谢组数据库，便于对不同组织类型样本中代谢物基于分子式进行确定。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，包括以下步骤：
1)依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据，所述第一维度定性结果数据包括有代谢物的质荷比(m/z)、加和离子形式、分子式和质谱成像图；
2)依据组织样品的LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据，将LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据中的保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子与标准谱库中相应数据进行匹配，按数据矩阵总打分原则确定代谢物及其第二维度定性结果数据，所述第二维度定性结果数据包括有代谢物的分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图和GC-MS/MS二级碎片质谱图；
3)将步骤1)的第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图进行网格分区后标记高表达区域，按照质谱成像图中高表达区域相似原则分组确定同组代谢物的高表达区域的质谱成像图进行PRM数据采集，获得同组代谢物的第三维度定性结果数据，所述第三维度定性结果数据包括有代谢物的原位二级质谱图；
4)通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配，并通过第三维度定性结果数据的原位二级质谱图中二级碎片离子与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配，确定组织样品中各种代谢物后将相应代谢物的第一维度定性结果数据、第二维度定性结果数据、第三维度定性结果数据合并建立空间代谢组数据库。
本发明第二方面提供一种多维注释的空间代谢组数据库，由上述方法建立。
如上所述，本发明提供的一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，通过对组织连续冰冻切片样本分别进行原位质谱分析、GC-MS/MS及LC-MS/MS代谢组分析及原位二级质谱分析等多平台多维度分析，对不同组织样本整合基于质谱成像一级定性、GC-MS/MS和LC-MS/MS相邻组织切片匀浆定性以及原位二级质谱定性多个维度的定性结果，建立不同组织类型样本的空间代谢组数据库。该数据库与其他空间代谢组数据库不同之处在于整合一级质谱成像信息、原位二级质谱验证信息、最优加和离子形式、GC-MS/MS二级碎片质谱信息、LC-MS/MS二级碎片质谱信息等多个维度的定性结果，从而确保数据库完整性及准确性，便于不同组织类型样本基于AFAI-DESI空间成像平台的研究。
附图说明
图1显示为本发明的连续切片设计示意图。
图2显示为本发明的样品基质加标示意图。
图3显示为本发明中相同物质的同位素峰的质谱成像图。
图4显示为本发明中相同物质的不同加和离子形式下的质谱成像图。
图5显示为本发明的相同物质的不同采集模式下的质谱成像图5a、5b，其中，图5a为正离子模式下代谢物的质谱成像图，图5b为负离子模式下代谢物的质谱成像图。
图6显示为本发明的低信号离子的质谱成像图。
图7显示为本发明的质谱成像图的分区图。
图8显示为本发明的原位二级特征碎片离子验证分区情况示意图。
图9显示为本发明的采集列表图。
图10显示为本发明的原位二级质谱特征碎片离子与参考谱库中二级碎片离子的匹配图。
图11显示为本发明的空间代谢组数据库中部分多维注释数据图11a、11b、11c、11d，其中，图11a为质谱成像图，图11b为原位二级质谱图，图11c为用于定性匹配的GC-MS/MS二级碎片质谱图，图11d为用于定性匹配的LC-MS/MS二级碎片质谱图。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，包括以下步骤：
1)依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据，所述第一维度定性结果数据包括有代谢物的质荷比(m/z)、加和离子形式、分子式和质谱成像图；
2)依据组织样品的LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据，将LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据中的保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子与标准谱库中相应数据进行匹配，按数据矩阵总打分原则确定代谢物及其第二维度定性结果数据，所述第二维度定性结果数据包括有代谢物的分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图和GC-MS/MS二级碎片质谱图；
3)将步骤1)的第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图进行网格分区后标记高表达区域，按照质谱成像图中高表达区域相似原则分组确定同组代谢物的高表达区域的质谱成像图进行PRM数据采集，获得同组代谢物的第三维度定性结果数据，所述第三维度定性结果数据包括有代谢物的原位二级质谱图；
4)通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配，并通过第三维度定性结果数据的原位二级质谱图中二级碎片离子与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配，确定组织样品中各种代谢物后将相应代谢物的第一维度定性结果数据、第二维度定性结果数据、第三维度定性结果数据合并建立空间代谢组数据库。
在上述步骤1)或2)中，所述组织样品包括且不限于脑、心、肝、脾、肺、肾脏组织。具体来说，所述组织样品选自脑、心、肝、脾、肺或肾脏组织中的一种。
上述组织样品为动物或人体的组织。
在上述步骤1)或2)中，所述组织样品要预先进行切片。
在一实施例中，所述切片为样品的矢状面和/或冠状面的冰冻切片。所述冰冻切片是将组织样品冰冻后解冻、固定、切片，获得的样片再进行冰冻保存，待用。
具体来说，所述冰冻在-85～-75℃超低温冰箱保存。
具体来说，所述解冻在-25～-15℃冰箱过夜解冻。
具体来说，所述固定是在包埋盒底托上添加包埋胶固定组织样品。所述包埋胶完全覆盖组织样品即可。所述包埋胶为Cryo-Gel包埋胶(Leica Cryo-Gel EmbeddingMedium,Item No.39475237)。
具体来说，所述切片是将固定后的组织样品经切片机切片。
在一实施例中，所述切片的厚度为10-40μm，优选为10-30μm。
在上述步骤1)中，所述组织样品切片后粘附于玻片上。
