CN113834879B - 基于spe技术的淫羊藿黄酮成分指纹图谱的建立与应用 - Google Patents

基于spe技术的淫羊藿黄酮成分指纹图谱的建立与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多品种淫羊藿药材的指纹图谱的建立方法，具体是采用SPE小柱对淫羊藿黄酮成分进行分离和富集，再采用HPLC方法建立不同品种淫羊藿黄酮成分的指纹图谱，以及该方法在淫羊藿属植物中的应用。本方法具有简单、可操作性较强的特点，建立的方法可以用于淫羊藿药材质量控制。

Description

基于SPE技术的淫羊藿黄酮成分指纹图谱的建立与应用
技术领域
本发明涉及多品种淫羊藿药材的指纹图谱的建立方法，具体是采用SPE小柱对淫羊藿黄酮成分进行分离和富集，再采用HPLC方法建立不同品种淫羊藿黄酮成分的指纹图谱，以及该方法在淫羊藿属植物中的应用。
背景技术
中药淫羊藿为小檗科淫羊藿属EpimediumL.植物，又名仙灵脾、放杖草，是我国传统补益类中药，应用历史悠久。淫羊藿化学成分复杂且多样，主要以异戊烯基黄酮为主，还包括多糖，木脂素类、苯酚苷类、生物碱类等化学成分。现已被开发成多种复方制剂，如仙灵骨葆系列、益肾灵颗粒等，用来治疗骨质疏松、股骨头坏死、性功能障碍等疾病，临床应用广且具有极大的开发潜力。然而，淫羊藿药材也是历届药典中来源较多的药材之一，2010年版《中国药典》收录了5种基原，分别为淫羊藿E.brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿E.sagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.，朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai，和巫山淫羊藿E.wushanenseT.S.Ying。2015年版药典在2010年版药典基础上将巫山淫羊藿单独作为一个品种。据统计，目前作为中药淫羊藿使用的主要资源种类多达10余种，市场品种混杂，质量也参差不齐，严重影响了用药的安全有效。现有的淫羊藿药材鉴别和质量控制方法存在着特异性、专属性不强的缺点。
基于固相萃取(SolidPhaseExtraction，简称SPE)技术对样品具有富集、分离的优点，本发明将SPE技术用于淫羊藿黄酮成分的分离和富集，在此基础上建立不同品种淫羊藿的黄酮成分指纹图谱，以用于淫羊藿不同品种的鉴定。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对淫羊藿药材的品种鉴定和质量控制一直是其研究与应用的热点和难点。
本发明针对现有的问题提供一种采用SPE技术对淫羊藿黄酮类成分分离和富集，构建淫羊藿不同品种黄酮成分HPLC指纹图谱的方法，可实现不同品种淫羊藿药材的鉴定。
具体而言，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种基于SPE分离富集技术建立不同品种淫羊藿黄酮成分指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集；
步骤2：采用HPLC方法建立淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱。
优选的，其中，所述不同品种的淫羊藿包括淫羊藿，朝鲜淫羊藿，柔毛淫羊藿，箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿，但并不局限于上述品种。
优选的，其中，所述步骤1还包括对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备。
优选的，其中，所述步骤1中对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备包括：称取不同品种淫羊藿样品粉末和第一提取溶剂，超声提取，再称定重量，用第一提取溶剂补足减失的重量，过滤，将所述滤液蒸干再用第二提取溶剂溶解，离心后得到的上清液，即为供试品溶液。
优选的，其中，所述第一提取溶剂和第二提取溶剂甲醇和/或乙醇水溶液；所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：10-200ml，所述淫羊藿样品与第二提取溶剂的质量体积比为1g：50ml-100ml；优选地，所述超声提取的时间为10-60min。
优选的，其中，所述第一提取溶剂为70％(体积百分比)的甲醇水溶液，所述第二提取溶剂为50％(体积百分比)的甲醇溶液，所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：200ml；优选地，所述超声提取的时间为30min；进一步优选超声功率为250W；更进一步优选超声频率为40kHz。
优选的，其中，所述步骤1中采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集包括：采用甲醇或乙腈活化固相萃取柱，再用甲醇或乙醇平衡SPE小柱，将供试品溶液上柱，用洗脱液洗脱，所述洗脱液为甲醇溶液或乙醇溶液，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液；其中，所述洗脱次数优选为1-3次，洗脱方式优选加压或不加压。
优选的，其中，所述活化固相萃取柱采用甲醇，平衡SPE小柱采用55％的甲醇溶液，供试品溶液的量为选取1ml-3ml，优选为2ml；所述第一次洗脱采用40％-60％(体积比)甲醇2-6ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，根据需要选择第二次洗脱情况下，所述第二次洗脱采用70-90％(体积比)甲醇溶液4-6ml作为洗脱溶剂加压洗脱；
