发明内容
本发明的一个目的在于公开了一种从中药材黄芪和当归中提取有效部位黄芪多糖和当归多糖组成的有效部位群,以便使该有效部位群作为药物的主要成分用于肿瘤疾病的辅助治疗,提高机体免疫力,改善患者生存质量。
本发明另一个目的在于公开了黄芪多糖和当归多糖组成的有效部位群在用于制备治疗肺癌、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肝癌腹水、宫颈癌药物中的应用。
本发明再一个目的在于公开黄芪多糖和当归多糖组成的有效部位群与一种或一种以上药学上可接受的载体组成的药物组合物。
本发明还一个目的在于公开了从黄芪、当归二味药物中提取黄芪多糖和当归多糖的制备方法。
下面的详细描述将有助于进一步理解本发明。
除另有说明外,本说明书的部分术语的定义如下:
2005年版《中华人民共和国药典》规定黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.的干燥根。其性甘、微温,入肺、脾经,具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功效。本发明在使用时可以将其切片或粗粉以便于提取。
2005年版《中华人民共和国药典》规定当归为伞形科植物当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。性味甘、辛、温;归肝、心、脾经。具有补血、活血、化瘀、调经止痛、润肠通便、扶正固本之功效。是极常用的中药,据资料统计发现,在25种使用频率最高的中药中,当归位列第八,我国医药界早有“十方九归”之说,《神农本草经》列入中品,《本草纲目》列入芳草类。在中医处方成药中出现频度甚高。用途非常广泛,临床效果十分显著,历代医家皆称其为“圣药”。本发明在使用时可以将其切片或粗粉以便于提取。
黄芪多糖是指按本说明书所述方法从黄芪原药材中提取获得的多糖类物质组成的总多糖,并且其中多糖含量大于提取物总量的50%(w/w)。黄芪多糖是黄芪主要的活性物质,大量体内外实验及临床研究表明,黄芪多糖可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能,增强吞噬细胞的吞噬功能,而且还具有强心降压、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化等多种药理功效。
当归多糖是指按本说明书所述方法从黄芪原药材中提取获得的多糖类物质组成的总多糖,并且其中多糖含量大于提取物总量的50%(w/w)。现代药理研究表明当归多糖具有丰富的生物活性,对非特异性免疫功能、体液免疫功能和细胞免疫功能均有较强的促进作用,而且还具有抗肿瘤、补体活化、抗氧化、抗肝肺损伤、抗放射性损伤和促进胃溃疡愈合等。
有效部位群是指从中药材黄芪和当归中提取的黄芪多糖和当归多糖的组合物,该组合物中有效部位的实际含量之和大于总提取物的50%以上。此外,有效部位群还包括上述多糖类化合物中加入从上述二味药材中提取分离出来的同类型纯品或化学合成的纯品按照后文描述的比例范围组成的组合物。所有这些有效部位以及组合后的有效部位群均可以通过高效液相分析法、紫外分析法、薄层分析法等现代分析方法,进行可靠的定性定量分析检测,控制其含量,弥补了目前中药复方制剂科技含量较低,有效成分含量低或不明确,质量难以控制等不足。
本发明的技术方案通过以下内容予以实现:
一种抗肿瘤辅助用药的有效部位组合物,其特征在于包括从中药材黄芪和当归中提取有效部位组合成有效部位群,以及生理学上可接受的药用赋形,其中有效部位群为黄芪多糖和当归多糖,两种成分的实际含量之和大于总提取物的50%以上。
本发明药物所用有效部位群中黄芪多糖和当归多糖的质量配比可以为黄芪多糖1份,当归多糖0.1~10份。优选质量配比为黄芪多糖1份,当归多糖0.2~5份。更优选重量配比为黄芪多糖1份,当归多糖0.4~2份。最佳质量配比为黄芪多糖1份,当归多糖1份。
本发明所用有效部位群中黄芪多糖和当归多糖的制备方法,其特征在于:分别取当归、黄芪药材,用水或乙醇于40℃~90℃提取,浓缩或回收乙醇后的提取液加乙醇置含醇量为50%~90%后静置,离心,取沉淀加蒸馏水溶解,加入三氯乙酸-正丁醇液除蛋白,离心,上清液用NaOH溶液调pH4.0~9.0,离心,上清液加乙醇置含醇量为50%~90%后静置,离心,取沉淀用蒸馏水溶解,离心,上清液用膜超滤,浓缩,冷冻干燥,即得当归多糖、黄芪多糖,含量大于总提取物的50%以上与药用辅料混合,按常规方法制成各种剂型。例如普通片、缓释片、控释片、分散片、口腔崩解片、咀嚼片、口含片、丸剂、滴丸、颗粒剂、胶囊、软胶囊、滴丸、糖浆、乳剂、口服液、粉针、注射剂或输液剂中任何一种药物剂型。再例如采用一般方法将黄芪多糖和当归多糖均匀混合后,与任何一种或一种以上药剂学上辅料如葡萄糖、甘露醇、木糖醇、甘氨酸等混合制成注射液、输液、粉针等等。