具体来说，所述玻片为正电荷防脱玻片。所述正电荷防脱玻片为Superfrost Plus正电荷防脱载玻片。
在上述步骤1)中的组织样品切片数量与上述步骤2)中的组织样品切片数量之比为2:3-5，优选为2:4。具体来说，上述步骤1)中的组织样品切片数量与上述步骤2)中的组织样品切片数量分别为2张和4张。
上述步骤1)中的组织样品切片用于一级质谱成像分析，一般正负离子需要切片各一张；上述步骤2)中的组织样品切片用于LC-MS/MS和GC-MS/MS分析，由于要经过前处理，所以所需的量要多。
在上述步骤1)中，所述依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据，是将组织样品采用原位采集及标准品加标后采集，分别进行一级质谱成像分析，通过获得的不同采集模式下质谱成像图中离子峰、加合离子形式进行相似比较，确定归属为具有同一分子式的代谢物，并确定代谢物的第一维度定性结果数据。
在一实施例中，所述一级质谱成像分析采用质谱成像系统AFAI-QE进行质谱成像分析。
上述质谱成像系统AFAI-QE中，原位离子源型号为AFAI-MSI，由维科托(中国北京)科技有限公司生产；质谱型号为Q Exactive，由美国Thermo-fish公司生产。
在一实施例中，所述一级质谱成像分析的条件为：数据采集用Xcalibur数据采集和处理系统；喷雾电压为0V；传输管电压为0V；扫描极性为正/负离子模式；毛细管温度为350℃；辅助气温度为0℃；扫描模式为全扫描scan；扫描范围为100-1000Da；分辨率为70000。
在一个优选的实施例中，所述扫描模式采用逐行扫描方式，扫描速度(水平位移速率)为0.1-0.4(Vx，mm/s)，优选为0.2(Vx，mm/s)；相邻两个扫描行之间的步进间距(垂直位移距离)为0.05-0.2(Dy，mm)，优选为0.1(Dy，mm)；每一行扫描结束后的延迟时间为6-8(Dt，ms)，优选为7(Dt，ms)；返回到同一行的扫描起点的速度为9-11mm/s，优选为10mm/s。
在一实施例中，所述一级质谱成像分析时，喷雾点状态条件为：雾化气流量为0.69-0.71MPa，优选为0.7MPa；喷雾溶剂流速为5.9-6.1μL/min，优选为6μL/min；喷针伸出的长度d2为0.49-0.51mm，优选为0.5mm。
在一实施例中，所述一级质谱成像分析时，空间几何参数为：DESI喷针与载玻片之间的夹角α1为49-51°，优选为50°；离子传输管与载玻片之间的夹角α2为14-16°，优选为15°；喷针距离载玻片的垂直距离d1为1.9-2.1mm，优选为2.0mm；喷雾点距离离子传输管的水平距离d3为1-3mm，优选为2mm；离子传输管下缘距离载玻片距离d4为0.98-1.02mm，优选为1mm。
在一实施例中，所述标准品为生物组织中常见代谢物的相应同位素标准品溶液。
在一个优选的实施例中，所述标准品的浓度为5-15μg/mL，优选为10μg/mL。
在一个优选的实施例中，所述标准品中采用的溶剂为40-60％甲醇水溶液，优选为50％甲醇水溶液。
在一实施例中，所述原位采集是指对于组织样品的切片在不经过处理的情况下，直接通过原位离子源进行代谢物的质谱成像分析。
在一实施例中，所述标准品加标后采集是指将标准品滴加到组织样品的切片上，然后进行质谱成像分析。
在一个优选的实施例中，所述标准品加标是将标准品滴加于第一切片样品上。
在进一步优选的实施例中，所述标准品滴加的体积为1-3μL，优选为2μL。
在一实施例中，所述不同采集模式为原位采集或标准品加标后采集。
在一实施例中，所述相似比较采用所述空间组定性软件进行定性分析。具体来说，所述空间组定性软件为自主开发的空间组定性软件《空间代谢组质谱数据定性软件V1.0》(软著编号：2021R11L2143056)。
在一实施例中，所述相似比较是将原位采集及标准品加标后采集后进行一级质谱成像分析获得的质谱成像图中不同离子峰(分子离子峰与加标产生的同位素峰)、不同加合离子形式进行相似比较，确定归属为具有同一分子式的代谢物。
在一实施例中，所述相似比较的原则包括以下至少一项：
A)所述组织样品中相同代谢物相应的分子离子峰与同位素离子峰具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
B)所述组织样品中相同代谢物的不同加合离子形式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
C)所述组织样品中相同代谢物的不同离子采集模式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
D)在正离子模式下，像素点最高强度≤2000和/或平均强度≤1000的离子不予考虑；
E)在负离子模式下，像素点最高强度≤1000和/或平均强度≤500的离子不予考虑。
在A)、B)或C)中，上述组织分布特点是指代谢物在组织样品的切片上的表达分布情况。
在A)、B)或C)中，上述质谱成像图高度正相关是指判别不同质谱成像图相对应的不同离子峰、加合离子形式或离子采集模式是否能归属为具有同一分子式的代谢物。当质谱成像图高度相似时，可以归属为具有同一分子式的代谢物。
在D)或E)中，上述离子容易产生散点或重现性不好的情况，故不予考虑。
在上述步骤1)中，上述代谢物的加和离子形式为不同代谢物的最优加和离子形式，根据不同加和离子形式下质谱信号强度及质谱成像图分辨情况进行选择。
在上述步骤1)中，所述第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图是采用MassImager(V1.0)软件获得。
在上述步骤2)中，所述组织样品的LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据，是将所述组织样品进行预处理后获得的上清液分为第一分析样品和第二分析样品，将第一分析样品采用液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)进行测定，获得LC-MS/MS分析数据，将第二分析样品进行再处理后采用气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)进行测定，获得GC-MS/MS分析数据。
在一实施例中，所述第一分析样品与第二分析样品的体积之比为1:1。
在一实施例中，所述预处理包括：将组织样品匀浆后加入第一提取液涡旋混合、离心，取上清液分为第一分析样品和第二分析样品。
在一个优选的实施例中，所述第一提取液为甲醇与乙腈的混合溶液，所述甲醇与乙腈的体积之比为1:0.9-1.1，优选为1:1。
在一个优选的实施例中，所述组织样品加入的质量mg与第一提取液加入的体积μL之比为0.9-1.1:60，优选为1:60。
在一个优选的实施例中，所述涡旋混合的时间为0.5-1.5min，优选为1min。
在一个优选的实施例中，所述涡旋混合的温度为3-5℃，优选为4℃。
在一个优选的实施例中，所述涡旋混合的设备为涡旋混匀仪。所述涡旋混匀仪为常规使用的涡旋混匀仪。