优选的，所述第一次洗脱采用55％(体积比)甲醇4ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，所述第二次洗脱采用80％(体积比)甲醇溶液5ml作为洗脱溶剂，加压洗脱，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液。
优选的，其中，所述步骤2中HPLC方法的色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱，所述流动相A为0～0.5％甲酸水溶液(体积百分比)，优选为0.02％-0.2％的甲酸水溶液(体积百分比)，流动相B为乙腈。
优选的，其中，所述洗脱梯度如下所述：
0-4分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B；
4-18分钟，73％→62％流动相A，27％→38％流动相B；
18-22分钟，62％→62％流动相A，38％→38％流动相B；
22-28分钟，62％→50％流动相A，38％→50％流动相B；
22-31.9分钟，50％→25％流动相A，50％→75％流动相B；
31.9-32分钟，25％→73％流动相A，75％→27％流动相B；
32-37分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B。
优选的，其中，所述检测器为PDA检测器，检测波长为210nm-280nm；优选柱温为25℃-40℃，或者优选流速为0.10-0.50ml/min。
优选的，其中，所述的色谱柱的规格为2.1*100mm，1.8μm，柱温为30℃，所述流动相A为0.1％甲酸水(体积百分比)溶液流速为0.20ml/min，检测波长为270nm。
优选的，其中，步骤2中，用HPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
本发明还提供了所述的方法在不同品种淫羊藿药材质量控制方面的应用。
本发明所取得的有益效果是：本发明公开了一种基于SPE分离富集技术的淫羊藿黄酮指纹图谱的方法及其在淫羊藿质量控制中的应用，本方法具有简单、可操作性较强的特点，建立的方法可以用于淫羊藿药材质量控制。
附图说明
图1是实施例1不同体积浓度洗脱溶剂的考察；
图2是实施例1不同洗脱剂加入体积的考察，图中0-5代表0ml-5ml；
图3是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用月旭SPE小柱检测淫羊藿样品；
图4是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用月旭SPE小柱检测巫山淫羊藿样品；
图5是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用AgelaSPE小柱检测淫羊藿样品；
图6是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用AgelaSPE小柱巫山淫羊藿样品；
图7是实施例2朝鲜淫羊藿HPLC指纹图谱；
图8是实施例2淫羊藿HPLC指纹图谱；
图9是实施例2柔毛淫羊藿HPLC指纹图谱；
图10是实施例2箭叶淫羊藿HPLC指纹图谱；
图11是实施例2巫山淫羊藿HPLC指纹图谱；
图12是实施例2朝鲜淫羊藿对照色谱图(2：朝霍定A；4：朝霍定B；5：朝霍定C；6：淫羊藿苷；7：朝霍苷丙；8：Caohuoside E；9:Caohuoside A；10:Epimedin K；11:宝藿苷VII；12：箭藿苷B；13：2”-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ；14：宝藿苷I)；
图13是实施例2淫羊藿对照色谱图(1：朝霍定A1；2：朝霍定A；4：朝霍定B；5：朝霍定C；6：淫羊藿苷；11:宝藿苷VII；12：箭藿苷B；13：2”-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ；14：宝藿苷I)；
图14是实施例2柔毛淫羊藿对照色谱图(2：朝霍定A；4：朝霍定B；5：朝霍定C；6：淫羊藿苷；11:宝藿苷VII；12：箭藿苷B；13：2”-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ；14：宝藿苷I)；
图15是实施例2箭叶淫羊藿对照色谱图(1：朝霍定A1；3：朝霍定B1；5：朝霍定C；6：淫羊藿苷；11:宝藿苷VII；12：箭藿苷B；13：2”-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ；14：宝藿苷I)；
图16是实施例2巫山淫羊藿对照色谱图(1：朝霍定A1；2：朝霍定A；4：朝霍定B；5：朝霍定C；6：淫羊藿苷；13：2”-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ)；
图17是实施例2朝鲜淫羊藿的相似度图；
图18是实施例2箭叶淫羊藿的相似度图；
图19是实施例2柔毛淫羊藿的相似度图；
图20是实施例2淫羊藿的相似度图；
图21是实施例2巫山淫羊藿的相似度图。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种基于SPE分离富集技术建立不同品种淫羊藿黄酮成分指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集；
步骤2：采用HPLC方法建立淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱。
优选的，其中，所述不同品种的淫羊藿包括淫羊藿，朝鲜淫羊藿，柔毛淫羊藿，箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿，但并不局限于上述品种。
优选的，其中，所述步骤1还包括对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备。
