CN113189211A - 一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，1)根据无患子皂苷特征性成分系列浓度标准溶液得出无患子皂苷特征性成分的色谱标准曲线，建立标准曲线方程；2)制备待测样品溶液；3)基于步骤2)中制备的溶液，采用高效液相色谱‑蒸发光散射法检测待测溶液；4)根据步骤3)中检测得到的色谱峰面积和步骤1)中建立的标准曲线方程，计算得到待测样品中无患子皂苷特征性成分的浓度，根据测试得到的待测样品中无患子皂苷特征性成分浓度换算成待测样品中皂苷特征性成分的含量，并据此判断待测样品的质量。该方法运行时间较短，响应值和灵敏度高，峰之间分离度好，能准确测定无患子皂苷含量，适用于无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
无患子来源无患子科(Sapindaceae)，俗称“菩提树、皂果、肥皂树”等，拉丁学名Sapindus，意即“印度肥皂”。《本草纲目》记载，无患子果实可用于洗发洗面，因其果皮含有丰富的皂苷，其中大部分为三萜类皂苷，即无患子皂苷，总含量约为5.33％。无患子皂苷为天然的非离子型表面活性剂，临界胶束浓度和表面张力均较低，能显著降低水的表面张力，泡沫丰富，手感细腻，去污力强，能100％降解，长期使用不会对人体和环境有害，愈来愈广泛应用于日化行业中，特别是洗涤用品和化妆品中。目前国内市场上已有添加了无患子皂苷的化妆品、洗涤用品出售，例如迪奥、高斯、仙美无患等。
目前，无患子皂苷常用的含量测定方法有比色法、高效液相色谱法、近红外法等，现洗护、化妆品行业主要采用中药皂苷通用测定方法——比色法测定无患子皂苷含量，测定方法比较简单，其所含鞣质、黄酮类成分存在干扰。或将无患子皂苷水解后采用高效液相色谱法测定常春藤皂苷元的含量，由于常春藤皂苷元无表面活性，现有方法不能准确评价其质量。实验表明，采购的部分批次无患子皂苷提取物原料表面活性、起泡性与标签标示的无患子皂苷含量并不呈正相关，有的批次按现有方法检测其皂苷含量测定值很高，但其表面活性、起泡性很差，提示目前市场上无患子皂苷提取物原料质量良莠不齐，现有方法不能有效控制其质量。针对现有技术的不足，本发明建立了无患子果皮及无患子皂苷提取物原料主要表面活性成分无患子三萜总皂苷及无患子三萜总皂苷主要成分皂苷RarasaponinIII、皂苷Sapinmusaponion M的含量测定方法，全面反映了无患子果皮及无患子皂苷提取物原料中皂苷成分信息，可有效控制其质量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种无患子果皮及无患子皂苷提取物原料中三萜类皂苷成分含量测定方法，以更全面反映无患子果皮及无患子皂苷提取物中皂苷成分信息，更有效控制其质量。
该方法包括以下步骤：
1)根据无患子皂苷特征性成分系列浓度标准溶液的色谱分析得出无患子皂苷特征性成分的色谱标准曲线，建立标准曲线方程；
2)制备待测样品溶液；
3)基于步骤2)中制备的溶液，采用高效液相色谱-蒸发光散射法检测待测溶液；
4)根据步骤3)中检测得到的色谱峰面积和步骤1)中建立的标准曲线方程，计算得到待测样品中无患子皂苷特征性成分的浓度，根据测试得到的待测样品中无患子皂苷特征性成分浓度换算成待测样品中皂苷特征性成分的含量，并据此判断待测样品的质量。
进一步优选的，上述无患子皂苷特征性成分包含皂苷Rarasaponin III、皂苷Sapinmusaponion M及无患子三萜总皂苷中的至少一种。
进一步优选的，当待测样品中皂苷Rarasaponin III、皂苷Sapinmusaponion M分别占无患子三萜总皂苷含量的10％-20％和3％-10％时，表示待测样品中无患子三萜类皂苷成分分布比例符合规定要求。
进一步的优选，上述步骤3)中高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定时的色谱条件与系统适用性试验参数包括：准备色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱程序为：0～15min，25～40％A；15～35min，40～43％A；35～45min，43～50％A；45～50min,100％A；流速0.9-1.1mL/min，柱温25-40℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度95-115℃，载气流速2.5-3.5mL/min，进样量10μL；理论板数按参照峰RarasaponinIII计算不低于5000。
进一步优选的，上述的色谱柱为Agilent Eclipse plus C18或Welch XtimateC18或Welch Ultimate C18色谱柱等十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，或其它等效十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱型为4.6mm×250mm，5μm。
进一步优选的，步骤1)中的标准曲线方程为lnA＝KlnC+B；标准曲线方程中C表示待测样品溶液浓度，A表示测得的色谱峰面积，K为标准曲线的斜率，B为标准曲线的截距。
进一步优选的，步骤1)的标准曲线方程绘制过程中，所述标准系列溶液的浓度范围为10-1000μg/mL，至少覆盖一个数量级，且除空白溶液外还包含至少5个浓度点，相关系数R2不低于0.99。
进一步优选的，上述步骤1)中建立标准曲线方程的步骤为：称取无患子皂苷特征性成分对照品适量，置容量瓶中，用甲醇超声溶解，定容，摇匀，制成每1mL含1000μg的溶液，用滤膜过滤，取续滤液，稀释成系列浓度标准溶液；对系列浓度标准溶液进行色谱分析，得无患子皂苷特征性成分标准品高效液相色谱图；以峰面积A的对数为纵坐标，浓度C的对数为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。
进一步优选的，上述步骤2)制备待测样品溶液包括以下步骤：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取0.5-1.5g，加入6-70mL的提取溶剂超声提取15-45min，或取无患子皂苷提取物原料0.05-0.2g，加入6-70mL的甲醇或乙醇，超声提取5min-15min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
