CN113509505B - 一种不含小檗碱的葛根芩连提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葛根芩连提取物、制备方法、药物制剂及用途。该葛根芩连提取物为重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草的水提取物，且所述葛根芩连提取物不含小檗碱。本发明提供的葛根芩连提取物既保留了葛根芩连组合物的有效成分，又不含小檗碱，且药效优于含小檗碱的葛根芩连初提物。

Description

一种不含小檗碱的葛根芩连提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种葛根芩连提取物、制备方法、药物制剂及用途，具体涉及一种从葛根、黄芩、黄连和甘草中提取的提取物，该提取物的制备方法，含有该提取物的药物制剂，及该提取物的用途。
背景技术
葛根芩连汤是经典古方之一，来自于东汉末年张仲景所著《伤寒论》第34条：“太阳病，桂枝症，医反下之，利遂不止，脉促者，表未解也，喘而汗出者，葛根黄芩黄连汤主之”。其组成为：葛根半斤，甘草二两(炙)，黄芩三两，黄连三两。葛根芩连汤为表里双解药剂，具备清里解表的疗效。目前，由葛根芩连汤衍生的中成药有葛根芩连丸、葛根芩连片等，临床用于治疗湿热所致腹泻、风热感冒所致头痛。
目前，葛根芩连汤临床还用于糖尿病及代谢综合征方面的预防和治疗。代谢综合征是以肥胖(或超重)、高血糖、高血压、血脂代谢异常等为主要特征的一组临床综合征。医学界认为胰岛素抵抗是其发病的核心，但胰岛素抵抗是多种类型的组织细胞和信号通路共同作用的结果，难以用一种机制高度概括。常规的西医治疗(包括新型胰岛素、降糖药、代谢手术等)采取单一疾病的治疗模式对代谢综合征的各个症状进行不同方式的干预，缺乏整体干预方案，具有局限性。葛根芩连汤作为中药复方，在预防和治疗代谢综合征方面具有优势及应用前景。
小檗碱又称黄连素，来源于方中黄连，是葛根芩连汤及其相关制剂的特征性化学成分，常作为质量控制的指标性成分，也被认为是葛根芩连汤改善治疗胰岛素抵抗和糖尿病的有效成分。
葛根芩连汤及其相关制剂用于代谢综合征治疗，需长期服药。然而，据文献报道，长期服用含黄连制剂，存在一定的安全隐患(赵锡艳，仝小林，赵林华，等.黄连单方及其主要成分不良反应现代研究进展.中国中药杂志，2013，38(2):292-295.)。1978年10月6日新加坡卫生部宣布新加坡禁用黄连及小檗碱的药物。禁用者认为，黄连和小檗碱无论是在孕期服用、或是在哺乳的乳母服用和婴儿直接服用，均会引起婴儿严重黄疸病。2003年6月18日我国国家食品药品监督管理局公布停止使用复方黄连素片和黄连素注射液。黄连素注射液不仅会引起过敏反应，而且易引起呼吸衰竭，心跳骤停、阿斯综合征、过敏性休克。小檗碱及黄连素片的不良反应临床也有报道，种类多样，如皮肤过敏、肝功能损害，特别是一些过敏体质的患者。此外便秘、腹泻等胃肠道反应等发生较普遍。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种不含小檗碱的葛根芩连提取物。发明人惊喜地发现，当不含小檗碱时，该葛根芩连提取物在预防和/或治疗代谢综合征方面仍然效果良好，某些方面甚至优于葛根芩连原方，同时又避免了长期服用小檗碱产生的不良反应。
本发明的另一个目的在于提供一种不含小檗碱的葛根芩连提取物的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供一种药物制剂。
本发明的又一个目的在于提供上述葛根芩连提取物在制备预防和 /或治疗代谢综合征药物中的应用。
本发明采用如下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种葛根芩连提取物，其为重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草的水提取物，且所述葛根芩连提取物不含小檗碱。
小檗碱的分子式为C20H18NO4 +，分子量为336.36。其结构式如下(I)所示：
Figure BDA0003248454360000031
本发明还提供一种葛根芩连提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和甘草，加水提取，得到葛根芩连初提物；