优选的，其中，所述步骤1中对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备包括：称取不同品种淫羊藿样品粉末和第一提取溶剂，超声提取，再称定重量，用第一提取溶剂补足减失的重量，过滤，将所述滤液蒸干再用第二提取溶剂溶解，离心后得到的上清液，即为供试品溶液。
优选的，其中，所述第一提取溶剂和第二提取溶剂甲醇和/或乙醇水溶液；所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：10-200ml，所述淫羊藿样品与第二提取溶剂的质量体积比为1g：50ml-100ml；优选地，所述超声提取的时间为10-60min。
优选的，其中，所述第一提取溶剂为70％(体积百分比)的甲醇水溶液，所述第二提取溶剂为50％(体积百分比)的甲醇溶液，所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：200ml；优选地，所述超声提取的时间为30min；进一步优选超声功率为250W；更进一步优选超声频率为40kHz。
优选的，其中，所述步骤1中采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集包括：采用甲醇或乙腈活化固相萃取柱，再用甲醇或乙醇平衡SPE小柱，将供试品溶液上柱，用洗脱液洗脱，所述洗脱液为甲醇溶液或乙醇溶液，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液；其中，所述洗脱次数优选为1-3次，洗脱方式优选加压或不加压。
前期通过对色谱峰的紫外吸收光谱进行分析，我们发现不同品种淫羊藿药材的指纹图谱可以划分为1区和2区,1区主要为极性较大的、含量甚微的酚酸、生物碱、普通黄酮类化合物；2区主要为极性相对较小、含量较为丰富、研究较多的异戊烯基黄酮类苷成分。所以本研究的洗脱次数为2次。前期考察洗脱方法时，第一次洗脱溶液考察了30％甲醇，40％甲醇，50％甲醇，55％甲醇和60％甲醇，洗脱体积考察了1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的洗脱方式，还考察了加压和不加压洗脱方式。发现采用55％甲醇4ml，不加压的方式可以较好的洗脱一区部位，而使二区部位几乎不被洗脱下来。二区部位的洗脱溶液考察了70％甲醇，80％甲醇，90％甲醇，洗脱体积考察了4ml、5ml和6ml，洗脱方式考察了加压和不加压，发现采用5ml80％甲醇，加压或者不加压都可以完全洗脱二区部位，但是为了节省时间，提高效率，采用加压的洗脱方式。
优选的，其中，所述活化固相萃取柱采用甲醇，平衡SPE小柱采用55％的甲醇溶液，供试品溶液的量为选取1ml-3ml，优选为2ml；所述第一次洗脱采用40％-60％(体积比)甲醇2-6ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，根据需要选择第二次洗脱情况下，所述第二次洗脱采用70-90％(体积比)甲醇溶液4-6ml作为洗脱溶剂加压洗脱；
优选的，所述第一次洗脱采用55％(体积比)甲醇4ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，所述第二次洗脱采用80％(体积比)甲醇溶液5ml作为洗脱溶剂，加压洗脱，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液。
优选的，其中，所述步骤2中HPLC方法的色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱，所述流动相A为0～0.5％甲酸水溶液(体积百分比)，优选为0.02％-0.2％的甲酸水溶液(体积百分比)，流动相B为乙腈。
优选的，其中，所述洗脱梯度如下所述：
0-4分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B；
4-18分钟，73％→62％流动相A，27％→38％流动相B；
18-22分钟，62％→62％流动相A，38％→38％流动相B；
22-28分钟，62％→50％流动相A，38％→50％流动相B；
22-31.9分钟，50％→25％流动相A，50％→75％流动相B；
31.9-32分钟，25％→73％流动相A，75％→27％流动相B；
32-37分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B。
优选的，其中，所述检测器为PDA检测器，检测波长为210nm-280nm；优选柱温为25℃-40℃，或者优选流速为0.10-0.50ml/min。
优选的，其中，所述的色谱柱的规格为2.1*100mm，1.8μm，柱温为30℃，所述流动相A为0.1％甲酸水(体积百分比)溶液流速为0.20ml/min，检测波长为270nm。
优选的，其中，步骤2中，用HPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
本发明还提供了所述的方法在不同品种淫羊藿药材质量控制方面的应用。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。
实施例所用的朝藿定C(批号111780-201503，HPLC≥95.5％)，淫羊藿苷(批号110737-201516，HPLC≥94.2％)，均购自中国食品药品检定研究院；朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、箭藿苷B,HPLC≥98％，购自上海历鼎生物技术有限公司；宝藿苷V(批号DST190925-083)，山奈苷(批号DST190907-003)，朝霍定E(批号DST191009-172)，宝藿苷VII(批号DST190806-084)，朝霍定K(批号DST191010-173)，淫羊藿新苷A(批号DST190916-093),HPLC≥98％，均购自成都徳斯特生物技术有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为超纯水,其余试剂均为分析纯。所用的仪器见表1，淫羊藿药材信息见表2。
