CN101897752B - 一种中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法，该组合物是由重量份原料药丹参2～8份、黄芪7～13份、三七0.5～2份组成，该组合物具有抗氧化、能够增强免疫力等功效。

Description

一种中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种抗氧化、具有增强免疫力功能的中药组合物及其制备方法。

背景技术

随着社会经济的繁荣、生活节奏的加快、竞争的日益激烈，现代人特别是中年人要肩负家庭和工作的双重重担，影响人体健康的因素发生了很大的变化，长期超负荷的体力、脑力劳动导致机体免疫功能下降、以至于引起多种疾病。

现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，使人们认识到免疫系统的紊乱不仅会产生多种疾病，而且与人体衰老及老年人的多发病如肿瘤、高血压、糖尿病的发生均有密切关系，免疫功能具有增龄性变化，即年龄增大，其免疫功能下降或紊乱，结果胸腺萎缩，T细胞损耗，从而导致机体衰老，寿命缩短。而中药免疫调节剂可以增强老年人的免疫功能，近十多年来，化学家们已从扶正固本等补益类中药中得到了多种化合物，不但能促进机体的免疫功能，而且证实了确实具有很强的免疫活性。因此寻找具有良好免疫调节作用，以预防和治疗肿瘤、心脑血管等多种疾病的药物。

(1)丹参是我国传统医学中常用药物之一，有悠久的临床应用历史。近几十年来，用现代医学方法，结合化学、分子生物学和细胞生物学等多学科的技术手段，对丹参进行了较系统的研究，取得大量新的认识和实验结果。从丹参中提取的化学成份分为脂溶性和水溶性两类，现已得到40种脂溶性化合物。其结构主要分为两类，即邻醌类和邻羟基对醌类，属于二萜醌类化合物。20世纪80年代初，中国医学科学院，药物研究所首先对丹参水溶性成份进行系统研究，先后从丹参水溶性成份中分离得到一系列化合物。经国内学者的共同努力，已经分离出丹参水溶性成份近20种。主要为丹酚酸类，目前结构明确的丹酚酸有13种，如：丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸。这些化合物多具有酚酸性结构，如丹酚酸A为丹参素(水溶性各种成份的基本结构)与两分子咖啡酸结合而成；丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成；丹酚酸c则为两分子丹参素缩合而成；迷迭香酸，由一分子丹参素和一分子咖啡酸缩合而成等。我国药典2005版一部52页“丹参”项下规定：丹参日服用量为9-15克，安全食用剂量≤15g。

现代药理研究表明：丹参的水溶性成分具有很强的抗脂质过氧化和自由基清除作用。丹参水溶性提取物可显著抑制Fe²⁺-半胱氨酸引起的大鼠心、脑、肝等组织中线粒体和微粒体的脂质过氧化，还可明显抑制由Fe²⁺-Vc体系和Triton X-100引起的大鼠心、脑、肝、肾线粒体肿胀，推测其保护作用与抗氧化作用有关。丹参的免疫调节作用主要是通过它对细胞因子、抗体及免疫复合物、免疫细胞的作用发挥对免疫应答的内调节作用，且这种作用具有双向性。

(2)黄芪

黄芪临床应用十分广泛，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮等功效。黄芪的化学成分主要有皂苷、多糖、黄酮、氨基酸等，其中黄芪甲苷为其主要有效成分之一，具有抗炎、降压、镇痛、镇静等作用，对免疫器官也有影响。因此对黄芪药材及含黄芪(君药)的中成药的质量评价均以黄芪甲苷作为评价的指标，且文献报道较多。中华人民共和国药典2005年版一部“黄芪”项下规定：黄芪日服用量为9-30克，安全食用剂量≤30g。

现代药理研究表明：黄芪可诱生干扰素、提高干扰素抗病毒能力、提高细胞免疫、增加自然杀伤细胞(NK)和单核巨噬细胞系统功能，从而在一定程度上抑制病毒复制，进而杀灭病毒。黄芪不但能抗病毒，而且还可帮助修复病毒产生的损害。临床实践也证明黄芪对柯萨奇病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒、巨细胞病毒等多种病毒引起的疾病疗效确切，且无有毒副作用报道。充分发掘黄芪作为免疫调节剂的潜力，很多疾病的进展和迁延不愈都与病人自身免疫系统失衡-即免疫功能亢进或免疫力下降有关，而黄芪不但具有双向免疫调节作用，而且其清除自由基、促进蛋白质合成、诱生干扰素等作用可以增强机体抵抗力，减轻病原体对机体的损害，促进受损组织复原，可谓一药多效。所以，无论是将黄芪用于免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮、银屑病等的治病，还是配合其他药物，用于其他疾病的治疗，调动机体免疫系统，提高机体免疫力，共同对抗疾病损害以达到提高疗效，缩短疗程的目的，都是值得进一步研究的。