2)除去所述葛根芩连初提物中的小檗碱，得葛根芩连提取物。
上述重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草为传统中药方剂葛根芩连汤的药材组成。本发明中所述葛根芩连组合物是指由葛根、黄芩、黄连和甘草按重量比8:3:3:2的配比经水提取并除去小檗碱后的药物组合物。本发明在不改变原有葛根芩连汤药物组成的基础上，经提取、制备液相色谱分离，选择性去除小檗碱，获得不含小檗碱的葛根芩连提取物。其中，葛根芩连提取液可以采用本领域常规水提取方法制备得到，如煎煮提取、加热回流提取、超声提取、浸泡提取等，只要能够将所述药材中的水溶性化学成分充分提取出来即可，没有特别限制。在加水提取时，葛根、黄芩、黄连和甘草可以各自分别提取，也可以将所述四种药材混合后提取，并优选将所述四种药材混合后提取。葛根、黄芩、黄连和甘草可以以饮片的形式投料，也可以将饮片经过粉碎后进行投料，没有特别限制。在一个实施方式中，这些药材以饮片形式投料，混合后加热回流提取。甘草可以为炮制后的炙甘草，也可以为未经炮制的甘草饮片，优选为炙甘草。炙甘草可通过市售购得，或采用本领域常规的炮制方法如加蜂蜜炮制而得。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤1)中，按重量比8:3:3:2 取葛根、黄芩、黄连和甘草，加水提取，将提取液与药渣分离，得提取液；将提取液减压浓缩，回收溶剂，得到葛根芩连初提物。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤1)中，所述提取为煎煮提取、回流提取、超声提取或浸泡提取。煎煮提取方法适合小批量制备提取液。回流提取通过加水量、提取时间等参数的调整可达到煎煮提取的效果，适合放大工业化生产。浸泡提取能耗较低，操作简单，但提取率低，耗时长。因此本发明优选采用加热回流提取或超声提取，实现高效且最大化地保留葛根芩连组合物中的水溶性化学成分。
根据本发明一个优选的实施方式，步骤1)中，按重量比8:3:3:2 取葛根、黄芩、黄连和甘草，用水加热回流提取1～3次，每次加水量为上述原料总重量的3～20倍，每次提取0.5～3小时，将提取液与药渣分离，得提取液；将所述提取液在85℃以下减压浓缩，回收溶剂，得葛根芩连初提取物。每次加水量为上述原料总重量的3～20倍，优选为3～15倍，更优选为3～12倍。每次提取时间可以为0.5～3小时，优选为1～3小时，更优选为1～2小时。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤2)中，采用制备液相色谱法除去所述葛根芩连初提物中的小檗碱，制备液相色谱以C18硅胶为填充剂；采用紫外检测器检测，检测波长为346nm；采用如下之一的梯度洗脱方式进行洗脱：
(一)流动相A为甲醇，流动相B为水，以10％～100％A进行梯度洗脱60min；
(二)流动相A为乙醇，流动相B为水，以10％～100％A进行梯度洗脱60min；
(三)流动相A为乙腈，流动相B为水，以10％～100％A进行梯度洗脱60min；
(四)流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为乙醇，按如下梯度进行梯度洗脱：
Figure BDA0003248454360000051
将含小檗碱的洗脱液除去，收集所有不含小檗碱的洗脱液，回收溶剂，得所述葛根芩连提取物。并且流速为10ml/min，柱温为室温。
在本发明中，先用小檗碱对照品溶液进样，获得小檗碱的保留时间；再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物，参照小檗碱的保留时间，选择性地将含小檗碱的洗脱液切换至废液，收集所有不含小檗碱的洗脱液；回收溶剂，得葛根芩连提取物。
根据本发明的一个具体实施方式，所述制备液相色谱以十八烷基键合硅胶(C18硅胶)为填充剂。更优选地，所述制备液相色谱柱的规格为21.2mm×250mm×5μm。
根据本发明优选的一个具体实施方式，梯度洗脱以0.1％甲酸-水为流动相A，以乙醇为流动相B；流速为10ml/min，柱温为室温。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述制备方法包括如下步骤：