所用的淫羊藿药材见表2。
表1实施例所用的仪器
表2 82个批次的淫羊藿信息
实施例1：洗脱方式及SPE小柱的考察
1.供试品溶液的制备：
取淫羊藿样品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。所得的滤液蒸干，加50％甲醇3ml溶解，离心，得上清液，即为供试品溶液。
2.色谱条件
Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm，1.8μm，Waters，Milford，MA，USA)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为0.20ml/min，检测波长为270nm。
表3色谱洗脱梯度
3.固相萃取条件的考察
3.1活化/平衡
先用5ml甲醇活化SPE小柱，再用10ml55％甲醇平衡。
3.2上样
将1项下所制得的供试品溶液转移2ml上SPE小柱。
3.3洗脱条件的考察
3.3.1洗脱溶剂的考察
按照1项下方法制备供试品溶液，上已经活化平衡好的小柱，然后用5ml不同体积浓度的甲醇溶液(30％甲醇，40％甲醇，50％甲醇，60％甲醇)洗脱，分别收集洗脱液，进行HPLC检测，色谱图见图1；图1是实施例1不同体积浓度洗脱溶剂的考察。
按照1项下方法制备供试品溶液，上已经活化平衡好的小柱，然后用不同毫升数的55体积浓度％的甲醇溶液(0ml，1ml，2ml，3ml,4ml,5ml)洗脱，分别收集洗脱液，进行HPLC检测，色谱图见图2；图2是实施例1不同洗脱剂加入体积的考察，图中0-5代表0ml-5ml。
3.3.2洗脱方式及SPE小柱的考察
按照1项下方法制备供试品溶液，分别上已经活化平衡好的月旭SPE小柱及AgelaSPE小柱，然后分别用55％甲醇溶液5ml/6ml洗脱，收集洗脱液，洗脱时采用加压或者不加压两种方式，对收集的洗脱液进行HPLC检测，色谱图见图3-图6，图3是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用月旭SPE小柱检测淫羊藿样品；图4是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用月旭SPE小柱检测巫山淫羊藿样品；图5是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用Agela SPE小柱检测淫羊藿样品；图6是实施例1不同洗脱方式及不同SPE小柱的考察，采用Agela SPE小柱巫山淫羊藿样品。
3.4考察结果
先用洗脱剂优选55％甲醇溶液4ml不加压洗脱，然后优选80％甲醇溶液5ml作为洗脱溶剂，加压洗脱，收集此部分洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液。
实施例2：对淫羊藿黄酮成分的分离和富集及指纹图谱的建立
1.对照品溶液及供试品溶液的制备
1.1对照品溶液的制备：
取对照品朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，宝藿苷VII，朝霍定E，朝霍定K，宝藿苷I适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含40、50、50、60、60、30、50、50、50、50和50ug的溶液，即得。
1.2供试品溶液的制备：
取样品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤。所得的滤液蒸干，加50％甲醇3ml溶解，离心，得上清液，即为供试品溶液。
2.固相萃取和色谱条件
2.1固相萃取条件：
2.1.1活化/平衡：先用5ml甲醇活化SPE小柱，再用10ml55％甲醇平衡。
2.1.2上样：将2.2项下所制得的供试品溶液转移2ml上SPE小柱。
2.1.3洗脱：首先用4ml55％甲醇洗脱，弃去洗脱液；然后用5ml80％甲醇洗脱，收集洗脱液用0.45um滤膜过滤，即得。
2.2色谱条件：
Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm,Waters,Milford,MA,USA)；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按实施例1中表3中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为0.20ml/min，检测波长为270nm。
3.方法学考察
以确定的高效液相色谱条件和供试品溶液的制备方法(见1.2和2)，对建立的分析方法进行方法学考察。
3.1精密度
取同一批次朝鲜淫羊藿样品粉末(编号S7)和同一批次箭叶淫羊藿样品粉末(编号S33)，分别照2.2和3项下制备待测溶液，并分别按照3.2项下色谱条件连续进样6次检测，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算朝鲜淫羊藿8个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。以4号峰为参照峰，计算箭叶淫羊藿6个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，见表4-7。
表4朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
共有峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 4.944 4.937 4.951 4.943 4.958 4.97 0.12％