(3)三七

三七为五加科植物参三七的干燥根，主产于云南、广西及四川等地。味甘、微苦，性温，归肝、胃、心、小肠经，具有化瘀止血、消肿定痛、补虚、强壮等作用。主要用于治疗咯血、外伤出血、跌打肿痛。近年来用于治疗冠心病、糖尿病、抗心绞痛、抗血栓等。三七块根含总皂昔12％，是三七的主要生理活性成分，可分成人参二醇型(Rb型)和人参三醇型(Rg型)皂苷。另外尚含具有止血活性的三七素(β-草酰基-L-α-β-二氨基丙酸)，具有增强免疫功能的多糖等多种成份。我国药典2005版一部9页“三七”项下规定：三七日服用量为3～9克，安全食用剂量≤9克。

三七总皂苷，与人参皂苷相似，具有滋补强壮及抗衰老作用。三七皂苷能抑制脂质过氧化、提高脑组织SOD活性、降低脑组织和血液中的脂褐素含量。三七能增强人体的免疫功能。三七总皂苷能提高大、小鼠的巨噬细胞的吞噬指数，提高NK细胞的活性。三七皂苷还能升高红细胞C₃b受体花结率，增强红细胞免疫功能。三七具有免疫调节作用，能使过低或过高的免疫反应恢复正常，不干扰正常的免疫反应。周小玲等报道，TSPNS能提高大鼠的特异性和非特异性细胞的免疫功能。

目前药典上规定的丹参、三七、黄芪的最低日服用量比较高，药剂的载药量低，效果不明显，同时患者依从性不好。再有，市面上的关于抗氧化，增强免疫力的大复方制剂比较多，成分复杂，主要有效成分含量较低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有抗氧化、能够增强免疫力的中药组合物及其制剂，载药量高，服用量低。

本发明另一目的是提供了该组合物的制备方法。

本发明含有一个目的提供了该组合物在制备抗氧化、增强免疫力药物或保健品上的应用。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明的中药组合物，其是由重量份原料药丹参2～8份、黄芪7～13份、三七0.5～2份组成。

本发明的中药组合物，优选是由重量份原料药丹参4～6份，黄芪9-11份、三七1～2份组成。

本发明的中药组合物，最佳是由重量份原料药丹参5份、黄芪10份、三七1份组成。

本发明的中药组合物中按重量百分比计丹参素含量不得低于147mg/100g。

本发明的中药组合物可以结合各种载体如赋型剂或辅助剂制成药学上可接受的剂型，其中制剂的剂型分为口服、肌内、腹腔内、皮下或静脉内给药。口服剂分为普通片剂，胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、口服液、软胶囊、口崩片、散剂、膏剂、丹剂、丸剂、栓剂及其这些剂型的速释制剂或长效制剂、粉雾剂、气雾剂、凝胶剂。皮下或静脉给药分为注射剂、冻干粉针剂等。优选制成胶囊剂滴丸剂等。

本发明所提供的上述中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)丹参、三七浸膏提取；

(2)黄芪浸膏提取；

(3)丹参、三七、黄芪浸膏混合均匀即得组合物。

其中，步骤(1)中所述的丹参、三七浸膏提取方法包括以下步骤：

a、丹参、三七药材制成粗粉；

b、上述丹参、三七药材5-7倍量水，回流提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液，滤过；

c、提取液滤过浓缩后醇沉，取上清液；

d、将上述上清液过滤浓缩后，得丹参三七浸膏。

所述的步骤b中优选丹参、三七药材用7倍量水回流提取2次，每次2小时。步骤c中优选提取液浓缩至生药体积比为1∶1，浓缩液用95％乙醇醇沉至醇浓度为65％～75％，优选醇沉浓度为70％。

上述步骤(1)中丹参、三七浸膏的具体提取方法如下：a、取符合2005年版药典相关规定的丹参、三七为原料，丹参药材切制成饮片；三七粉碎成0.2-0.5cm左右的粗颗粒；b、丹参、三七药材混合加水煎煮两次，每次加入药材总重7倍的水，每次回流提取2小时，合并提取液，滤过；c、提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h，取上清液过滤；d、上清液过滤后加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，进入30万级洁净区，密封，备用。