1)按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草，用水加热回流提取2次，每次加水量为上述原料总重量的3～10倍，每次提取1～ 2小时，将提取液与药渣分离，得提取液；将所述提取液85℃以下减压浓缩，回收溶剂，得葛根芩连初提物；
2)制备液相色谱以C18硅胶为填充剂，以0.1％甲酸-水为流动相为A，以乙醇为流动相B，按如下梯度进行梯度洗脱：
Figure BDA0003248454360000061
流速为10ml/min，柱温为室温；采用紫外检测器检测，检测波长为346nm；先用小檗碱对照品溶液进样，获得小檗碱的保留时间；再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物，参照小檗碱的保留时间，选择性的将含小檗碱的洗脱液切换至废液，收集所有不含小檗碱的洗脱液；回收溶剂，得葛根芩连提取物。
本发明采用C18制备液相色谱法对葛根芩连初提物进行分离，通过优化的工艺条件能够选择性地、有效地去除葛根芩连初提物中的小檗碱。同时，本发明方法对葛根芩连初提物中的其它化学成分的死吸附小，基本不影响其它成分的含量和比例。目前未见可选择性去除葛根芩连初提物中小檗碱的方法报道。活性测试发现，该葛根芩连提取物保留了葛根芩连组合物的有效成分，预防和治疗代谢综合征的效果不低于葛根芩连初提物，某些方面的效果比葛根芩连初提物更好，同时能够避免长期服用小檗碱带来的潜在安全隐患，具有更好的安全性。
本发明还提供一种药物制剂，包括上述的葛根芩连提取物和药学上可接受的载体。葛根芩连提取物中的有效成分即为药物活性成分，该葛根芩连提取物在代谢综合征相关疾病模型上表现出良好的药效，较未去除小檗碱的葛根芩连初提物效果更强，且能够消除长期摄入小檗碱带来的潜在不良反应风险，具有更好的安全性。因此，本发明提供的不含小檗碱的葛根芩连提取物更适宜开发成预防和治疗代谢综合征的药物制剂。
根据本发明的药物制剂，优选地，包括上述的葛根芩连提取物和药学上可接受的载体，所述葛根芩连提取物占药物制剂总重量的0.1～99.9％，其余为药学上可接受的载体。
本发明的药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，优选地，所述药物制剂的剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、喷剂、膜剂、膏剂、栓剂、凝胶剂、冻干剂或注射剂，片剂如口腔崩解片、分散片等，胶囊剂如软胶囊剂、硬胶囊剂等，丸剂如滴丸、微丸剂等，膏剂如软膏剂、硬膏剂等。更优选地，所述药物制剂的剂型为口服剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂或冻干剂。
本发明还提供一种如上述的葛根芩连提取物在制备预防和/或治疗代谢综合征药物中的应用。本发明的葛根芩连提取物具有良好的预防和治疗代谢综合征的作用，其效果不低于原方，且在某些方面优于原方。本发明的葛根芩连提取物对高脂饮食诱导的代谢综合征效果尤为显著，能够有效降低高脂饮食造成的体重增长，并且对高脂饮食造成的脂肪肝有着显著的改善与治疗作用。同时，由于不含小檗碱，本发明的葛根芩连提取物避免了小檗碱的长期服用带来的潜在不良反应风险，具有更好的安全性，更容易为患者接受，适合开发成预防和治疗代谢综合征的中药创新药物。因此，可用于制备预防和/或治疗代谢综合征的药物。
本发明制备葛根芩连提取物的方法工序简便，步骤少，耗时短，易于控制，分离效率高，且方法稳定，重现性好，易于放大。本方法以水作为溶剂，可回收再利用，低毒，对环境友好。
附图说明
图1为实验例4病理实验中各组动物肝脏组织HE染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中，葛根、黄连、黄芩、甘草均为符合国家药典标准的药材。葛根为豆科植物野葛Pueratia lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。
实施例1
本实施例的葛根芩连提取物，制备方法包括如下步骤：