进一步优选的，上述提取溶剂为甲醇或者乙醇或者水。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、首次建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测无患子果皮及无患子皂苷提取物的主要表面活性物质皂苷成分含量测定方法，并优化该检测方法，使其能检出更全面的目标峰，且目标峰不受基线干扰影响，响应值和灵敏度高，峰之间分离度好，能较好地呈现无患子皂苷类成分整体图谱峰特征，准确反应无患子皂苷的真实成分分布及含量多少，适用于无患子果皮及无患子皂苷提取物的质量控制。
2、运行时间相对较短，为不超过50min。
附图说明
图1为无患子三萜类皂苷成分Rarasaponin III标准品高效液相色谱图；
图2为无患子三萜类皂苷成分Sapinmusaponion M标准品高效液相色谱图；
图3为无患子三萜类皂苷成分总皂苷标准品高效液相色谱图；
图4为无患子果皮的高效液相色谱图；
图5为无患子皂苷提取物原料的高效液相色谱图；
图6为无患子三萜类皂苷成分Rarasaponin III线性方程图；
图7为无患子三萜类皂苷成分Sapinmusaponion M线性方程图；
图8为无患子三萜类皂苷成分总皂苷线性方程图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例中使用的样品无患子果皮或取无患子皂苷提取物(原料)来源见表1和2。
表1无患子果皮收集情况表
表2无患子原料收集情况表
实施例1
无患子三萜类皂苷成分Rarasaponin III含量测定方法及结果
1.1、标准曲线绘制：精密称取Rarasaponin III对照品适量，置10mL容量瓶中，用6mL甲醇超声溶解，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，稀释成系列标准工作溶液：69.80μg/mL、87.25μg/mL、174.5μg/mL、349.0μg/mL、698.0μg/mL、872.5μg/mL。按1.3色谱条件进样分析，得到RarasaponinIII标准品高效液相色谱图(见图1)；以峰面积(A)的对数为纵坐标，浓度(C)的对数为横坐标，进行线性回归，回归方程为lnA＝1.6937lnC-7.096(R2＝0.9984)(见图6)。
1.2、待测品溶液的制备：取编号为S1的无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，分别精密称取三份，每份1g，加30mL甲醇，超声提取20min，放冷，定容至50mL，用0.45μm有机滤膜过滤，取续滤液，HPLC备用。取编号SY1的无患子皂苷提取物原料0.1g，加入30mL的甲醇，超声提取10min，冷却定容至50mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
1.3、色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse plus C18，4.6mm×250mm，5μm，柱温25℃，流速1.0mL/min；蒸发光散射检测器条件：蒸发温度105℃，载气流速3.0mL/min，按下表3进行梯度洗脱：
表3梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(体积％) | 流动相B(体积％) |
| 0-15min | 25→40％ | 75→60％ |
| 15-35min | 40→43％ | 60→57％ |
| 35-45min | 43→50％ | 57→50％ |
| 45-50min | 100％ | 0 |
1.4、待测样品中的含量：按1.3步骤色谱条件，分别吸取无患子果皮及无患子皂苷提取物原料供试品溶液进样分析，记录色谱图，记录与对照品保留时间一致下的峰面积，代入1.1标准曲线方程，计算出无患子果皮样品中Rarasaponin III的含量分别为2.83％、2.94％、2.87％。相对标准偏差2.0％；无患子皂苷提取物原料中Rarasaponin III的含量分别为6.13％、6.21％、6.17％。相对标准偏差0.8％。
实施例2
无患子三萜类皂苷成分Sapinmusaponion M含量测定方法及结果
1.1、标准曲线绘制：精密称取Sapinmusaponion M对照品约10mg，置10mL容量瓶中，用甲醇6mL超声溶解，定容，摇匀，制成每1mL含1000μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，稀释成系列标准工作溶液：50μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、625μg/mL。按1.3色谱条件进样分析，得到Sapinmusaponion M标准品高效液相色谱图(见图2)；以峰面积(A)的对数为纵坐标，浓度(C)的对数为横坐标，进行线性回归，回归方程为lnA＝1.6846lnC-6.3988(R2＝0.9984)(见图7)。
1.2、待测品溶液的制备：同“实施例1”1.2步骤。
1.3、色谱条件：同“实施例1”1.3步骤。
1.4、检测待测样品中的含量：按1.3步骤色谱条件，分别吸取无患子果皮及无患子皂苷提取物原料供试品溶液进样分析比较，记录色谱图，记录与对照品保留时间一致下的峰面积，代入1.1标准曲线方程，即计算出无患子果皮样品中Sapinmusaponion M的含量分别为4.53％、4.52％、4.56％。相对标准偏差0.5％；无患子皂苷提取物原料中Sapinmusaponion M的含量分别为2.73％、2.72％、2.75％。相对标准偏差0.6％。
实施例3
无患子三萜类皂苷成分总皂苷含量测定方法及结果