在一个优选的实施例中，所述离心的转速为10000-15000rpm，优选为12000rpm。
在一个优选的实施例中，所述离心的时间为5-15min，优选为10min。
在一实施例中，所述再处理包括：将第二分析样品浓缩后加入第二提取液进行第一次涡旋震荡后进行肟化反应，再加入第三提取液进行第二次涡旋震荡后进行加热反应，冷却、静置。
在一个优选的实施例中，所述浓缩为离心浓缩干燥器挥干第二分析样品，所述浓缩温度为35-40℃，优选为37℃；所述浓缩时间为1-3h，优选为2h。
所述离心浓缩干燥器为常规使用的冷冻离心真空干燥机。
在一个优选的实施例中，所述第二提取液为甲氧胺盐酸盐吡啶溶液。
在进一步优选的实施例中，所述甲氧胺盐酸盐吡啶溶液的浓度为10-20mg/mL，优选为15mg/mL。
在一个优选的实施例中，所述第二分析样品与第二提取液加入的体积之比为25:30-50，优选为25:40。
在一个优选的实施例中，所述第一次涡旋震荡的时间为1-3min，优选为2min。
在一个优选的实施例中，所述肟化反应的反应条件为：反应装置为振荡培养箱；反应温度为35-40℃，优选为37℃；反应时间为85-95min，优选为90min。所述振荡培养箱为常规使用的振荡培养箱。
在一个优选的实施例中，所述第三提取液为衍生化试剂和正己烷的混合溶液，所述衍生化试剂为含有三甲基氯硅烷(TMCS)的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，CAS号为25561-30-2)。
在进一步优选的实施例中，所述衍生化试剂为含有0.5-1.5v/v％的TMCS的BSTFA。
在进一步优选的实施例中，所述衍生化试剂、正己烷与第二分析样品加入的体积之比为20-30:15-25:25，优选为25:20:25。
在一个优选的实施例中，所述第二次涡旋震荡的时间为1-3min，优选为2min。
所述第一次涡旋震荡和第二次涡旋震荡在涡旋混匀仪中进行。所述涡旋混匀仪为常规使用的涡旋混匀仪。
在一个优选的实施例中，所述加热反应的反应条件为：反应温度为65-75℃，优选为70℃；反应时间为55-75min，优选为60min。
所述加热反应在恒温培养箱中进行。所述恒温培养箱为常规使用的恒温培养箱。
在一个优选的实施例中，所述冷却至室温。所述室温为20-30℃。
在一个优选的实施例中，所述静置的时间为25-35min，优选为30min。
在一实施例中，所述液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)采用的液相色谱质谱联用仪为Waters I-class超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统。
在一实施例中，所述液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：T3色谱柱；柱温：40-50℃；流速：0.30-0.40mL/min；进样量：1-5μL；流动相：水(含0.05-0.15wt％甲酸)-乙腈(含0.05-0.15wt％甲酸)，其中，A相为：水(含0.05-0.15wt％甲酸)，B相为：乙腈(含0.05-0.15wt％甲酸)；分析时间为18min；梯度洗脱。
在一个优选的实施例中，所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm×1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；流动相：水(含0.1wt％甲酸)-乙腈(含0.1wt％甲酸)，其中，A相为：水(含0.1wt％甲酸)，B相为：乙腈(含0.1wt％甲酸)；分析时间为18min；梯度洗脱。
在一个优选的实施例中，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～2min，A相：B相体积比为95：5-95：5；
2～4min，A相：B相体积比为95：5-70：30；
4～14min，A相：B相体积比为70：30-0：100；
14～16min，A相：B相体积比为0：100-0：100；
16～16.1min，A相：B相体积比为0：100-95：5；
16.1～18min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
在一实施例中，所述液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
离子源：电喷雾ESI；电离方式：正负离子检测模式；电喷雾电压(Spray Voltage)：正离子3800V，负离子3200V；毛细管温度(Capillary Temperature)：正离子和负离子均为320℃；探头加热器温度(Probe Heater Temperature)：正离子和负离子均为350℃；保护气流速(Sheath Gas Flow Rate)：正离子和负离子均为40Arb；辅助气流速(Aux gas flowrate)：正离子和负离子均为8Arb；透镜电压(S-lens RF level)：正离子和负离子均为50V；质量数校正范围(Mass range)：正离子和负离子均为100-1000m/z；全质谱分辨率(Full msresolution)：正离子和负离子均为70000；质谱/质谱分辨率(MS/MS resolution)：正离子和负离子均为35000；分步归一化碎裂能(Stepped Normalized Collisional Energy，NCE/stepped NCE)：正离子和负离子均为10，20，40。具体结果见下表1。
表1
| 参数 | 正离子 | 负离子 |
| Spray Voltage(V) | 3800 | 3200 |
| Capillary Temperature(℃) | 320 | 320 |
| Probe Heater Temperature(℃) | 350 | 350 |
| Sheath Gas Flow Rate(Arb) | 40 | 40 |
| Aux gas flow rate(Arb) | 8 | 8 |
| S-lens RF level | 50 | 50 |
| Mass range(m/z) | 100-1000 | 100-1000 |
| Full ms resolution | 70000 | 70000 |
| MS/MS resolution | 35000 | 35000 |
| NCE/stepped NCE | 10，20，40 | 10，20，40 |
在一实施例中，所述气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)采用的气相色谱质谱联用仪为Thermo公司生产的Trace 1310/TSQ 9000气质联用仪。
在一实施例中，所述气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)中，所述气相色谱的测定条件为：