步骤1)：按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草，用水加热回流提取2次，每次加水量分别为上述原料总重量的8倍、6倍，每次提取时间分别为1.5小时、1小时，过滤，两次的提取液合并，得总提取液。将总提取液85℃以下减压浓缩，回收溶剂，得到葛根芩连初提物。
步骤2)：用制备液相色谱去除葛根芩连初提物中的小檗碱。制备液相色谱以C18硅胶为填充剂(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm， 5μm)，以0.1％甲酸-水为流动相为A，以乙醇为流动相B，按如下表 1中的梯度进行梯度洗脱：
表1制备液相色谱用梯度洗脱表
Figure BDA0003248454360000081
流速为10ml/min，柱温为室温。采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。先用小檗碱对照品溶液进样，获得小檗碱的保留时间(保留时间为35.5min)。再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物，参照小檗碱的保留时间，选择性的将含小檗碱的洗脱液切换至废液，收集所有不含小檗碱的洗脱液。回收溶剂，得葛根芩连提取物。
实施例2
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～60min，10％～100％A)，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。测定小檗碱与相邻色谱峰的分离度。
实施例3
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以乙醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～60min，10％～100％A)，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。测定小檗碱与相邻色谱峰的分离度。
实施例4
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～60min，10％～100％A)，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。测定小檗碱与相邻色谱峰的分离度。
实施例5
取实施例1制备的葛根芩连提取物10重量份，加淀粉6重量份和滑石粉2重量份，混匀，用80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，加入硬脂酸镁0.2重量份，混匀，压制成片，即得含有葛根芩连提取物的片剂。
实施例6
取实施例1制备的葛根芩连提取物50重量份，加蔗糖粉63重量份和糊精31.5重量份，混匀，以80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，分装，即得含有葛根芩连提取物的颗粒剂。
实施例7
取实施例1制备的葛根芩连提取物30重量份，加淀粉12重量份和滑石粉8重量份，混匀，用80％(体积百分浓度)乙醇制粒，60℃以下干燥，装胶囊，即得含有葛根芩连提取物的胶囊剂。
实施例8
取实施例1制备的葛根芩连提取物1重量份，加21重量份聚乙二醇-6000，混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制滴丸，即得含有葛根芩连提取物的滴丸剂。
实施例9
取实施例1制备的葛根芩连提取物10重量份、葡萄糖90重量份、硫代硫酸钠18重量份和蒸馏水20重量份，混合均匀后，冷冻干燥，分装，即得含有葛根芩连提取物的冻干剂。
对比例1
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以80％甲醇水为流动相，等度洗脱，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。观察小檗碱与相邻色谱峰的分离效果。
对比例2
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以70％乙醇水为流动相，等度洗脱，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。观察小檗碱与相邻色谱峰的分离效果。