2 5.621 5.615 5.622 5.614 5.632 5.646 0.08％
3 6.367 6.361 6.367 6.363 6.384 6.397 0.06％
4 7.651 7.648 7.646 7.65 7.671 7.679 0.00％
5 14.016 14.02 14.027 14.044 14.051 14.065 0.09％
6 19.058 19.059 19.064 19.082 19.1 19.098 0.10％
7 19.438 19.443 19.448 19.462 19.479 19.479 0.11％
8 28.259 28.271 28.269 28.295 28.298 28.305 0.14％
表5朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对峰面积数据
表6箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 3.993 3.979 3.991 4.049 4.031 4.029 0.44％
2 5.019 5.013 5.021 5.078 5.051 5.049 0.24％
3 6.174 6.156 6.17 6.221 6.196 6.194 0.11％
4 7.457 7.441 7.454 7.502 7.469 7.475 0.00％
5 22.192 22.197 22.194 22.2 22.178 22.171 0.30％
6 28.146 28.139 28.138 28.136 28.127 28.122 0.30％
表7箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对峰面积数据
峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 9038081 9061907 9042409 9044726 9067196 9076429 0.07％
2 701724 704561 702392 699726 704747 701393 0.22％
3 5303063 5317746 5304135 5306591 5319180 5321392 0.03％
4 2418404 2426033 2418437 2420348 2425748 2425221 0.00％
5 2492586 2502173 2496611 2501350 2505832 2505432 0.11％
6 558994 558585 559111 560153 560169 562110 0.22％
结果显示朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿的共有峰的相对保留时间RSD均小于0.50％，相对峰面积RSD均小于1.0％，表明说明方法的精密度良好，符合指纹图谱的要求。
3.2稳定性
取同一批次朝鲜淫羊藿样品粉末(编号S7)和同一批次箭叶淫羊藿样品粉末(编号S33)，分别照2.2和3项下制备待测溶液，并分别按照3.2项下色谱条件分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h进样检测，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算朝鲜淫羊藿8个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。以4号峰为参照峰，计算箭叶淫羊藿6个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，见表8-11。
表8朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
峰 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 24h 36h 48h RSD
1 4.944 4.937 4.951 4.943 4.958 4.97 5.027 4.966 4.978 4.986 0.21
2 5.621 5.615 5.622 5.614 5.632 5.646 5.707 5.637 5.653 5.667 0.18
3 6.367 6.361 6.369 6.363 6.384 6.397 6.454 6.392 6.402 6.422 0.12
4 7.651 7.648 7.646 7.65 7.671 7.679 7.729 7.68 7.685 7.705 0
5 14.016 14.02 14.027 14.044 14.051 14.065 14.077 14.066 14.066 14.084 0.22
6 19.058 19.059 19.064 19.082 19.1 19.098 19.108 19.111 19.106 19.105 0.12
7 19.438 19.443 19.448 19.462 19.479 19.479 19.492 19.491 19.492 19.488 0.27
8 28.259 28.271 28.269 28.295 28.298 28.305 28.321 28.316 28.312 28.324 0.29
表9朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对峰面积数据
表10箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
峰 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 24h 36h 48h RSD
1 4.029 4.079 4.078 4.075 4.117 4.159 4.127 4.162 4.167 4.177 0.57％