色谱柱：DB毛细管色谱柱；载气为高纯氮气，载气纯度≥99.999％；载气流速为1.0-1.5mL/min；进样口的温度为290-310℃；进样量为0.5-2μL；进样方式：不分流进样，溶剂延迟4-6min；升温程序为：初始温度为55-65℃保持0.1-1.0min，以7-9℃/min的速率升温至120-130℃，再以4-6℃/min的速率升温至200-220℃，再以9-11℃/min的速率升温至260-280℃，再以19-21℃/min的速率升温至300-310℃，保持4-6min。
在一个优选的实施例中，所述气相色谱的测定条件为：色谱柱：DB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，柱长×内径×固定相膜厚度，Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)；载气为高纯氮气，载气纯度≥99.999％；载气流速为1.2mL/min；进样口的温度为300℃；进样量为1μL；进样方式：不分流进样，溶剂延迟5min；升温程序为：初始温度为60℃保持0.5min，以8℃/min的速率升温至125℃，再以5℃/min的速率升温至210℃，再以10℃/min的速率升温至270℃，再以20℃/min的速率升温至305℃，保持5min。
在一实施例中，所述气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电子轰击(EI)离子源；离子源温度：325-325℃；传输线温度：275-285℃；电离能量：70eV；扫描方式：全扫描模式(full scan)；质量扫描范围：m/z 50-500。
在一个优选的实施例中，所述质谱的测定条件为：
电离方式：电子轰击(EI)离子源；离子源温度：330℃；传输线温度：280℃；电离能量：70eV；扫描方式：全扫描模式(full scan)；质量扫描范围：m/z 50-500。
在上述步骤2)中，所述LC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配采用QI软件进行定性分析。具体来说，所述QI软件为沃特世旗下公司Nonlinear Dynamics开发新一代LC-MS/MS数据分析软件。
在上述步骤2)中，所述LC-MS/MS分析数据进行匹配的标准谱库采用HMDB、Metlin或自建谱库中至少一种谱库。
上述HMDB数据库为商品化的代谢组学综合数据库，包含代谢物实验和理论的质谱谱库。上述Metlin数据库为具有大量代谢产物的商品化的MS/MS图谱谱库。上述自建谱库为基于标准品通过采用和实际组织样品相同的测定方法如液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)建立的具有代谢物名称、分子式、分子量、LC-MS/MS二级碎片质谱图等信息的标准品质谱数据库。
在一实施例中，所述LC-MS/MS分析数据为质谱下机原始数据(.raw格式)，采用QI软件中QI内嵌峰峰提取、峰识别、峰对齐、峰匹配等算法将LC-MS/MS质谱下机数据与标准谱库进行保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子匹配，获得代谢物定性列表。
在上述步骤2)中，所述GC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配采用MS-DIAL软件进行定性分析。具体来说，所述MS-DIAL软件为是常规使用的代谢组学和脂质组学代谢物注释软件。所述MS-DIAL软件的具体操作参见文献《MS-DIAL:data independent MS/MSdeconvolution for comprehensive metabolome analysis.Nature Methods,12,523-526,2015》。
在上述步骤2)中，所述GC-MS/MS分析数据进行匹配的标准谱库采用LUG本地自建库。具体来说，所述LUG本地自建库为专利申请号CN202010401911.0的多物种GC-MS内源性代谢物数据库。
在一实施例中，所述GC-MS/MS分析数据为质谱下机原始数据(.raw格式)，采用MS-DIAL软件中MS-DIAL内嵌峰峰提取、峰识别、峰对齐、峰匹配等算法将GC-MS/MS质谱下机数据与标准谱库进行保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子匹配，获得代谢物定性列表。
所述LC-MS/MS下机数据和GC-MS/MS下机数据均为质谱采集原始数据。所述一级质谱图的分子离子峰是指经过一级质谱全扫描得到的分子离子峰数据。所述二级质谱图的二级碎片离子是指分子离子峰经过碰撞室形成的二级碎片离子质谱数据。所述代谢物定性列表是指包含代谢物相应数据信息的列表。
在上述步骤2)中，所述按数据矩阵总打分原则确定代谢物包括以下条件中至少一项：
a1)所述LC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配时，保留LC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥45分的代谢物；
a2)所述GC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配时，保留GC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥50分的代谢物。
所述数据矩阵包含保留时间、一级质谱图的分子离子峰数据、二级质谱图的二级碎片离子数据。所述数据矩阵总打分原则是按数据矩阵中数据匹配情况进行打分，按降序排序，打分依据为软件内嵌匹配算法，越相似，分值越高，准确性越高。还要去除unknown未鉴定的物质。
在上述步骤3)中，所述网格分区是将第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图按成像区域进行网格划分为若干个表达区域，优选为12个表达区域。
在上述步骤3)中，所述标记高表达区域是标记质谱成像图所划分的若干个表达区域，优选为12个表达区域中强度最高的表达区域。
在上述步骤3)中，所述质谱成像图中高表达区域相似原则分组是指当不同质谱成像图的高表达区域一致时，将其分为一组。即视为质谱成像图相似。例如，脑组织样本中，某些代谢物的质谱成像图中均在小脑区域具有高表达，则可分为一组，视为这些质谱成像图相似。
在上述步骤3)中，所述分组个数为每组15-25个质谱成像图，优选为每组20个质谱成像图。
在上述步骤3)中，所述PRM数据采集是扫描同组代谢物的高表达区域的质谱成像图，获得代谢物包含有二级碎片离子(原位二级特征碎片离子)的原位二级质谱图。扫描同组代谢物的高表达区域的质谱成像图时，可以优选其中高表达区域强度最高的质谱成像图。
上述PRM数据采集是指平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring，PRM)，是目前靶向蛋白质组学数据采集的主流方法。其可以对确定的目标物的质荷比(m/z)对应的一级质谱成像分析的质谱成像图进行扫描，获得包含有二级碎片离子(原位二级特征碎片离子)的原位二级质谱图。