本发明的步骤(2)中黄芪浸膏的提取方法包括：黄芪饮片用4-6倍量水或含水乙醇提取1-4次，每次提取1-2小时(优选6倍量，提取2次，第一次2小时，第二次1小时)，合并提取液；提取液浓缩后醇沉至浓度为60～70％(优选60％)，回收乙醇浓缩即得黄芪浸膏。

上述步骤中所述的含水乙醇为45-95％乙醇，优选95％乙醇。

本发明的步骤(2)黄芪浸膏的具体提取方法：取符合2005年版药典相关规定的黄芪药材为原料，切制成饮片；加水煎煮两次，每次加入药材重量6倍的水，第一次回流提取2小时，第二次回流提取1小时，合并提取液，滤过：提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)。加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa；浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为60％，静置12h，取上清液过滤；上清液加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30(50～60℃)，得黄芪浸膏，进入30万级洁净区，密封，备用。

本发明的制备工艺简单，适合大生产，而且收率高，含量稳定，生物利用度好。

下面通过试验例来了解本发明，说明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物的含量测定方法及方法学验证

1、药品，试剂与仪器

1.1药品：选自实施例1

1.2仪器色谱仪：Agilent1100高效液相色谱仪检测器：Agilent VWD型紫外检测器

1.3试剂：甲醇(色谱纯)

2、供试品的制备：

取实施例1中的药物，混匀，研成细粉，取0.4g置10ml量瓶，甲醇超声30分钟，放至室温，甲醇定容至刻度。

3、对照品的制备：

取丹参素钠对照品(每1mg丹参素钠相当于0.9mg丹参素)适量，精密称定，加甲醇制成每1ml相当于含0.1mg丹参素。

4、色谱条件

检测器：检测波长281nm。

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，5μm，250×4.6mm。

流动相：甲醇∶水∶醋酸＝50∶450∶4.2

流速：0.8ml/min

理论塔板数按丹参素计算应不低于2000；30℃柱温下进行测定。

5、测定方法

精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，进入高效液相色谱仪，测定丹参素的含量。

6、丹参素含量测定方法学验证

6.1.含量测定线性试验

对照品溶液(丹参素标准溶液0.226mg/ml)中，分别取1ml分别置2、5、10、50ml容量瓶甲醇定容，分别取5μl进HPLC，以丹参素含量为横座标，以峰面积为纵座标，作丹参素的标准曲线，数值见表1。

表1丹参素含量测定线性试验

回归方程Y＝5005.2X-3.406，相关系数R＝0.9999，有很好的线性回归。

6.2.进样精密度实验

对同一供试品溶液重复进样6次，以峰面积计算，结果RSD％＝1.6，说明该仪器的比较稳定。见表2。

表2进样精密度

6.3溶液稳定性试验

取供试品溶液，在室温条件下(18～20℃)分别于0小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时测定样品中丹参素含量，样品中丹参素含量24小时内稳定。见表3。

表3样品溶液稳定性

6.4.方法的重复性实验

取实施例1的药物粉末六份(0.4g/份)，以上述供试品制备方法处理，分别进行液相色谱定量测定，得出方法的变异系数为2.2％，说明该含量测定方法重复性好。见表4。

表4吉智胶囊中丹参素含量测定方法精密度

6.5回收率实验

采用加样回收法，分别取实施例1胶囊20粒，混合均匀，取6份，0.2g/份，精密称定，分别置10ml容量瓶，分别加入丹参素钠对照品(0.175mg/ml)2ml，甲醇定容，混匀，离心取上清液测定含量。计算出吉智胶囊中丹参素平均回收率为100.2％，RSD为2.1％，说明该含量测定方法准确，能够真实反应产品的质量。见表5。

表5HPLC对吉智胶囊中丹参素含量测定方法的回收试验

由此可见，本发明的药物组合物含量稳定。

试验例2抗氧化动物试验

1材料与方法

1.1样品：取实施例1的样品

1.2试验动物：二级昆明雌性小鼠50只，体重18-22g，约3月龄，由军科院提供。

1.3剂量选择：本品人体日推荐摄入量为3.6g/60kgBW，设三个剂量组，分别为0.30、0.6、1.80g/kg，BW，即分别相当于人体摄入量的5、10、30倍。样品内容物经过蒸馏水配置成溶液，均经口灌胃，灌胃量0.2ml/10g.BW。另设D-半乳糖模型对照组和空白对照组。

1.4主要仪器

UV-1201紫外可见分光光度计、低温冷冻离心机、超声匀浆器、水浴箱、丙二醛、试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5试验方法