2 5.049 5.096 5.093 5.104 5.154 5.192 5.162 5.195 5.201 5.208 0.47％
3 6.194 6.199 6.22 6.308 6.316 6.357 6.327 6.36 6.366 6.371 0.59％
4 7.475 7.495 7.511 7.506 7.525 7.576 7.602 7.609 7.618 7.62 0.00％
5 22.171 22.195 22.209 22.21 22.216 22.239 22.23 22.241 22.252 22.264 0.63％
6 28.172 28.195 28.229 28.239 28.234 28.221 28.241 28.249 28.252 28.245 0.69％
表11箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对峰面积数据
峰 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 24h 36h 48h RSD
1 9076429 9085406 9083577 9063962 9018117 8978838 8992064 8985500 8957847 8968179 0.37％
2 701393 705311 709980 694369 706912 708606 706742 710604 711439 718663 1.07％
3 5321392 5330273 5328760 5309578 5317973 5297726 5304113 5298571 5282047 5292602 0.08％
4 2425221 2429214 2430509 2423528 2428706 2419627 2422334 2417335 2411374 2413887 0.00％
5 2505432 2509055 2509464 2494396 2486620 2478227 2482415 2476399 2472329 2476150 0.38％
6 562110 560116 562909 556505 558129 555261 558075 556050 553313 554095 0.37％
结果显示朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿的共有峰的相对保留时间RSD均小于0.70％，相对峰面积RSD均小于3.0％，表明供试品溶液在48小时内稳定性良好。
3.3重复性
取同一批次朝鲜淫羊藿样品粉末(编号S7)和同一批次箭叶淫羊藿样品粉末(编号S33)，分别照2.2和3.1项下各制备待测溶液6份，并分别按照3.2项下色谱条件进样检测，记录色谱图。以4号峰为参照峰，计算朝鲜淫羊藿8个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。以4号峰为参照峰，计算箭叶淫羊藿6个共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，见表12-15。
表12朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 4.95 5.019 5.005 4.962 4.985 5.015 0.18％
2 5.627 5.709 5.682 5.64 5.663 5.694 0.14％
3 6.379 6.475 6.436 6.392 6.414 6.448 0.14％
4 7.671 7.759 7.73 7.689 7.708 7.738 0.00％
5 14.052 14.115 14.097 14.093 14.097 14.112 0.30％
6 19.111 19.15 19.132 19.113 19.134 19.142 0.35％
7 19.496 19.534 19.511 19.495 19.514 19.521 0.35％
8 28.315 28.359 28.351 28.348 28.341 28.351 0.38％
表13朝鲜淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 678864 664251 707950 645833 643719 681028 3.5％
2 771636 726557 784529 705398 719397 754502 2.7％
3 450187 422111 458260 415773 429943 433543 1.6％
4 3329404 3042949 3287567 3053763 3219317 3156353 0.00％
5 598017 521623 566373 513586 573017 539988 2.5％
6 880340 861884 922387 864963 901232 870196 2.6％
7 277896 276004 300647 280745 297074 285406 3.7％
8 280208 255008 290001 256617 275492 269972 1.9％
表14箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对保留时间数据
表15箭叶淫羊藿样品共有色谱峰的相对峰面积数据
峰 1 2 3 4 5 6 RSD
1 9273887 8994880 8999491 9269229 10067741 9015322 1.6％
2 757936 702855 694683 712338 765738 706050 2.85
3 5998653 5434289 5374094 5553399 6012204 5465577 3.4％