上述PRM数据采集扫描各组代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图中高表达区域时，可按照分组结果输入相应的m/z信息。
在一实施例中，所述质谱成像图中高表达区域的面积为2.9-3.1mm*0.9-1.1mm，优选为3mm*1mm。
在上述步骤4)中，所述通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配包括以下条件中至少一项：
b1)若分子式相同且仅有一个保留时间，则保留步骤2)中按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物；
b2)若分子式相同且存在多个保留时间，则分别保留不同保留时间下步骤2)中按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物。
具体来说，保留步骤2)中代谢物定性时匹配打分高的代谢物，例如，针对相同的分子式而言，匹配时可能会对应多个代谢物，但是有的代谢物二级和参考库中的匹配度更高，更准确，所以保留得分更高的代谢物。即保留时间越相近，分值越高。
在上述步骤4)中，所述第三维度定性结果数据的原位二级质谱图中二级碎片离子(原位二级特征碎片离子)与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配，是通过R语言中XCMS程序包对原位二级质谱特征碎片离子与二级碎片离子匹配，保留得分≥0.6的代谢物，确定第三维度定性结果数据与第一维度定性结果数据具有相同质荷比(m/z)的代谢物。所述XCMS程序包为开源的针对LCMS/GCMS数据进行峰识别、峰提取、峰匹配的R语言程序包。
在上述步骤4)中，所述空间代谢组数据库包括有多维注释数据，所述多维注释数据包括组织样品中代谢物的质荷比(m/z)、质谱成像图、加合离子形式、分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图、GC-MS/MS二级碎片质谱图、原位二级质谱图。
本发明第二方面提供一种多维注释的空间代谢组数据库，由上述方法建立。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
1、切片样品制备
取完整鼠脑组织，进行矢状面及冠状面冰冻切片制备，进行连续切片，分为第一切片样品及第二切片样品。切片共计11片，厚度及处置方式如图1所示。其中，第一切片样品包括2、4、5、7、8、10，2、4、8、10厚度为15μm，贴于正电荷防脱玻片上，主要用于冰冻切片的原位二级质谱验证分析；5和7厚度为15μm，贴于正电荷防脱玻片上，主要用于冰冻切片的一级质谱采集和质谱成像。第二切片样品包括1、3、9、11厚度为30μm，存放于EP管中，约1mg，用于组织匀浆进行LC-MS/MS和GC-MS/MS双平台检测分析。6贴于正电荷防脱玻片上，主要用于冰冻切片的HE染色，辅助组织微区结构判断。
2、一级质谱成像分析
取第一切片样品采用原位采集及标准品加标后采集，通过质谱成像系统AFAI-QE进行一级质谱成像分析，获得的第一切片样品中代谢物的质谱成像数据。
一级质谱成像分析的条件为：数据采集用Xcalibur数据采集和处理系统；喷雾电压为0V；传输管电压为0V；扫描极性为正/负离子模式；毛细管温度为350℃；辅助气温度为0℃；扫描模式为全扫描scan；扫描范围为100-1000Da；分辨率为70000。扫描模式采用逐行扫描方式，扫描速度(水平位移速率)为0.2(Vx，mm/s)；相邻两个扫描行之间的步进间距(垂直位移距离)为0.1(Dy，mm)；每一行扫描结束后的延迟时间为7(Dt，ms)；返回到同一行的扫描起点的速度为10mm/s。喷雾点状态条件为：雾化气流量为0.7MPa；喷雾溶剂流速为6μL/min；喷针伸出的长度d2为0.5mm。空间几何参数为：DESI喷针与载玻片之间的夹角α1为50°；离子传输管与载玻片之间的夹角α2为15°；喷针距离载玻片的垂直距离d1为2.0mm；喷雾点距离离子传输管的水平距离d3为2mm；离子传输管下缘距离载玻片距离d4为1mm。
标准品为10μg/mL的生物组织中常见代谢物的相应同位素溶液，溶剂为50％甲醇水溶液。具体来说，如图2所示，取2μL同位素内标标准液分别滴加于鼠脑组织冰冻切片上。根据质谱数据分析，获取不同类别代谢物常见加和离子形式，并根据不同加和离子形式下质谱信号强度及成像图分辨情况选择最优选的加和离子，如下表2所示。
表2
通过自主开发的空间组定性软件《空间代谢组质谱数据定性软件V1.0》(软著编号：2021R11L2143056)进行定性分析，即通过获得的不同采集模式下质谱成像图中离子峰、加合离子形式进行相似比较，确定归属为具有同一分子式的代谢物，并确定代谢物的第一维度定性结果数据，所述第一维度定性结果数据包括有代谢物的质荷比(m/z)、加和离子形式、分子式和质谱成像图。第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图是采用MassImager(V1.0)软件获得。
其中，相似比较的原则遵循以下规则：
1)如图3所示，所述组织样品中相同代谢物相应的分子离子峰与同位素离子峰具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
2)如图4所示，第一切片样品中相同代谢物的不同加合离子形式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
3)如图5a和5b所示，第一切片样品中相同代谢物的不同离子采集模式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
4)如图6所示，在正离子模式下，像素点最高强度≤2000和/或平均强度≤1000的离子不予考虑；在负离子模式下，像素点最高强度≤1000和/或平均强度≤500的离子不予考虑；这些离子容易产生散点或重现性不好的情况。
通过代谢物的第一维度定性结果数据，获得基于一级质谱的定性列表，正离子模式共计定性分子式数量800个，代谢物数量3200个；负离子模式共计定性分子式数量425个，代谢物数量2174个；合并去重后分子式1152个，代谢物数量3499个。
3、LC-MS/MS和GC-MS/MS分析
取第二切片样品进行预处理，具体如编号为1、3、9、11的样品匀浆后，各取1mg，加入60μL甲醇：乙腈＝1：1的提取液，在4℃涡旋混匀1min，以12000rpm离心10min，取50μL上清液，平均分为第一分析样品和第二分析样品。
将25μL的第一分析样品采用Waters I-class超高效液相串联QE高分辨质谱仪组成的液质联用系统通过液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)进行测定，获得LC-MS/MS分析数据。
