CN104784291A - 一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物及其制备方法和应用，属于中草药提取技术领域。该方法包括以下步骤：(1)取蓬子菜全草粗粉，用60～80％的乙醇进行超声提取和回流提取，将得到的提取液过滤，滤液经减压回收乙醇后，得浸膏；(2)将浸膏用8～12％的乙醇溶解后，上样到大孔吸附树脂柱进行静置，先用15～25％的乙醇洗去杂质，再用50～70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，低温干燥，即得。本发明的制备方法具有工艺简单、周期短和产率高等优点。所制得的蓬子菜提取物中主要为总黄酮类化合物，含量高达57％以上，且总黄酮类化合物中主要为木犀草苷，可刺激小鼠子宫发育，促进其体重增加，提高雌激素水平。

Description

一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中草药有效成分提取物，尤其涉及一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物及其制备方法，本发明还涉及该蓬子菜提取物在制备提高雌激素水平和刺激子宫发育的药物中的应用，属于中草药提取技术领域。

背景技术

许多疾病的发生与体内雌激素水平密切相关，如骨质疏松、心血管疾病等，随着妇女进入绝经期，这些疾病的发病风险也明显增加。补充外源性激素的替代疗法虽可减轻围绝经期的临床症状，降低骨质疏松、心血管疾病的发病风险，但长期应用外源性雌激素亦增加乳腺癌、子宫内膜癌的发生率，使激素替代疗法的广泛应用受到了限制。植物雌激素是从天然植物中提取的结构与内源性雌激素相似的一系列化合物，现代药理研究及流行病学资料表明，植物雌激素对体内的雌激素水平具有双向调节作用，可参与多种疾病的预防和治疗，尤其是与雌激素水平相关的乳腺癌、前列腺癌、更年期综合征及心血管疾病等，且副作用小，日益受到研究者们的关注。随着研究的不断深入，寻找具有雌激素样药理作用的新的药用植物及其有效部位成为解决骨质疏松、心血管疾病等雌激素相关性疾病的有效途径。

蓬子菜(Galium verum L.)为茜草科(Rubiaceae)拉拉藤(Galium)属植物蓬子菜的干燥全草。始载于《救荒本草》，其性温，味苦、甘，具有清热解毒、利胆、利湿止痒、行血的功效，既可内服也可外用，民间用其治疗肝炎、跌打损伤、妇女血气痛、荨麻疹、稻田皮炎等。蓬子菜不同溶媒提取物分离得到的化学成分主要包括黄酮、蒽醌、环烯醚萜、苯丙素、有机酸、三萜及挥发油类，其中以黄酮、蒽醌和环烯醚萜类化合物较多。目前对蓬子菜的现代药理研究主要集中在抗肿瘤和抗氧化损伤的研究上，研究表明蓬子菜具有显著抑制人肝癌细胞HepG2增殖、诱导其凋亡的作用；对过氧化氢损伤的人脐静脉内皮细胞的亦具有良好保护作用，未见有关雌激素药理作用的研究和相关提取物制备方法的介绍。目前有关蓬子菜总黄酮的提取，有报道采用水提后醇提，碱溶酸沉，并采用有机溶剂萃取后再上树脂柱的方法，虽然得到总黄酮含量较高，但黄酮苷类成分在碱溶酸沉过程中容易发生水解而被破坏，同时大量有机溶剂的引入也是不利因素之一。本发明制备方法的效果是：常规提取后，采用体积百分比为8～12％乙醇溶解浸膏上样，体积百分比为15～25％乙醇洗脱除杂，改善水洗脱除杂效果差的缺点，可充分去除杂质，且保证有效部位的收率及含量，该提取精制方法工艺简单，制备时间短，树脂柱重复利用率高。制得的蓬子菜雌激素样药理作用提取物中主要为黄酮类化合物，且有效部位中总黄酮类化合物含量达57％以上，总黄酮类化合物中主要为木犀草苷。蓬子菜雌激素样药理作用提取物可刺激小鼠子宫发育，促进其体重增加，提高雌激素水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、提取率高和安全性高的具有雌激素活性的蓬子菜提取物的制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取蓬子菜全草粗粉，用体积百分比为60～80％的乙醇进行超声提取和回流提取，将得到的提取液过滤，滤液经减压回收乙醇后，得浸膏；

(2)将浸膏用体积百分比为8～12％的乙醇溶解后，上样到大孔吸附树脂柱进行静置，先用体积百分比为15～25％的乙醇洗去杂质，再用体积百分比为50～70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，低温干燥，即得一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物。