取二级昆明种雌性小鼠50只，随机分成5组，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖500mg/kg，BW腹腔注射造模，注射量为0.1ml/10g，BW，每日1次，连续造模6周，取尾血测定给予不同浓度的受试样品，模型对照组给予等体积蒸馏水，在给与受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量的D-半乳糖，持续30天。于试验末期取肝，制成5％肝匀浆后测定过氧化脂质含量和抗氧化酶活力。

1.6过氧化脂质含量测定

1.7抗氧化酶活力测定

1.7.1肝匀浆中超氧化物歧化酶活力测定，按试剂盒的要求测定5％肝匀浆中SOD活力，并根据组织蛋白含量，将单位换算成U/mgprot。

1.7.2肝匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶活力测定：按试剂盒的要求测定0.25％肝匀浆中GSH-PX活力，并根据组织蛋白含量，将单位换算成U/mgprot。

1.8组织蛋白含量测定：应用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定1％肝匀浆组织蛋白含量。

1.9结果统计

试验数据用SPSS10.0进行统计检验，其中空白对照组与模型对照组采用T-检验，模型对照组与各剂量组采用方差分析及两两检验。如方差不齐者采用数据转换，转换后仍不齐则采用非参数统计。

2结果

2.1对小鼠体重的影响

经口给予不同剂量的内容物后，各组动物生长，活动正常，低、高剂量组动物增重高于模型对照组，且差异有显著性(p＜0.05).，见表1。

表1药物对D-半乳糖造模试验小鼠体重的影响

剂量(g/kg)	动物	造模后分组时	试验后	增重(g)	P值
						空白对照组	10	39.2±1.6	43.2±1.6	4.1±1.0	0.502
模型对照组	10	36.9±1.8	40.7±1.3	3.8±0.5	---
						0.30	10	36.5±1.6	41.2±1.9	4.7±1.0	0.040
0.60	10	36.7±1.9	41.3±1.8	4.6±0.8	0.078
						1.80	10	36.7±1.7	41.4±2.1	4.7±1.3	0.042

2.2对小鼠MDA/SOD/GSH-PX的影响

经口服给予不同剂量的样品后，中、高剂量组肝匀浆的MDA含量均低于模型对照组，且差异有显著性(p＜0.05)；低、高剂量组肝匀浆的SOD活力均高于模型对照组，且差异有显著性，p＜0.05；高剂量组肝匀浆的GSH-PX活力高于模型对照组，且差异有显著性。p＜0.05，见表2-4。

表2造模分组后MDA水平

剂量(g/kg)	动物	MDA(nmol/ml12％溶血液)	P值
				模型对照组	10	4.02±0.74	---
0.30	10	3.98±0.68	0.883
				0.60	10	3.99±0.64	0.868
1.80	10	3.97±0.65	0.839

表3对MDA、SOD的影响

剂量(g/kg)	动物	SOD	P值	MDA(nmol/ml匀浆液	P值
						空白对照组	10	53.62±5.82	0.001	12.40±1.09	0.000
模型对照组	10	43.88±4.89	-----	16.36±1.33	---
						0.30	10	50.08±5.52	0.009	15.93±1.63	0.587
0.60	10	46.75±4.81	0.210	14.13±1.74	0.003
						1.80	10	52.64±4.88	0.000	14.22±1.39	0.004

表4对GSH-PX的影响

剂量(g/kg)	动物	GSH-PX(U/mgprot)	P值
				空白对照组	10	181.6±18.6	0.017
模型对照组	10	159.7±18.7	---
				0.30	10	173.4±20.6	0.132
0.60	10	168.7±19.9	0.316
				1.80	10	180.7±20.3	0.023

3总结

在D-半乳糖造模动物试验中，经口服给予不同剂量的本发明的药物后，各组动物生长、活动正常，低、高剂量组动物增重高于正常对照组，且差异显著性。中高剂量组肝匀浆的MDA含量均低于模型对照组，且差异显著性；低高剂量组肝匀浆的SOD活力均高于模型对照组，且差异显著性；高剂量组肝匀浆的GSH-PX活力高于模型对照组，且差异显著性。因此本发明的药物具有抗氧化功能作用。