其中，液相色谱的测定条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm×1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；流动相：水(含0.1wt％甲酸)-乙腈(含0.1wt％甲酸)，其中，A相为：水(含0.1wt％甲酸)，B相为：乙腈(含0.1wt％甲酸)；分析时间为18min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0～2min，A相：B相体积比为95：5-95：5；
2～4min，A相：B相体积比为95：5-70：30；
4～14min，A相：B相体积比为70：30-0：100；
14～16min，A相：B相体积比为0：100-0：100；
16～16.1min，A相：B相体积比为0：100-95：5；
16.1～18min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
质谱的测定条件为：
离子源：电喷雾ESI；电离方式：正负离子检测模式；电喷雾电压(Spray Voltage)：正离子3800V，负离子3200V；毛细管温度(Capillary Temperature)：正离子和负离子均为320℃；探头加热器温度(Probe Heater Temperature)：正离子和负离子均为350℃；保护气流速(Sheath Gas Flow Rate)：正离子和负离子均为40Arb；辅助气流速(Aux gas flowrate)：正离子和负离子均为8Arb；透镜电压(S-lens RF level)：正离子和负离子均为50V；质量数校正范围(Mass range)：正离子和负离子均为100-1000m/z；全质谱分辨率(Full msresolution)：正离子和负离子均为70000；质谱/质谱分辨率(MS/MS resolution)：正离子和负离子均为35000；分步归一化碎裂能(Stepped Normalized Collisional Energy，NCE/stepped NCE)：正离子和负离子均为10，20，40。
将25μL的第二分析样品经离心浓缩干燥器在37℃浓缩2h挥干，加入40μL的15mg/mL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液涡旋震荡2min后，在振荡培养箱中以37℃进行肟化反应90min。将样品取出后再加入25μL的BSTFA(含1％TMCS)衍生化试剂和20μL的正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃反应60min取出样品后，冷却至室温后静置30min，采用Trace 1310/TSQ 9000气质联用仪通过气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)进行测定，获得GC-MS/MS分析数据。
其中，气相色谱的测定条件为：
色谱柱：DB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，柱长×内径×固定相膜厚度，Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)；载气为高纯氮气，载气纯度≥99.999％；载气流速为1.2mL/min；进样口的温度为300℃；进样量为1μL；进样方式：不分流进样，溶剂延迟5min；升温程序为：初始温度为60℃保持0.5min，以8℃/min的速率升温至125℃，再以5℃/min的速率升温至210℃，再以10℃/min的速率升温至270℃，再以20℃/min的速率升温至305℃，保持5min。
质谱的测定条件为：电离方式：电子轰击(EI)离子源；离子源温度：330℃；传输线温度：280℃；电离能量：70eV；扫描方式：全扫描模式(full scan)；质量扫描范围：m/z 50-500。
将LC-MS/MS分析数据中的保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子与标准谱库中相应数据进行匹配，采用QI软件进行定性分析，标准谱库采用HMDB、Metlin或本地自建库中至少一种谱库。
将GC-MS/MS分析数据中的保留时间、一级质谱图的分子离子峰、二级质谱图的二级碎片离子与标准谱库中相应数据进行匹配，采用MS-DIAL软件进行定性分析，标准谱库采用LUG本地自建库。
按数据矩阵总打分原则确定代谢物，并确定代谢物的第二维度定性结果数据，第二维度定性结果数据包括有代谢物的分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图和GC-MS/MS二级碎片质谱图。
数据矩阵总打分原则是按数据矩阵(包含保留时间、一级质谱图的分子离子峰数据、二级质谱图的二级碎片离子数据)中数据匹配情况进行打分，按降序排序，越相似，分值越高，准确性越高。去掉unknown未鉴定的物质后，QI软件保留LC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥45分的物质，共计1100个，部分定性物质情况LC-MS/MS-list如表3所示。
表3LC-MS/MS部分定性物质列表
MS-DIAL软件保留GC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥50分的物质，共计348个代谢物，部分定性物质情况GC-MS/MS-list如表4所示。
表4GC-MS/MS部分定性物质列表
4、确定第三维度定性结果数据
采用MassImager(V1.0)软件获得第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图，将质谱成像图按成像区域进行网格划分为12个表达区域，如图7所示，标记质谱成像图所划分的12个表达区域中强度最高的表达区域作为高表达区域。按照质谱成像图中高表达区域相似原则分组确定同组代谢物的高表达区域的质谱成像图，即当不同质谱成像图的高表达区域一致时，将其分为一组，每组20个质谱成像图。再采用PRM方式进行数据采集，即如图9所示，inclusion list按照已分组信息输入相应的m/z信息，扫描同组代谢物的质荷比(m/z)对应的质谱成像图中高表达区域，面积大小为3mm*1mm，获得代谢物包含有二级碎片离子(原位二级特征碎片离子)的原位二级质谱图作为第三维度定性结果数据，具体内容见图8。
5、建立空间代谢组数据库
通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配，并通过第三维度定性结果数据的原位二级质谱图中二级碎片离子与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配，确定组织样品中各种代谢物后将相应代谢物的第一维度定性结果数据、第二维度定性结果数据、第三维度定性结果数据合并建立空间代谢组数据库。