在本发明中，优选的，步骤(1)中所述超声提取的时间为20～40min，使细胞充分破碎；所述回流提取为用体积百分比为60～80％的乙醇溶液提取两次，每次提取时间为1～2h；所述减压回收乙醇为50℃下减压回收乙醇。

在本发明中，优选的，所述回流提取的第一次提取中乙醇用量为10倍重量的蓬子菜全草粗粉，第二次提取中乙醇用量为8倍重量的蓬子菜全草粗粉。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述静置的时间为2～4h；所述洗去杂质和洗脱的流速均为每小时1.0～1.5倍柱体积；所述洗去杂质和洗脱的时间均为1～2h；所述减压回收乙醇为50℃下减压回收乙醇。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述大孔吸附树脂在上样前，树脂常规处理后，预先用体积百分比为8～12％的乙醇洗脱2倍柱体积。

在本发明中，优选的，蓬子菜全草粗粉与树脂的质量比为1:2～1:4。

进一步的，本发明提供了由上述制备方法制备得到的具有雌激素活性的蓬子菜提取物，其特征在于，所述蓬子菜提取物中总黄酮类化合物含量占总提取物总重量的57％以上；其中，所述的总黄酮类化合物中主要为木犀草苷。

蓬子菜具有清热解毒、利胆、利湿止痒、行血的功效。民间用其治疗肝炎、跌打损伤、妇女血气痛、荨麻疹、稻田皮炎等。

经小鼠子宫增重法实验证明：本发明制得的蓬子菜雌激素样药理作用提取物可刺激小鼠子宫发育，促进其体重增加；雌激素检测结果表明：本发明制得的蓬子菜雌激素样药理作用提取物可提高雌激素水平，显示其具有良好的雌激素作用。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的蓬子菜提取物在制备提高雌激素水平和刺激子宫发育的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的制备方法除杂效果好，制备工艺简单，制备时间短，树脂柱重复利用率高，产率高，产品含量高。制备得到的蓬子菜雌激素样药理作用提取物中含有大量的黄酮类化合物，有效部位中总黄酮类化合物含量达57％以上，且总黄酮类化合物中主要为木犀草苷。小鼠子宫增重法实验表明，使用本发明制得的蓬子菜提取物可刺激小鼠子宫发育，促进其体重增加。雌激素检测结果表明，本发明的蓬子菜雌激素样药理作用提取物可提高雌激素水平，显示其具有良好的雌激素作用。

附图说明

图1为木犀草苷标准品的高效液相色谱图；

图2为采用本发明制备方法制备得到的具有雌激素活性的蓬子菜提取物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

取蓬子菜粗粉1kg，先以60％(v/v)乙醇超声20min，使细胞充分破碎，然后用60％(v/v)乙醇回流提取两次，第一次回流提取乙醇用量为10倍重量的蓬子菜全草粗粉，第二次回流提取乙醇用量为8倍重量的蓬子菜全草粗粉，回流提取时间每次1h。趁热过滤，合并滤液，50℃减压回收乙醇至浸膏。AB-8大孔树脂按说明书要求常规处理后，装柱，树脂用量为2kg。树脂柱用8％(v/v)乙醇洗脱2BV后，将上述浸膏用8％(v/v)乙醇溶解，上树脂柱，静置2h。先以15％(v/v)乙醇按1.0BV/h的流速洗脱，洗脱2BV，除杂。继续用50％(v/v)乙醇按1.0BV/h的流速洗脱，收集2BV 50％(v/v)乙醇洗脱液，50℃减压回收乙醇，即得具有雌激素活性的蓬子菜提取物，总黄酮类化合物含量达57.5％。

实施例2

取蓬子菜粗粉2kg，先以70％(v/v)乙醇超声30min，使细胞充分破碎，然后用70％(v/v)乙醇回流提取两次，第一次回流提取乙醇用量为10倍重量的蓬子菜全草粗粉，第二次回流提取乙醇用量为8倍重量的蓬子菜全草粗粉，回流提取时间每次1.5h。趁热过滤，合并滤液，50℃减压回收乙醇至浸膏。AB-8大孔树脂按说明书要求常规处理后，装柱，树脂用量为6kg。树脂柱用10％(v/v)乙醇洗脱2BV后，将上述浸膏用10％(v/v)乙醇溶解，上树脂柱，静置3h。先以20％(v/v)乙醇按1.5BV/h的流速洗脱，洗脱2BV，除杂。继续用60％(v/v)乙醇按1.5BV/h的流速洗脱，收集2BV 60％(v/v)乙醇洗脱液，50℃减压回收乙醇，即得具有雌激素活性的蓬子菜提取物，总黄酮类化合物含量达59.5％。