本发明中的有效部位组合物制成注射剂、粉针剂,其所含有效部位的实际含量之和最好在总提取物的80%以上。目前,单味的当归多糖和黄芪多糖已应用于临床,在抑制肿瘤方面作用确切,然而,以当归和黄芪单独用药,难以发挥中药君臣佐使,整体观念,协同配合的优势,正是鉴于此,我们开发出新一代肿瘤辅助用药——以有效部位黄芪多糖和当归多糖组成有效部位群,以该有效部位群作为药物的主要成分制成适宜的制剂,用于肿瘤疾病的辅助治疗,与常规抗肿瘤药物联用例如环磷酰胺、阿霉素或紫杉醇等药效学实验显示,不同配比对环磷酰胺、顺铂增效显著,对氟尿嘧啶具有一定的增效趋势,提示不同配比对抗肿瘤化疗药可能具有广谱增效作用。本发明的组合物很好地利用了中药传统理念,既保留了中医药对肿瘤疾病综合治疗的特点,同时发挥抗癌祛邪和扶正培本的功效,把中药的发展提高到有效部位的高度,为中药的发展提供了新的发展空间和模式,是创新药物与中药现代化必由之路。
上述有效部位群中当归多糖、黄芪多糖含量测定如下:
黄芪多糖的含量测定(分光光度法)
①仪器与试药
UV-1601型可见紫外分光光度计(日本岛津);AB-104型电子分析天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司生产)。葡萄糖(分析纯,天津市化学试剂一厂);苯酚(分析纯,天津市化学试剂一厂);硫酸(分析纯,天津市化学试剂三厂),其它试剂均为分析纯。
②样品的测定
对照品溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖约100mg于100mL量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度,吸取此溶液10mL置于100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,制成浓度为100μg·mL-1的标准葡萄糖溶液。
苯酚试剂的配制:取苯酚100g,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,蒸馏,收集182℃馏分,称取此馏分5g,加95mL水溶解,置棕色瓶中存冰箱备用。
标准曲线的制备:精密吸取标准葡萄糖溶液0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL于10mL具塞试管中,补加蒸馏水至2mL;另精密吸取蒸馏水2mL作空白对照,分别加入5%苯酚溶液1mL,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0mL,即刻摇匀,室温静置20min,于分光光度计490nm处测定吸收度。以吸收度A为纵坐标,葡萄糖浓度C为横坐标绘制标准曲线,可得回归方程:A=0.01436C+0.01973,r=0.9995(n=6)。葡萄糖浓度在10~60μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。
供试液溶液的制备:精密称定60℃干燥至恒重的本品约100mg,加少量蒸馏水,微热使其全部溶解后,置250mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,备用。
供试液溶液的测定:分别取0.2mL黄芪多糖供试液,以“标准曲线”项下操作测定A值,由标准曲线计算供试液中黄芪多糖相当于葡萄糖的含量。
上述当归多糖的含量测定(分光光度法)
①仪器与试药
UV-1601型可见紫外分光光度计(日本岛津);AB-104型电子分析天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司生产)。葡萄糖(分析纯,天津市化学试剂一厂);苯酚(分析纯,天津市化学试剂一厂);硫酸(分析纯,天津市化学试剂三厂);葡萄糖醛酸(国药集团化学试剂有限公司);间羟基联苯(Fluka),其它试剂均为分析纯。
②样品的测定
糖醛酸的含量测定
溶液配制:硫酸-硼酸盐溶液(A液):称取四硼酸钠1.91g,溶于400ml浓硫酸中;0.15%间羟基联苯溶液(B液):150mg间羟基联苯溶于0.5%NaOH溶液中,定容至100ml;葡萄糖醛酸(GlcA)贮备液的配制:精密称取105℃干燥至恒重的GlcA50mg,于100ml容量瓶中定容,作贮备液。