具体来说，通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配包括：若分子式相同且仅有一个保留时间，则保留按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物。例如，分子式为C4H9N3O2，候选物质为Creatine、Beta-Guanidinopropionic acid、Asparaginamide、N-Propyl-N-nitrosourea等物质，基于LC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配情况，依据保留时间进行打分的标准为≥45分，则保留Creatine这个代谢物。
具体来说，通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配包括：若分子式相同且存在多个保留时间，则分别保留不同保留时间下按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物。例如，分子式为C46H80NO8P，候选物质有PC(38:6)、PC(P-38:6)、PE-NMe(40:6)，而LC-MS/MS分析中该分子式下有三处保留时间，则保留三个保留时间下打分最高的代谢物。
通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较，LC-MS分析中共计可以准确注释基于一级质谱的定性列表分子式400个。在色谱分离过程中有GC-MS/MS对于极性化合物的分离分析由于反相模式下LC-MS/MS分离分析，如Glucose等，是对LC-MS/MS鉴定结果的补充，GC-MS/MS中共计可以注释基于一级质谱的定性列表分子式130个。
如图10所示，通过第三定性结果数据的原位二级质谱图中原位二级特征碎片离子与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配进行验证，通过R语言中XCMS程序包对原位二级质谱特征碎片离子与二级碎片离子匹配，保留得分≥0.6的代谢物，进一步从二级质谱这一维度对代谢物进行精准注释，通过原位二级质谱匹配确定的代谢物共计200个。
最后，基于质谱成像一级定性、GC-MS/MS和LC-MS/MS相邻组织切片匀浆定性以及原位二级质谱定性多个维度的定性结果获得的第一维度定性结果数据、第二维度定性结果数据、第三维度定性结果数据，基于以上流程建立不同组织类型样本的空间代谢组数据库，便于不同组织类型样本基于AFAI-DESI空间成像平台的研究。
该方法建立的不同组织的空间代谢组数据库为国内外首个包含基于一级质谱成像图、高表达区域原位二级验证MSI-MS/MS、相邻连续切片组织匀浆GC-MS/MS、LC-MS/MS双平台定性等多个维度注释信息的高准确度空间代谢组学数据库，其中有代谢物的质荷比(m/z)、如图11a所示质谱成像图、加合离子形式、分子式、保留时间、如图11b所示原位二级质谱图、如图11c所示用于定性匹配的GC-MS/MS二级碎片质谱图、如图11d所示用于定性匹配的LC-MS/MS二级碎片质谱图。
该空间代谢组数据库适用于动物或人体的脑、心、肝、脾、肺、肾脏等不同组织类型的样本空间代谢组分析，该数据库当前库容量为分子式1100+，经GCMS/MS注释的代谢物130个，LCMS/MS注释代谢物400个，按照上述建库方法，可以针对不同类型组织样本对数据库进行扩充。
综上所述，本发明提供的一种多维注释的空间代谢组数据库建立方法，能够确保数据库完整性及准确性，便于不同组织类型样本基于AFAI-DESI空间成像平台的研究。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种空间代谢组数据库建立方法，包括以下步骤：
1）依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据，所述第一维度定性结果数据包括有代谢物的质荷比、加和离子形式、分子式和质谱成像图；
2）依据组织样品的LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据，将LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据中的保留时间、一级质谱图的分子离子峰和二级质谱图的二级碎片离子与标准谱库中相应数据进行匹配，按数据矩阵总打分原则确定代谢物及其第二维度定性结果数据，所述第二维度定性结果数据包括有代谢物的分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图和GC-MS/MS二级碎片质谱图；
3）将步骤1）的第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比对应的质谱成像图进行网格分区后标记高表达区域，按照质谱成像图中高表达区域相似原则分组确定同组代谢物的高表达区域的质谱成像图进行PRM数据采集，获得同组代谢物的第三维度定性结果数据，所述第三维度定性结果数据包括有代谢物的原位二级质谱图；
4）通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配，并通过第三维度定性结果数据的原位二级质谱图中二级碎片离子与第二维度定性结果数据的LC-MS/MS二级碎片质谱图或GC-MS/MS二级碎片质谱图中二级碎片离子匹配，确定组织样品中各种代谢物后将相应代谢物的第一维度定性结果数据、第二维度定性结果数据和第三维度定性结果数据合并建立空间代谢组数据库。
2.根据权利要求1所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，包括以下条件：
A1）步骤1）中，所述组织样品要预先进行切片；
A2）步骤1）中，所述依据组织样品的一级质谱成像数据确定样品基质中的代谢物及其第一维度定性结果数据，是将组织样品采用原位采集及标准品加标后采集，分别进行一级质谱成像分析，通过获得的不同采集模式下质谱成像图中离子峰和加合离子形式进行相似比较，确定归属为具有同一分子式的代谢物，并确定代谢物的第一维度定性结果数据；
A3）在步骤2）中，所述组织样品的LC-MS/MS分析数据和GC-MS/MS分析数据，是将所述组织样品进行预处理后获得的上清液分为第一分析样品和第二分析样品，将第一分析样品采用液相色谱质谱联用法进行测定，获得LC-MS/MS分析数据，将第二分析样品进行再处理后采用气相色谱质谱联用法进行测定，获得GC-MS/MS分析数据；
A4）在步骤2）中，所述按数据矩阵总打分原则确定代谢物包括以下条件中至少一项：
A41）所述LC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配时，保留LC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥45分的代谢物；