4 2531925 2502642 2406081 2487291 2773864 2489030 0.00％
5 2485244 2302124 2401114 2480520 2558805 2391797 3.7％
6 565101 542083 550245 546241 588705 568479 3.0％
结果显示朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿的共有峰的相对保留时间RSD均小于0.50％，相对峰面积RSD均小于4.0％，表明该方法重复性良好。
4.指纹图谱的建立及分析
4.1指纹图谱的建立
取S1-S82批次淫羊藿样品，照1.1,1.2和2项下制备相应的对照品和供试品溶液；按2.2色谱方法记录色谱图。运用Empower 3导出色谱数据(*.cdf格式文件)，并将其导入国家药典委员会2012年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，进行指纹图谱匹配，匹配图见图7-11，图7为朝鲜淫羊藿HPLC指纹图谱；图8是淫羊藿HPLC指纹图谱；图9是柔毛淫羊藿HPLC指纹图谱；图10是箭叶淫羊藿HPLC指纹图谱；图11是巫山淫羊藿HPLC指纹图谱。对照谱生成方法为中位数，时间窗宽度0.20，生成的对照指纹图谱见图12-16，图12是朝鲜淫羊藿对照色谱图；图13是淫羊藿对照色谱图；图14是实施例2柔毛淫羊藿对照色谱图；图15是箭叶淫羊藿对照色谱图；图16是巫山淫羊藿对照色谱图。
4.2相似度结果
不同淫羊藿样品的相似度结果见图17-21，图17是朝鲜淫羊藿的相似度图；图18是箭叶淫羊藿的相似度图；图19是柔毛淫羊藿的相似度图；图20是淫羊藿的相似度图；图21是巫山淫羊藿的相似度图。
结果表明，26批朝鲜淫羊藿、13批箭叶淫羊藿、10批柔毛淫羊藿、18批淫羊藿和15批巫山淫羊藿的色谱图相似度均各大于0.89，表明这5个品种的各批次样品之间HPLC图谱有良好的相似性。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种基于SPE分离富集技术建立不同品种淫羊藿黄酮成分指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集；
步骤2：采用UPLC方法建立淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱；
其中，所述步骤1还包括对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备，所述步骤1中对不同品种淫羊藿供试品溶液的制备包括：称取不同品种淫羊藿样品粉末和第一提取溶剂，超声提取，再称定重量，用第一提取溶剂补足减失的重量，过滤，将滤液蒸干再用第二提取溶剂溶解，离心后得到的上清液，即为供试品溶液；
所述第一提取溶剂和第二提取溶剂是甲醇水溶液和/或乙醇水溶液；
所述步骤1中采用SPE对不同品种淫羊藿黄酮成分进行分离和富集包括：采用甲醇或乙腈活化固相萃取柱，再用甲醇水溶液平衡SPE小柱，将供试品溶液上柱，用洗脱液洗脱，所述洗脱液为甲醇水溶液，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液；其中，洗脱次数为2次，所述固相萃取柱为C18固相萃取柱；
供试品溶液的量为选取1ml-3ml，第一次洗脱采用40％-60％甲醇水溶液2-6ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，第二次洗脱采用70-90％甲醇水溶液4-6ml作为洗脱溶剂加压洗脱；
所述步骤2中UPLC方法的色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，流动相A为0.02～0.5％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下所述：
0-4分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B；
4-18分钟，73％→62％流动相A，27％→38％流动相B；
18-22分钟，62％→62％流动相A，38％→38％流动相B；
22-28分钟，62％→50％流动相A，38％→50％流动相B；
28-31.9分钟，50％→25％流动相A，50％→75％流动相B；
31.9-32分钟，25％→73％流动相A，75％→27％流动相B；
32-37分钟，73％→73％流动相A，27％→27％流动相B。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述不同品种的淫羊藿包括朝鲜淫羊藿，柔毛淫羊藿，箭叶淫羊藿和巫山淫羊藿中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：10-200ml，所述淫羊藿样品与第二提取溶剂的质量体积比为1g：50ml-100ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述超声提取的时间为10-60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一提取溶剂为70％的甲醇水溶液，所述第二提取溶剂为50％的甲醇水溶液，所述淫羊藿样品与第一提取溶剂的质量体积比为1g：200ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述超声提取的时间为30min。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，超声功率为250W。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，超声频率为40kHz。