1.1、标准曲线绘制：精密称取三萜类总皂苷对照品适量，置10mL容量瓶中，用甲醇6mL超声溶解，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，稀释成系列标准工作溶液：1.023mg/mL、2.047mg/mL、4.094mg/mL、8.187mg/mL、10.23mg/mL。按1.3色谱条件进样分析，得到总皂苷标准品高效液相色谱图(见图3)；以峰面积(A)的对数为纵坐标，浓度(C)的对数为横坐标，进行线性回归，回归方程为lnA＝1.6271lnC+3.2131(R2＝0.9983)(见图8)。
1.2、待测品溶液的制备：同“实施例1”1.2步骤。
1.3、色谱条件：同“实施例1”1.3步骤。
1.4、检测待测样品中的含量：按1.3步骤色谱条件，分别吸取无患子果皮及无患子皂苷提取物原料供试品溶液进样分析比较，记录色谱图，记录与对照品保留时间一致下的峰面积，代入1.1标准曲线方程，即计算出无患子果皮样品中三萜总皂苷含量分别为21.54％、20.79％、21.09％。相对标准偏差1.8％；无患子皂苷提取物原料中三萜总皂苷含量分别为55.73％、55.32％、55.64％。相对标准偏差0.4％。
根据实施例1-3的待测样品测试方法得到无患子果皮的高效液相色谱图见图4，得到无患子皂苷提取物原料的高效液相色谱图见图5。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖与该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)根据无患子皂苷特征性成分系列浓度标准溶液的色谱分析得出无患子皂苷特征性成分的色谱标准曲线，建立标准曲线方程；
2)制备待测样品溶液；
3)基于步骤2)中制备的溶液，采用高效液相色谱-蒸发光散射法检测待测溶液；
4)根据步骤3)中检测得到的色谱峰面积和步骤1中建立的标准曲线方程，计算得到待测样品中无患子皂苷特征性成分的浓度，根据测试得到的待测样品中无患子皂苷特征性成分浓度换算成待测样品中皂苷特征性成分的含量，并据此判断待测样品的质量。
2.根据权利要求1所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述无患子皂苷特征性成分包含皂苷Rarasaponin III、皂苷Sapinmusaponion M及无患子三萜总皂苷中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，当待测样品中皂苷Rarasaponin III、皂苷Sapinmusaponion M分别占无患子三萜总皂苷含量的10％-20％和3％-10％时，表示待测样品中无患子三萜类皂苷成分分布比例符合规定要求。
4.根据权利要求1所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述步骤3)中高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定时的色谱条件与系统适用性试验参数包括：准备色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱程序为：0～15min，25～40％A；15～35min，40～43％A；35～45min，43～50％A；45～50min，100％A；流速0.9-1.1mL/min，柱温25-40℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度95-115℃，载气流速2.5-3.5mL/min，进样量10μL；理论板数按参照峰Rarasaponin III计算不低于5000。
5.根据权利要求4所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述的色谱柱为Agilent Eclipse plus C18或Welch Xtimate C18或Welch Ultimate C18或其它等效十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱型为4.6mm×250mm，5μm。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述步骤1)中的标准曲线方程为lnA＝KlnC+B；
标准曲线方程中C表示待测样品溶液浓度，A表示测得的色谱峰面积，K为标准曲线的斜率，B为标准曲线的截距。
7.根据权利要求1所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述步骤1)的色谱标准曲线绘制过程中，所述系列浓度标准溶液的浓度范围为10-1000μg/mL，至少覆盖一个数量级，且除空白溶液外还包含至少5个浓度点，相关系数R2不低于0.99。
8.根据权利要求1所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述步骤1)中建立标准曲线方程的步骤为：称取无患子皂苷特征性成分对照品适量，置容量瓶中，用甲醇超声溶解，定容，摇匀，制成每1mL含1000μg的溶液，用滤膜过滤，取续滤液，稀释成系列浓度标准溶液；对系列浓度标准溶液进行色谱分析，得无患子皂苷特征性成分标准品高效液相色谱图；以峰面积A的对数为纵坐标，浓度C的对数为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。
9.根据权利要求1所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述步骤2)制备待测样品溶液包括以下步骤：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取0.5-1.5g，加入6-70mL的提取溶剂超声提取15-45min，或取无患子皂苷提取物原料0.05-0.2g，加入6-70mL的甲醇或乙醇，超声提取5min-15min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
10.根据权利要求9所述的一种无患子三萜类皂苷成分含量测定方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇或者乙醇或者水。
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