GlcA标准曲线的制备:精密吸取GlcA储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,于50ml容量瓶中定容,得GlcA浓度分别为10、20、30、40、50、60μg·mL-1的GlcA标准溶液。分别取GlcA标准溶液0.5ml加入试管中(n=2),冰水浴10min后,分别加入4.5ml硫酸-硼酸盐溶液,继续冷却,充分振荡;将试管置于100℃水浴上加热10min,然后立即放入冰水浴至冷;加入0.05ml 0.15%间羟基联苯溶液,充分振荡,显色,超声除去气泡,静置20min,以0.5mL水同上制得空白液调零,在525nm处测定吸光度。以GlcA浓度对吸光度做图制备标准曲线,得回归方程为A2=0.01246C-0.0022,r=0.9999,葡萄糖醛酸浓度在10-60μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。
供试液溶液的制备:精密称定60℃干燥至恒重的本品约5mg,加少量蒸馏水,微热使其全部溶解后,置100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,备用。
供试液溶液的测定:取0.5mL当归多糖供试液,以“标准曲线”项下操作测定A值,由标准曲线计算供试液中当归多糖的糖醛酸含量
中性糖的含量测定
对照品溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖约100mg于100mL量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度,吸取此溶液10mL置于100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,制成浓度为100μg mL-1的标准葡萄糖溶液。
苯酚试剂的配制:取苯酚100g,加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,蒸馏,收集182℃馏分,称取此馏分5g,加95mL水溶解,置棕色瓶中存冰箱备用。
葡萄糖标准曲线的制备:精密吸取标准葡萄糖溶液0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL于10mL具塞试管中,补加蒸馏水至2mL;另精密吸取蒸馏水2mL作空白对照,分别加入5%苯酚溶液1mL,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0mL,即刻摇匀,室温静置20min,于分光光度计490nm处测定吸收度。以吸收度A2为纵坐标,葡萄糖浓度C为横坐标绘制标准曲线,可得回归方程:A2=0.01436C+0.01973,r=0.9995(n=6)。葡萄糖浓度在10~60μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。
供试液溶液的制备:精密称定60℃干燥至恒重的本品约14.9mg,加少量蒸馏水,微热使其全部溶解后,置100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,备用。
GlcA的苯酚-硫酸法标准曲线(糖醛酸的干扰标准曲线)精密吸取GlcA浓度分别为10、20、30、40、50、60μg·mL-1的GlcA标准溶液2.0mL于10mL具塞试管中,另精密吸取蒸馏水2.0mL作空白对照,分别加入5%苯酚溶液1mL,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0mL,即刻摇匀,室温静置20min,于分光光度计490nm处测定吸收度。以吸收度A3为纵坐标,GlcA浓度C为横坐标绘制标准曲线,可得回归方程:A3=0.00811C-0.0247,r=0.9991(n=6)。GlcA浓度在10~60μg·mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。
供试液溶液的测定:取2.0mL当归多糖供试液,以“葡萄糖标准曲线”项下操作测定A2值,样品测定的吸光度A2减去样品中糖醛酸对苯酚-硫酸法的干扰值A3,即为样品中中性糖含量的吸光度A。即A=A2-A3,所得A经葡萄糖的苯酚-硫酸法标准曲线公式计算得中性糖含量。总糖含量=中性糖含量+糖醛酸含量
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)提供一种从中药材黄芪和当归中提取有效部位黄芪多糖和当归多糖组成的有效部位群,以药物的主要成分生产加工成为适宜的药物制剂作为肿瘤辅助用药,比单用同剂量的黄芪多糖或单用同剂量的当归多糖效果均大大提高,经药效学试验证明其疗效显著。
(2)本发明中的有效部位群由于其资源充足,成本相对低廉,易于产业化,可根据需要制成各种剂型,为临床提供更加方便、更加有效、质量更加可控的现代中药,为患者带来更多的利益,从而产生巨大的社会效益。