A42）所述GC-MS/MS分析数据与标准谱库进行匹配时，保留GC-MS/MS分析数据中数据矩阵总打分≥50分的代谢物。
3.根据权利要求2所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤1）中，包括以下条件：
A21）所述一级质谱成像分析采用质谱成像系统AFAI-QE进行质谱成像分析；
A22）所述相似比较的原则包括以下至少一项：
A221）所述组织样品中相同代谢物相应的分子离子峰与同位素离子峰具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
A222）所述组织样品中相同代谢物的不同加合离子形式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
A223）所述组织样品中相同代谢物的不同离子采集模式具有相同的组织分布特点，质谱成像图高度正相关；
A224）在正离子模式下，像素点最高强度≤2000和/或平均强度≤1000的离子不予考虑；
A225）在负离子模式下，像素点最高强度≤1000和/或平均强度≤500的离子不予考虑。
4.根据权利要求2所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤2）中，包括以下条件：
A31）所述预处理包括：将组织样品匀浆后加入第一提取液涡旋混合，离心，取上清液分为第一分析样品和第二分析样品；
A32）所述再处理包括：将第二分析样品浓缩后加入第二提取液进行第一次涡旋震荡后进行肟化反应，再加入第三提取液进行第二次涡旋震荡后进行加热反应，冷却，静置。
5.根据权利要求4所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，包括以下条件：
A311）所述第一提取液为甲醇与乙腈的混合溶液，所述甲醇与乙腈的体积之比为1:0.9-1.1；
A312）所述组织样品加入的质量与第一提取液加入的体积之比为0.9-1.1:60，mg/μL；
A313）所述涡旋混合的时间为0.5-1.5min，所述涡旋混合的温度为3-5℃；
A314）所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的时间为5-15min；
A321）所述浓缩为离心浓缩干燥器挥干第二分析样品，所述浓缩温度为35-40℃，所述浓缩时间为1-3h；
A322）所述第二提取液为甲氧胺盐酸盐吡啶溶液；
A323）所述第二分析样品与第二提取液加入的体积之比为25:30-50；
A324）所述第一次涡旋震荡的时间为1-3min；
A325）所述肟化反应的反应条件为：反应装置为振荡培养箱；反应温度为35-40℃；反应时间为85-95min；
A326）所述第三提取液为衍生化试剂和正己烷的混合溶液，所述衍生化试剂为含有三甲基氯硅烷的双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺；
A327）所述第二次涡旋震荡的时间为1-3min；
A328）所述加热反应的反应条件为：反应温度为65-75℃；反应时间为55-75min；
A329）所述静置的时间为25-35min。
6.根据权利要求2所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤2）中，所述液相色谱质谱联用法中，
所述液相色谱的测定条件为：
色谱柱：T3色谱柱；柱温：40-50℃；流速：0.30-0.40mL/min；进样量：1-5μL；流动相：含0.05-0.15wt%甲酸的水-含0.05-0.15wt %甲酸的乙腈，其中，A相为：含0.05-0.15wt%甲酸的水，B相为：含0.05-0.15wt %甲酸的乙腈；分析时间为18min；梯度洗脱；
所述质谱的测定条件为：
离子源：电喷雾ESI；电离方式：正负离子检测模式；电喷雾电压：正离子3800V，负离子3200V；毛细管温度：正离子和负离子均为320℃；探头加热器温度：正离子和负离子均为350℃；保护气流速：正离子和负离子均为40Arb；辅助气流速：正离子和负离子均为8Arb；透镜电压：正离子和负离子均为50V；质量数校正范围：正离子和负离子均为100-1000m/z；全质谱分辨率：正离子和负离子均为70000；质谱/质谱分辨率：正离子和负离子均为35000；分步归一化碎裂能：正离子和负离子均为10、20和40。
7.根据权利要求2所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤2）中，所述气相色谱质谱联用法中，所述气相色谱的测定条件为：
色谱柱：DB毛细管色谱柱；载气为高纯氮气，载气纯度≥99.999%；载气流速为1.0-1.5mL/min；进样口的温度为290-310℃；进样量为0.5-2μL；进样方式：不分流进样，溶剂延迟4-6min；升温程序为：初始温度为55-65℃保持0.1-1.0min，以7-9℃/min的速率升温至120-130℃，再以4-6℃/min的速率升温至200-220℃，再以9-11℃/min的速率升温至260-280℃，再以19-21℃/min的速率升温至300-310℃，保持4-6min；
所述质谱的测定条件为：
电离方式：电子轰击离子源；离子源温度：325-325℃；传输线温度：275-285℃；电离能量：70eV；扫描方式：全扫描模式；质量扫描范围：m/z 50-500。
8.根据权利要求1所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤3）中，包括以下条件任一项或多项：
B1）所述网格分区是将第一维度定性结果数据中代谢物的质荷比对应的质谱成像图按成像区域进行网格划分为若干个表达区域；所述标记高表达区域是标记质谱成像图所划分的若干个表达区域中强度最高的表达区域；
B2）所述质谱成像图中高表达区域相似原则分组是指当不同质谱成像图的高表达区域一致时，将其分为一组；
B3）所述PRM数据采集是扫描同组代谢物的高表达区域的质谱成像图，获得代谢物包含有二级碎片离子的原位二级质谱图。
9.根据权利要求1所述的一种空间代谢组数据库建立方法，其特征在于，在步骤4）中，包括以下条件：
C1）所述通过第一维度定性结果数据与第二维度定性结果数据中分子式比较匹配包括以下条件中至少一项：
C11）若分子式相同且仅有一个保留时间，则保留步骤2）中按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物；
C12）若分子式相同且存在多个保留时间，则分别保留不同保留时间下步骤2）中按数据矩阵总打分原则打分高的代谢物；
C2）所述空间代谢组数据库包括有多维注释数据，所述多维注释数据包括组织样品中代谢物的质荷比、质谱成像图、加合离子形式、分子式、保留时间、LC-MS/MS二级碎片质谱图、GC-MS/MS二级碎片质谱图和原位二级质谱图。
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