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活化固相萃取柱采用甲醇，平衡SPE小柱采用55％的甲醇水溶液，供试品溶液的量选取2ml。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一次洗脱采用55％甲醇水溶液4ml作为洗脱溶剂不加压洗脱，所述第二次洗脱采用80％甲醇水溶液5ml作为洗脱溶剂，加压洗脱，最后收集洗脱液即得到富含淫羊藿黄酮成分的溶液。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述流动相A为0.02％-0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，检测器为PDA检测器，检测波长为210nm-280nm。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，柱温为25℃-40℃。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，流速为0.10-0.50ml/min。
15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述的色谱柱的规格为2.1×100mm，1.8μm，柱温为30℃，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液，流速为0.20ml/min，检测波长为270nm。
16.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，步骤2中，用UPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤2中，用UPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
18.根据权利要求13所述的方法，其中，步骤2中，用UPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，步骤2中，用UPLC方法检测步骤1中得到的富含淫羊藿黄酮成分的溶液，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，得到淫羊藿黄酮成分对照指纹图谱，最后利用UPLC-Q-TOF-MS采集质谱数据，并通过对照品比对参考文献对共有峰进行鉴定。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法用于对不同品种淫羊藿药材质量进行控制。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1991360A (zh) * 2005-12-28 2007-07-04 劲牌有限公司 用中药指纹图谱技术鉴别朝鲜淫羊藿药材的方法
CN104749306A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 广州白云山陈李济药厂有限公司 一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法
CN104820049A (zh) * 2015-03-17 2015-08-05 中山市中智药业集团有限公司 淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法
CN106596800A (zh) * 2017-02-09 2017-04-26 重庆市中药研究院 一种基于uplc/q‑tof的淫羊藿多种黄酮成分快速测定方法
CN110672747A (zh) * 2019-10-23 2020-01-10 劲牌生物医药有限公司 淫羊藿成分的检测方法和鉴别淫羊藿品种的方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1991360A (zh) * 2005-12-28 2007-07-04 劲牌有限公司 用中药指纹图谱技术鉴别朝鲜淫羊藿药材的方法
CN104749306A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 广州白云山陈李济药厂有限公司 一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法
CN104820049A (zh) * 2015-03-17 2015-08-05 中山市中智药业集团有限公司 淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法
CN106596800A (zh) * 2017-02-09 2017-04-26 重庆市中药研究院 一种基于uplc/q‑tof的淫羊藿多种黄酮成分快速测定方法
CN110672747A (zh) * 2019-10-23 2020-01-10 劲牌生物医药有限公司 淫羊藿成分的检测方法和鉴别淫羊藿品种的方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
崔莉 等.中压制备系统联合自动纯化系统制备淫羊藿中的朝藿定A、B、C对照品.南京中医药大学学报.2013,29(1),60-62. *
李英 等.淫羊藿中黄酮类成分研究.中草药.2015,46(14),2057-2061. *
王丽霞 等.淫羊藿属药材反相高效液相色谱指纹图谱及质量评估研究 .化学学报.2006,64(6),551-555 . *
袁航 等.淫羊藿的化学成分及质量控制研究进展.中草药.2014,45(24),3630-3640. *
裴利宽 等.淫羊藿属主要资源种类的HPLC指纹图谱特征和种类鉴定.中国中药杂志.2008,33(14),1662-1668. *

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