实施例3

取蓬子菜粗粉3kg，先以80％(v/v)乙醇超声40min，使细胞充分破碎，然后用80％(v/v)乙醇回流提取两次，第一次回流提取乙醇用量为10倍重量的蓬子菜全草粗粉，第二次回流提取乙醇用量为8倍重量的蓬子菜全草粗粉，回流提取时间每次2h。趁热过滤，合并滤液，50℃减压回收乙醇至浸膏。AB-8大孔树脂按说明书要求常规处理后，装柱，树脂用量为12kg。树脂柱用12％(v/v)乙醇洗脱2BV后，将上述浸膏用12％(v/v)乙醇溶解，上树脂柱，静置4h。先以25％(v/v)乙醇按1.2BV/h的流速洗脱，洗脱2BV，除杂。继续用70％(v/v)乙醇按1.2BV/h的流速洗脱，收集2BV 70％(v/v)乙醇洗脱液，50℃减压回收乙醇，即得具有雌激素活性的蓬子菜提取物，总黄酮类化合物含量达58.0％。

将上述实施例制备得到的具有雌激素活性的蓬子菜提取物经高效液相测定，测定结果见图1和图2。从图1和图2中可知：上述实施例制备得到的具有雌激素活性的蓬子菜提取物中主要成分为木犀草苷。

试验例1

通过子宫增重法来比较蓬子菜水提取物、醇提取物、精制醇提取物、己烯雌酚的雌激素生物活性：

(1)蓬子菜水提取物制备方法：蓬子菜药材粗粉加水浸泡30min，第一次水用量为10倍重量的蓬子菜药材粗粉，煎煮40min，第二次水用量为8倍重量的蓬子菜药材粗粉，煎煮30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干。所得浸膏以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(2)蓬子菜醇提取物制备方法：蓬子菜药材粗粉加70％(v/v)乙醇，浸泡30min，第一次乙醇用量为10倍重量的蓬子菜药材粗粉，回流提取1.5h，第二次乙醇用量为8倍重量的蓬子菜药材粗粉，回流提取1h，过滤，合并滤液，50℃减压回收乙醇至浸膏。所得浸膏以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(3)蓬子菜精制醇提取物制备方法：实施例2制得的蓬子菜提取物以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(4)己烯雌酚阳性药液的制备：称取己烯雌酚适量，以0.5％CMC溶液配成1mg·mL^-1己烯雌酚阳性对照液。

(5)给药方法：将小鼠按体重均衡和随机的原则分为5组：空白组、阳性药物组、蓬子菜水提取物组，蓬子菜醇提取物组、蓬子菜精制醇提取物组。空白组给予等体积0.5％CMC溶液；阳性对照组给予阳性药物己烯雌酚，实验组分别给予蓬子菜水提取物、蓬子菜醇提取物和蓬子菜精制醇提取物。灌胃分早、晚2次进行，每次给药0.2mL，均持续给药4天。各组动物于最后一次给药后第2天称重，断颈处死后迅速剖开腹腔，剥离子宫系膜及周围脂肪，切除两侧卵巢，在子宫颈与子宫角的交界部位剪下子宫并立即称重；计算子宫系数及给药前后体重变化率。试验结果见表1和表2.