本发明保护的所有的药物及具体实施例中所涉及的组合物或制剂均具有抗氧化功能。

试验例3增强免疫力功能动物实验

1实验材料与方法

1.1样品：实施例一

1.2实验动物：18-22g雌性二级昆明种小鼠120只，由军科院提供

1.3剂量选择：

样品人体日推荐摄入量为3.6g/60kgBW，设三个剂量组，分别为0.30、0.6、1.80g/kg，BW，即分别相当于人体摄入量的5、10、30倍。样品内容物经过蒸馏水配置成溶液，均经口灌胃，灌胃量0.2ml/10g.BW，对照给予等量蒸馏水，每日一次，连续给予30填，末次给药后24小时测定各项指标。免疫一组40只小鼠，分为4组，每组10只，进行HC50测定、抗体生成细胞检测、迟发型变态反应；免疫二组40只小鼠，分为4组，每组10只，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞鸡红细胞实验，小鼠淋巴细胞转化实验，NK细胞活性测定实验，脏/体比值测定；免疫三组40只小鼠，每组10只，分为4组，进行碳廓清实验。

1.4仪器与试剂

游标卡尺、SRBC、微量注射器、无菌解剖器材、RPMT1640细胞培养液、刀豆蛋白、异丙醇、MTT、吸管、722型可分光光度计、离心机等。

1.5实验方法

1.5.1脏器/体重比值测定：

给药30天后，称取脾脏、胸腺，计算脏/体比。

1.5.2迟发型变态反应：

给药30天后，第25天腹腔注射2％SRBC、免疫4天后，测定左右后趾部厚度，同时在测量部位注射20％SRBCA20ul，24小时后再次测量。

1.5.3ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验：

给药30天，无菌取脾，制成担心包悬液，Hanks液洗3遍，调整细胞浓度为3×10⁶个/ml。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml。一孔加75ulConA液(100ug/ml)，另一孔为对照，置5％CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.4mml。加入0.7ml不含小牛血清的RPMT1640细胞培养液，同时加入MTT50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解后，可见分光光度计以75nm波长测定光密度值。

1.5.4半数溶血值的测定：

给药30天后，于第25天腹腔给药注射2％SRBC，免疫5天后，摘眼球收集血清，试管内加入250倍稀释的血清1ml、10％SRBC0.5ml，补体1ml，37度水浴20分钟，冰浴终止反应，离心，取上清液1ml，加都氏试剂3ml，10分钟后540nm比色。

1.5.5抗体生成细胞检测：

给药30天，于第25天腹腔注射2％SRBC，免疫5天后，脱臼处死，取脾，200目筛网过滤，用Hanks液洗3遍，每次100r/min离心10min，将细胞悬浮于5mlRPMT1640细胞培养液中。将表层培养基中加热溶解，45水浴保温，与等量2倍量浓度Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，加入50ul110％SRBC，20ul脾细胞悬液，混匀，倒片，二氧化碳培养箱中培养1h，加入用SA缓冲液稀释的补体(1∶10)，继续培养1小时，技术溶血空斑点。

1.5.6小鼠碳廓清试验：

给药30天后，尾静脉注射3.5倍稀释的印度墨汁，分别于第2、10分钟内吸取血20ul，加入到3ml1％碳酸钠溶液中，600nnm比色。另取肝疲称重，计算吞噬指数。

1.5.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：

给药30天后，每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔诸如生理盐水2ml。转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盘内，于30度孵箱中温育30min，生理盐水漂洗，晾干，以1∶1丙醇甲醇溶液固定，4％Giemsa染色3min，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬细胞数。

1.5.8NK细胞活性测定：

试验前24h将YAC-1细胞进行传代培养，用RPMT1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/ml.无菌取脾，制成单细胞悬液，Hanks液洗3次，调整细胞浓度为4×10⁷个/ml。取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中看靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100ul，均设三个复孔，于37度，5％二氧化碳培养箱中培养4h，每孔吸取上清液100ul，置平底96孔培养版中，同时加入LDH基液100ul，反应3min，每孔加入1mol/l的HCI30ul，在酶标仪493nm测定光密度值。

1.6结果统计：

试验数据用SPSS10.0进行统计检验，其中空白对照组与模型对照组采用T-检验，模型对照组与各剂量组采用方差分析及两两检验。如方差不齐者采用数据转换，转换后仍不齐则采用非参数统计。

2结果

2.1对小鼠体重的影响，见表5-8.