对比例3
取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物，过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18，21.2mm×250mm，5μm)，以70％乙腈水为流动相，等度洗脱，流速为10ml/min，柱温为室温，采用紫外检测器检测，检测波长为346nm。观察小檗碱与相邻色谱峰的分离效果。
实验例1
实施例1、实施例2-4为采用不同流动相的梯度洗脱方法，结果显示，采用实施例1的洗脱方法，小檗碱与相邻色谱峰的分离度为1.5，采用实施例2-4的洗脱方法，小檗碱与相邻色谱峰的分离度依次为1.0、 1.2、1.1。
对比例1-3采用等度洗脱方法，小檗碱与相邻色谱峰均无法实现基线分离，且保留较强的成分无法从色谱柱上洗脱，不能达到选择性去除小檗碱而不影响其它成分的目的。
可见，实施例1-4的梯度洗脱方法分离效果更好，尤其是实施例1 的梯度洗脱方法分离效果更突出，小檗碱与相邻色谱峰分离度良好，且全部成分可以从色谱柱上洗脱，能够达到选择性去除小檗碱而不影响其它成分的目的。甲酸的加入有效调整色谱峰峰形，改善分离效果。
此外，发明人还尝试了以下对小檗碱的去除方法：
(一)取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物5g，上硅胶柱(装柱硅胶100g，径高比1:10)，依次以氯仿甲醇10:1、氯仿甲醇5:1、氯仿甲醇2:1、氯仿甲醇1:1、甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，收集洗脱液，回收溶剂。结果表明该实验方法不能实现将小檗碱有效地分离。
(二)取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物5g，上Sephadex LH-20色谱柱(Sephadex LH-20填料300g，径高比1:50)，以甲醇洗脱，共洗脱15个柱体积，收集洗脱液，回收溶剂。结果表明该实验方法不能实现将小檗碱有效地分离。
实验例2
对实施例1制备的葛根芩连提取物的化学成分进行了 UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析，对其成分进行了表征，阐明了其物质基础。
样品制备：取实施例1制备的葛根芩连提取物0.1g，称定重量，加70％甲醇20mL，超声提取2次，每次30min，合并上清，12000r/min，离心10min，取上清300μL，氮气吹干。用300μL 70％甲醇复溶， 13000r/min，离心10min，吸取上清液2μL注入LC-MS。
UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱条件：色谱柱：Waters Acquity BEH C18 column(2.1×100mm，1.7μm)；柱温：35℃；流动相A为0.1％甲酸 -水；流动相B为乙腈；流速：0.3ml/min；进样体积：2μl；洗脱梯度如下表2所示：
表2 UHPLC-Q-TOF-MS/MS梯度洗脱表
Figure BDA0003248454360000131
UHPLC-Q-TOF-MS/MS质谱条件：电喷雾离子源ESI，正负离子扫描模式，扫描范围m/z 100-1500。见表3。
表3 UHPLC-Q-TOF-MS/MS质谱正负离子扫描
Figure BDA0003248454360000132
实验结果：基于以上UHPLC-Q-TOF-MS/MS条件，对实施例1 制备的葛根芩连提取物进行分析，结合MS精确分子量，MS/MS二级裂解规律，以及Pubchem等开放数据库的结果，共鉴定出16个化合物。其中，负离子模式鉴定化合物12个，鉴定结果及色谱峰归属见下表4。可见，实施例1制备的葛根芩连提取物中未检测到小檗碱。
表4负离子模式鉴定结果及色谱峰归属
Figure BDA0003248454360000141
生物碱类化合物在正离子模式较负离子模式灵敏，因此正离子模式重点关注了黄连生物碱类成分的鉴定，鉴定化合物4个，鉴定结果及色谱峰归属见下表5。可见，实施例1制备的葛根芩连提取物中未检测到小檗碱。