子宫系数＝子宫湿重/体重×100％

表1不同方法制备的蓬子菜提取物对性未成熟小鼠体重增长速度的影响

注：与空白组比较，P<0.05表示为*。

表1方差分析结果表明，阳性药物与蓬子菜精制醇提取物组样品均可增加性未成熟小鼠体重增长速度，且两者间无显著性差异。

表2不同方法制备的蓬子菜提取物对性未成熟小鼠子宫系数的影响

注：与空白组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

表2方差分析结果表明，阳性药物组与蓬子菜精制醇提取物组样品均可增加性未成熟小鼠子宫系数，且两者间无显著性差异。

通过小鼠子宫增重法试验表明，使用本发明制备方法制得的蓬子菜提取物具有明显增加雌性幼鼠体重，增大子宫系数的作用，并显示其具有良好的雌激素作用。

试验例2

采用ELISA法通过测定小鼠血清中雌激素水平，比较蓬子菜水提取物、醇提取物、精制醇提取物、阳性药物(补佳乐：戊酸雌二醇片)的雌激素生物活性：

(1)蓬子菜水提取物制备方法：蓬子菜药材粗粉加水浸泡30min，第一次水用量为10倍重量的蓬子菜药材粗粉，煎煮40min，第二次水用量为8倍重量的蓬子菜药材粗粉，煎煮30min，过滤，合并滤液，水浴蒸干。所得浸膏以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(2)蓬子菜醇提取物制备方法：蓬子菜药材粗粉加70％(v/v)乙醇，浸泡30min，第一次乙醇用量为10倍重量的蓬子菜药材粗粉，回流提取1.5h，第二次乙醇用量为8倍重量的蓬子菜药材粗粉，回流提取1h，过滤，合并滤液，50℃减压回收乙醇至浸膏。所得浸膏以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(3)蓬子菜精制醇提取物制备方法：实施例2制得的蓬子菜提取物以0.5％CMC溶液溶解，相当于每毫升溶液含生药量1g。

(4)补佳乐阳性药液的制备：称取补佳乐适量，以0.5％CMC溶液配成0.02mg·mL^-1补佳乐阳性对照液。

(5)给药方法：将小鼠按体重均衡和随机的原则分为5组：空白组、阳性药物组、蓬子菜水提取物组，蓬子菜醇提取物组、蓬子菜精制醇提取物组。空白组给予等体积0.5％CMC溶液；阳性对照组给予阳性药物补佳乐，实验组分别给予蓬子菜水提取物、蓬子菜醇提取物和蓬子菜精制醇提取物。灌胃分早、晚2次进行，每次给药0.2mL，均持续给药7天。各组动物于最后一次给药后第2天，眼眶取血，离心取血清，-20℃贮存备用。

(6)小鼠血清雌激素水平的测定

取出冻存血清，采用雌激素检测试剂盒(购自潍坊三维生物工程集团有限公司)，取酶标板，加入不同浓度的标准液100μL，分别加入100μL血清标本于相应反应板孔中。随后每孔均加入50μL酶标液，于37℃孵育60min。洗涤液清洗5次，每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡，37℃避光显色20min后，每孔加入终止液50μL，终止反应。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度，以OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，拟合标准曲线，计算血清样品OD值的对应浓度。试验结果见表3：

表3不同方法制备的蓬子菜对小鼠雌激素水平的影响

注：与空白组比较，P<0.05表示为*，P<0.01表示为**。

表3方差分析结果表明，阳性药物组与各样品组均可提高小鼠雌激素水平，其中阳性药物组、蓬子菜醇提取物组及蓬子菜精制醇提取物组样品对小鼠雌激素水平的提高影响比较显著。

Claims (9)

1.一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取蓬子菜全草粗粉，用体积百分比为60～80％的乙醇进行超声提取和回流提取，将得到的提取液过滤，滤液经减压回收乙醇后，得浸膏；

(2)将浸膏用体积百分比为8～12％的乙醇溶解后，上样到大孔吸附树脂柱进行静置，先用体积百分比为15～25％的乙醇洗去杂质，再用体积百分比为50～70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，低温干燥，即得一种具有雌激素活性的蓬子菜提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述超声提取的时间为20～40min，使细胞充分破碎；所述回流提取为用体积百分比为60～80％的乙醇溶液提取两次，每次提取时间为1～2h；所述减压回收乙醇为50℃下减压回收乙醇。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述回流提取的第一次提取中乙醇用量为10倍重量的蓬子菜全草粗粉，第二次提取中乙醇用量为8倍重量的蓬子菜全草粗粉。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述静置的时间为2～4h；所述洗去杂质和洗脱的流速均为每小时1.0～1.5倍柱体积；所述洗去杂质和洗脱的时间均为1～2h；所述减压回收乙醇为50℃下减压回收乙醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述大孔吸附树脂在上样前，树脂常规处理后，预先用体积百分比为8～12％的乙醇洗脱2倍柱体积。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，蓬子菜全草粗粉与树脂的质量比为1:2～1:4。

8.按照权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的具有雌激素活性的蓬子菜提取物，其特征在于，所述蓬子菜提取物中总黄酮类化合物含量占总提取物总重量的57％以上；其中，所述的总黄酮类化合物中主要为木犀草苷。

9.权利要求8所述的蓬子菜提取物在制备提高雌激素水平和刺激子宫发育的药物中的应用。