表5各组小鼠初期体重

剂量(g/kg)	动物	免疫一组体重(g)	免疫二组体重(g)	免疫三组体重(g)
					对照组	10	20.5±1.0	19.8±1.0	20.1±1.3
0.30	10	20.5±0.9	19.9±0.8	20.3±1.0
					0.60	10	20.5±0.9	19.7±1.0	19.9±1.0
1.80	10	20.2±0.9	19.8±1.0	20.0±0.9

表6各组小鼠中期体重

剂量(g/kg)	动物	免疫一组体重(g)	免疫二组体重(g)	免疫三组体重(g)
					对照组	10	26.7±1.7	26.2±2.0	27.4±2.2
0.30	10	26.6±1.7	25.8±1.8	27.4±2.1
					0.60	10	27.2±1.9	26.0±2.0	127.9±2.1
1.80	10	26.8±1.9	26.5±2.0	27.6±1.8

表7各组小鼠的结束体重

剂量(g/kg)	动物	免疫一组体重(g)	免疫二组体重(g)	免疫三组体重(g)
					对照组	10	33.5±2.0	33.0±2.1	34.7±2.6
0.30	10	33.5±1.5	32.9±1.9	34.5±2.0
					0.60	10	34.0±1.3	32.5±2.2	34.5±2.7
1.80	10	33.2±2.0	32.4±2.1	35.0±1.8

表8样品对小鼠体重增重的影响

剂量(g/kg)	动物	一组体重(g)	P值	二组体重(g)	P值	三组体重(g)	P值
								对照组	10	13.1±1.1	---	13.3±1.2	----	14.6±1.4	---
0.30	10	13.0±1.5	0.720	13.0±1.2	0.718	14.1±2.3	0.625
								0.60	10	13.5±1.3	0.786	12.8±1.5	0.505	14.6±2.1	0.973
1.80	10	13.0±2.2	0.875	12.6±2.4	0.387	15.0±2.0	0.657

由表5-8可知，经口给予不同剂量的样品后，各组动物生长活动良好，各组动物增重与对照组比较，差异无显著性。

2.2对小鼠脏器/体重比值的影响，见表9

表9对小鼠脏器/体重比值的影响

剂量(g/kg)	动物	胸腺/体重比值	P值	脾脏/体重比值	P值
						对照组	10	0.30±0.04	---	0.42±0.05	----
0.30	10	0.31±0.05	0.624	0.43±0.04	0.611
						0.60	10	0.33±0.06	0.183	0.45±0.05	0.151
1.80	10	0.33±0.06	0.200	0.46±0.07	0.122

由表9可见，各剂量组小鼠脾脏，胸腺/体重比值与对照组比较，差异均无显著性。

2.3对小鼠免疫功能的影响

2.3.1对小鼠迟发型变态反应的影响见表10

表10小鼠迟发型变态反应的影响

剂量(g/kg)	动物	攻击前后足趾厚度差值(mm)	P值
				对照组	10	0.39±0.11	---
0.30	10	0.42±0.14	0.634
				0.60	10	0.52±0.15	0.039
1.80	10	0.54±0.13	0.020

由表10可见，中、高剂量组小鼠攻击前后足趾厚度差异均高于对照组，且差异有显著性。

2.2.3对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响

表11对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响

剂量(g/kg)	动物	光密度差值	P值
				对照组	10	0.191±0.076	----
0.30	10	0.229±0.056	0.191
				0.60	10	0.211±0.054	0.491
1.80	10	0.227±0.063	0.217

由表11可见，各剂量组的光密度差值与对照组相比，差异均无显著性。

2.4对体液免疫的影响

2.4.1对小鼠半数溶血值的影响

表12对小鼠半数溶血值(HC50)的影响

剂量(g/kg)	动物	HC50	P值
				对照组	10	232.0±30.2	----

0.30	10	260.9±33.8	0.048
				0.60	10	255.8±34.8	0.101
1.80	10	271.9±27.0	0..008

由表12可见，低、高剂量组小鼠溶血值高于对照组，且差异有显著性。

2.4.2对小鼠抗体生成细胞试验的影响

表13对小鼠抗体生成细胞试验的影响

剂量(g/kg)	动物	溶血空斑数(×105/全脾)	P值
				对照组	10	52.4±16.6	----
0.30	10	56.4±17.7	0.594
				0.60	10	58.7±17.2	0.410
1.80	10	66.9±16.3	0.063

由表13可见，各剂量组小鼠抗体生成细胞与对照组相比，差异均无显著性。

2.5对单核-巨噬细胞功能的影响

2.5.1对小鼠碳廓清试验的影响

表14对小鼠碳廓清试验的影响

剂量(g/kg)	动物	吞噬指数(a)	P值
				对照组	10	4.81±0.63	----
0.30	10	5.19±0.71	0.194
				0.60	10	5.29±0.51	0.100
1.80	10	5.25±0.66	0.127