表5正离子模式鉴定结果及色谱峰归属
Figure BDA0003248454360000151
由上述可知，本发明的制备方法可有效地选择性去除葛根芩连初提物中的小檗碱。
实验例3
1.实验目的
通过高脂饮食诱导代谢综合征小鼠模型对葛根芩连初提物及不含小檗碱的葛根芩连提取物在体内药效功能进行验证，评价药效。
2.实验材料
2.1实验动物
C57BL/6J雄鼠4周龄。
2.2实验试剂
表6试剂表
Figure BDA0003248454360000161
3.实验方法
3.1实验方法
C57BL/6J雄鼠，4周龄(体重16～18克)。小鼠自由饮水饮食， 12小时光照/黑暗循环，温度控制在21±2℃，湿度50-70％。适应性喂养一周后，随机分为5组，每组6只，分为空白对照组、模型组、二甲双胍组(阳性药对照组)、全方组(给予实施例1的葛根芩连初提物)和去小檗碱组(给予实施例1的葛根芩连提取物)。其中空白对照组正常饮食，另外4组给予高脂饮食(HFD，60％能量来自脂肪)。
3.2灌胃剂量
空白对照组正常饮食，每只灌生理盐水0.2ml/次，每周5天，共 14周；
模型组给予高脂饮食，每只灌生理盐水0.2ml/次，每周5天，共 14周；
二甲双胍组给予高脂饮食，给予二甲双胍，药物剂量为200mg/kg，灌胃剂量0.2ml/次，每周5天，共14周；
全方组给予高脂饮食，以葛根芩连初提物灌胃，按照每只小鼠灌胃0.2ml，单次剂量为2.01g/kg，早晚各一次，总剂量为4.027g/kg/d，共14周；
去小檗碱组给予高脂饮食，以不含小檗碱的葛根芩连提取物灌胃，按照每只小鼠灌胃0.2ml，单次剂量为2.01g/kg，早晚各一次，总剂量为4.027g/kg/d，共14周；
每周测量动物体重。实验结束时处死小鼠，收集肝脏组织样本留作实验例4的病理分析。
4.实验结果
各组动物在实验过程中的体重增加量见表7。结果显示全方组和去小檗碱组均能抑制高脂饮食造成的体重异常增长，具有显著的控制体重增加的功能，且去小檗碱组较全方组效果更好。
表7药理实验中各组动物体重增加量的结果
分组/时间点 空白对照组 去小檗碱组 二甲双胍组 全方组 模型组
D0 0 0 0 0 0
D7 1.57±0.48 1.72±0.46 1.88±0.73 1.70±0.38 1.98±0.65
D14 2.65±0.92 2.97±0.52 3.00±0.81 3.27±0.79 3.72±1.24
D21 3.73±0.85 3.73±0.59 3.72±0.89 4.13±1.11 4.93±1.65
D28 3.60±1.04 4.37±0.96 4.78±0.95 4.75±1.33 6.15±1.89
D35 4.28±1.24 5.55±1.22 6.60±1.34 6.77±1.84 6.62±1.87
D42 4.68±1.46 6.25±1.74 7.95±1.59 7.72±1.46 9.27±2.31
D49 6.01±1.37 7.78±2.11 9.00±1.91 8.70±1.72 11.20±2.59
D56 5.73±1.43 7.95±2.40 9.05±2.38 10.18±2.24 12.83±2.93
D63 6.58±1.39 8.52±2.82 10.20±2.44 11.07±2.30 13.87±3.12
D70 7.05±1.47 9.63±2.77 12.27±3.31 11.85±4.51 16.98±3.58
D77 7.20±1.49 11.27±3.21 13.72±3.59 14.83±2.61 19.03±3.82
D84 7.22±1.19 12.05±3.58 14.73±4.64 15.83±3.32 20.75±3.77
D91 7.90±1.24 13.02±3.72 15.17±5.28 17.15±3.53 21.95±3.93
D98 7.77±1.34 12.40±3.64 14.48±5.63 16.25±3.49 21.23±3.88
注：D表示天数，体重增加量的单位为克。
实验例4
1.实验目的
观察葛根芩连初提物和不含小檗碱的葛根芩连提取物对高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠肝脏的影响。
2.实验材料
采用上述实验例3药理实验中收集的小鼠肝脏组织。
2.1实验试剂
表8实验试剂
Figure BDA0003248454360000181
2.2实验仪器
表9实验仪器
Figure BDA0003248454360000182
3.实验方法
组织经4％多聚甲醛固定24小时以上，常规脱水，石蜡包埋。包埋后使用切片机切片，切片厚度3μm。切片根据下表10按顺序进行预处理，然后根据下表11的顺序进行HE染色，晾干后使用中性树胶封片，树胶凝固后显微镜下观察。
表10预处理顺序表
Figure BDA0003248454360000183
表11 HE染色顺序表
Figure BDA0003248454360000191
4.实验结果
肝脏组织切片见图1。图1中100×指的是放大倍数为100，400×指的是放大倍数为400。黑色箭头指出细胞内均出现大小不一、圆形、有张力的脂滴。
正常饮食的空白对照组小鼠肝脏形态正常，正常对照组肝细胞体积大、排列紧密、嗜酸性，肝细胞索之间为肝血窦，血窦壁可见内皮细胞和肝巨噬细胞。而高脂喂养模型组小鼠肝脏则肝细胞肿胀，细胞内均出现大小不一、圆形、有张力的脂滴(黑色箭头所示)，主要位于肝小叶周边区，并出现炎性细胞浸润。
模型组脂滴数量最多，大小为0.4～1.0μm，体积较大。
二甲双胍组脂滴大小为0.4～0.7μm，数量也较多。
全方组脂滴有所减少，但是仍然有较明显的脂滴存在，大小为 0.3～0.6μm，体积中等。
去小檗碱组(不含小檗碱的葛根芩连提取物组)脂滴减少非常明显，脂滴大小为0.3～0.3μm，体积和数量都有明显下降。
结果揭示葛根芩连初提物对高脂饮食造成的脂肪肝有着显著的改善与治疗作用，而去小檗碱后的葛根芩连提取物对脂肪肝的治疗效果没有影响，甚至更优。
现有文献已报道，长期服用含小檗碱的制剂容易造成便秘、腹泻等胃肠道反应，在以上实验过程中，全方组的小鼠普遍出现便秘症状，粪便干燥、坚硬，呈黑色，粒形小，光泽度低，便粒和排便量明显减少。去小檗碱组同空白对照组粪便性状接近，为正常湿润绿色性状(高脂饲料为绿色)，外观饱满圆润，粒形大，有光泽度，便粒和排便量正常。显然，不含小檗碱的葛根芩连提取物在不降低代谢综合症治疗效果的基础上，能够基本排除长期服用小檗碱带来的潜在安全隐患，具有更好的安全性和成药性。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (1)

1.一种不含小檗碱的葛根芩连提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)：按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草，用水加热回流提取2次，每次加水量分别为上述原料总重量的8倍、6倍，每次提取时间分别为1.5小时、1小时，过滤，两次的提取液合并，得总提取液；将总提取液85℃以下减压浓缩，回收溶剂，得到葛根芩连初提物；
步骤2)：用制备液相色谱去除葛根芩连初提物中的小檗碱；制备液相色谱以C18硅胶Agilent Prep-C18为填充剂，柱直径为21.2mm，柱长度为250mm，C18硅胶的粒度为5μm，以0.1％甲酸-水为流动相为A，以乙醇为流动相B，按如下梯度进行梯度洗脱：
Figure FDA0003829307420000011
流速为10ml/min，柱温为室温；采用紫外检测器检测，检测波长为346nm；先用小檗碱对照品溶液进样，获得小檗碱的保留时间35.5min；再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物，参照小檗碱的保留时间，选择性地将含小檗碱的洗脱液切换至废液，收集所有不含小檗碱的洗脱液，得葛根芩连提取物；
其中，小檗碱与相邻色谱峰的分离度为1.5；
对葛根芩连提取物的化学成分进行UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析；负离子模式鉴定葛根芩连提取物，未检测到小檗碱；正离子模式鉴定葛根芩连提取物，未检测到小檗碱。
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