由表14可见，各剂量组小鼠的吞噬指数与对照组相比，差异无显著性。

2.5.2对小鼠腹腔巨噬细胞鸡红细胞试验的影响

表15对小鼠腹腔巨噬细胞鸡红细胞试验的影响

剂量(g/kg)	动物	吞噬指数(a)	P值	吞噬百分率(％)	P值
						对照组	10	0.23±0.05	----	19.7±4.9	----
0.30	10	0.24±0.05	0.851	21.3±4.4	0.427
						0.60	10	0.27±0.04	0.080	23.0±4.4	0.106
1.80	10	0.27±0.05	0.138	21.1±4.1	0.487

由表15可见，各剂量组的吞噬百分率及吞噬指数与对照组相比，差异均无显著性。

2.6NK细胞活性的影响

表16对小鼠NK细胞活性的影响

剂量(g/kg)	动物	NK细胞活性(％)	P值
				对照组	10	22.6±5.6	----
0.30	10	22.9±5.9	0.929
				0.60	10	28.4±5.6	0.030
1.80	10	28.2±5.9	0.038

由表16可见，中、高剂量NK细胞活性均高于对照组，且差异有显著性。

3、总结

经口给予不同剂量的样品30天后，各组动物生产活动正常，迟发型变态反应中，中、高剂量组小鼠攻击前后足趾厚度均高于对照组，且差异有显著性；小鼠半数溶血值测定中，低、高剂量组小鼠半数溶血值高于对照组，且差异有显著性；NK细胞活性测定中，中、高剂量组NK细胞活性均高于对照组，且差异有显著性。其它各项试验均未见免疫抑制现象，试验结果表明本发明的组合物具有增强免疫力功能的作用。

本发明权利要求书保护的所有组合物及实施例中涉及的制剂均具有上述增强免疫力功能的作用。

为了更好的了解本发明，下面通过具体实施例方式来说明，但其并不是对本发明保护范围的限定，同时可以对这些实施方案进行多种变化和修饰。

具体实施方式

实施例1

丹参300g、三七药材60g混合加水煎煮两次，每次加入药材总重7倍的水，每次回流提取2小时，合并提取液(其中丹参素总量为3735mg)，提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)。浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤后加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa。真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，其中丹参素总量为986.4mg。

取黄芪药材600g加水煎煮两次，每次加入药材重量6倍的水，第一次回流提取2小时，第二次回流提取1小时，合并提取液，滤过。提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为60％，静置12h。取上清液过滤；滤液加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30(50～60℃)，得黄芪浸膏，进入30万级洁净区，密封，备用。

黄芪浸膏、丹参三七浸膏加水至稀浸膏比重1.15～1.18(50～60℃)。过筛与糊精300g喷雾制粒，装胶囊，制成1000粒。0.4克/粒。丹参素含量为167mg/100g每日3次，每次3粒。相当于每天服用丹参药材2.7克，黄芪药材5.4克，三七药材0.54克，用量低于药典服用量。

实施例2

取丹参300g、三七60g混合加5倍量水煎煮1次，每次回流提取1小时，合并提取液(其中丹参素总量为3963mg)，提取液过滤真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)后加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，其中丹参素总量为491.2mg。

取黄芪药材加6倍量水煎煮3次，第一次回流提取2小时，第二次回流提取1小时，合并提取液，滤过。提取液过滤后真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30，得黄芪浸膏，密封，备用。

黄芪浸膏、丹参三七浸膏加水至稀浸膏比重1.15～1.18(50～60℃)。过筛与糊精300g喷雾制粒，装胶囊，制成1000粒。0.4克/粒。丹参素含量为83mg/100g。

实施例3

取丹参300g、三七60g混合加6倍量水煎煮3次，每次回流提取1.5小时，合并提取液(其中丹参素总量为3963mg)，提取液过滤真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)后加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，其中丹参素总量为1046.6mg。

取黄芪药材加6倍量水煎煮3次，第一次回流提取2小时，第二次回流提取1小时，合并提取液，滤过。提取液过滤后真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30，得黄芪浸膏，密封，备用。

黄芪浸膏、丹参三七浸膏加水至稀浸膏比重1.15～1.18(50～60℃)。过筛与糊精300g喷雾制粒，装胶囊，制成1000粒，0.4克/粒。丹参素含量为177.1mg/100g。

实施例4

取丹参300g、三七60g混合加7倍量水煎煮2次，每次回流提取2小时，合并提取液(其中丹参素总量为3735mg)，提取液过滤真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)后加入95％乙醇，至醇浓度为65％，静置12h。取上清液过滤真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，其中丹参素总量为518.4mg。

取黄芪药材加6倍量45％乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二次1小时，合并提取液，滤过。提取液过滤后真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为60％，静置12h。取上清液过滤，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30，得黄芪浸膏，密封，备用。

黄芪浸膏、丹参三七浸膏加水至稀浸膏比重1.15～1.18(50～60℃)。过筛与聚乙二醇300g，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸10000丸。40mg/丸。丹参素含量为177.1mg/100g。

实施例5

取丹参300g、三七60g混合加7倍量水煎煮2次，每次回流提取2小时，合并提取液(其中丹参素总量为3735mg)，提取液过滤真空减压浓缩至相对密度1.10～1.20(50～60℃)后加入95％乙醇，至醇浓度为75％，静置12h。取上清液过滤真空减压浓缩至相对密度1.30～1.38(50～60℃)，得丹参三七浸膏，其中丹参素总量为873mg。

取黄芪药材加6倍量95％乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二次1小时，合并提取液，滤过。提取液过滤后真空减压浓缩至相对密度1.05～1.20(50～60℃)，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h。取上清液过滤，真空减压浓缩至相对密度1.22～1.30，得黄芪浸膏，密封，备用。

黄芪浸膏、丹参三七浸膏加水至稀浸膏比重1.15～1.18(50～60℃)。过筛与聚乙二醇300g，混合均匀，熔融，上滴丸机，制成滴丸10000丸。40mg/丸。丹参素含量为177.1mg/100g。

实施例6

取丹参100g、黄芪700g、三七25g组成混合物，按照实施例1的制备方法制得混合浸膏后再与甘露醇90克、EDTA15克和蒸馏水15ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装1000支。

实施例7

取丹参800g、黄芪1300g，三七200g组合物，按照实施例1的制备方法制得混合浸膏后，与加入5％交联聚维酮，0.1％的硬脂酸镁，50％的微晶纤维素，用适量乙醇溶液制成软材，制粒，60℃鼓风干燥，制粒，整粒，压制成片，即得口腔崩解片。

实施例8

取丹参40g、黄芪110g、三七10g的组合物，按照实施例1中的制备方法制得混合浸膏，再与适量的淀粉，微晶纤维素、硬脂酸镁等混合均匀后，湿法制粒，压片即得。

实施例9

取丹参600g、黄芪900g、三七200g的组合物，按照实施例1中的制备方法制得混合浸膏，再与550g糊精混合均匀后，喷雾制粒，即得颗粒剂。

Claims (2)

1.一种中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)取重量份的原料药丹参2-8份、黄芪7-13份、三七0.5-2份备用； 

(2)丹参、三七浸膏提取； 

(3)黄芪浸膏提取； 

(4)丹参、三七、黄芪浸膏混合均匀即得组合物 ，

步骤(2)中所述丹参、三七浸膏的方法如下：a、取符合2005年版药典相关规定的丹参、三七为原料，丹参药材切制成饮片；三七粉碎成0.2-0.5cm左右的粗颗粒；b、丹参、三七药材混合加水煎煮两次，每次加入药材总重7倍的水，每次回流提取2小时，合并提取液，滤过；c、提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至50～60℃相对密度1.10～1.20，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为70％，静置12h，取上清液过滤；d、上清液过滤后加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，真空减压浓缩至50～60℃相对密度1.30～1.38，得丹参三七浸膏，进入30万级洁净区，密封，备用； 

所述步骤(3)黄芪浸膏的提取方法：取符合2005年版药典相关规定的黄芪药材为原料，切制成饮片；加水煎煮两次，每次加入药材重量6倍的水，第一次回流提取2小时，第二次回流提取1小时，合并提取液，滤过 ；提取液过滤后加入浓缩罐，真空减压浓缩至相对密度50～60℃1.05～1.20 ，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa；浓缩液加入95％乙醇，至醇浓度为60％，静置12h，取上清液过滤；上清液加入浓缩罐，加热温度75～80℃，真空度0.06～0.1Mpa，真空减压浓缩至50～60℃相对密度1.22～1.30，得黄芪浸膏，进入30万级洁净区，密封，备用。 

2.如权利要求1所述的一种中药组合物制备方法，其特征在于：步骤(1)取重量份原料药丹参4-6份，黄芪9-11份、三七1-2份。 

3 、如权利要求2所述的一种中药组合物制备方法，其特征在于：步骤( 1)取重量份原料药丹参5份、黄芪10份、三七1份组成。