(3)本发明药物用于肿瘤疾病的辅助治疗,提高机体免疫力,改善恶病质提高患者生存质量,降低抗肿瘤药物对其他器官或系统的毒副作用。与常规抗肿瘤药物联用时,常规抗肿瘤药物包括但不局限于环磷酰胺、阿霉素、紫杉醇等;肿瘤疾病包括但不局限于肺癌、肝癌、胃肠癌、乳腺癌等。
本发明进一步公开了药物组合物在制备治疗肺癌、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肝癌腹水、宫颈癌药物中的应用,下面通过药效学试验进一步证明本发明的积极效果:
本发明设计了黄芪多糖、当归多糖及两者的不同配比样品灌胃给予进行如下试验:
1.抗癌试验:小鼠腋下接种肿瘤S180(实体)、Hep S(肝癌实体)、U14,观察其对肿瘤的抑制作用。
2.减毒作用:观察对环磷酰胺所致小鼠白细胞数量及骨髓有核细胞数量减少的保护作用。
3.对免疫功能的影响:观察其对荷瘤小鼠、正常小鼠的碳粒廓清功能的影响,以及对荷瘤小鼠的迟发型超敏反应(T细胞免疫)的影响。
结果表明,本品有显著的抑瘤作用,对化疗药物有显著的增效、减毒作用,并能够促进荷瘤动物的细胞免疫。
(一)试验材料
1.受试样品
黄芪多糖:浅黄色粉末,批号060501。
当归多糖:浅黄色粉末,批号060501。
使用时以生理盐水配制成所需浓度的混悬液供动物灌胃给药。
2.药品与试剂
①氯化钠注射液(生理盐水):安瓿装,10ml/支,天津市氨基酸公司人民制药厂产品,产品批号:20040213。用于肿瘤细胞接种和对照组给药。
②环磷酰胺:安瓿装粉针剂,200mg/支,上海华联制药有限公司产品,产品批号:040502。
③顺铂注射液:30mg/支,云南生物谷灯盏花药业有限公司产品,产品批号:20040701。
④氟尿嘧啶注射液:250mg/安瓿,天津金耀氨基酸有限公司产品,产品批号:0501171。
上述实验药品使用时均以生理盐水配制成所需浓度的药液,环磷酰胺用前新鲜配制,配制后1小时内完成注射。顺铂和氟尿嘧啶配制后4℃冰箱保存备用。
⑤维血宁颗粒(无糖型):颗粒剂,常州九鼎制药有限公司产品,产品批号030706。使用时以生理盐水配制成所需浓度的混悬液供动物灌胃给药,配制后4℃冰箱保存,给药时摇匀。
⑥贞芪扶正胶囊:胶囊剂,甘肃三药药业集团有限责任公司产品,批号:20050107。使用时将胶囊中粉末状物取出,配制成浓度2.08g生药/ml。
⑦印度墨汁:北京中预卫科生物工程公司产品,批号20040204。
⑧2,4-二硝基氯苯(DNCB):天津试剂一厂,使用时配制成1%及5%的丙酮麻油溶液。
3.实验动物
昆明种(KM)小鼠(2级),雌雄兼用,购自北京大学医学部实验动物科学部,实验动物合格证编号:0042173。
4.动物肿瘤
动物肿瘤瘤源S180(肉瘤180)、HepA(肝癌腹水)、U14(宫颈癌14)均由天津药物院中心瘤源室传代保存。
(二)实验方法与结果
1.不同配比对小鼠肿瘤(S180、HepS、U14)生长的抑制作用
①试验方法
肿瘤接种:按照文献方法进行。取接种肿瘤7~10天状态良好的荷瘤(腹水型)动物,常规消毒后抽取少量腹水,推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤细胞数不少于75%后将腹水抽出,以腹水与生理盐水之比为1∶4比例稀释,制备成接种用的肿瘤细胞混悬液。肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。吸取上述制备的肿瘤细胞混悬液0.2ml接种于小鼠右侧腋窝皮下,从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。
分组及给药:肿瘤细胞接种后24小时动物随机分组,每组动物数量为10~12只不等。实验分组为:生理盐水对照组(NS组)、阳性药物(环磷酰胺)对照组、黄芪多糖(配比10∶0)、样品1(配比10∶1)、样品2(配比10∶2)、样品3(配比5∶5)、样品4(配比2∶10)、样品5(配比1∶10)、当归多糖(配比0∶10),随即受试药组按0.25g/Kg剂量灌胃给药,给药容积均为0.4ml/20g;NS组,灌胃相应容积的生理盐水,阳性药物(环磷酰胺)对照组,腹腔注射环磷酰胺50mg/kg(0.4ml/20g);上述药物除环磷酰胺给药1次外,配比样品每日给药1次,连续8天。
疗效评价:末次给药后24小时,处死动物,称体重,解剖并取出肿瘤组织,称取肿瘤重量,以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果,计算公式为:肿瘤生长抑制率=(1-T/C)×100%,式中T为给药组平均瘤重,C为对照组平均瘤重。
②试验结果
实验结果显示,3次实验中配比样品组三种肿瘤的平均瘤重均明显小于对照组,统计学检验有显著性差异。结果表明配比样品组对小鼠肿瘤S180、HepS及U14的生长确有显著的抑制作用,配比样品组比单用同剂量的黄芪多糖或单用同剂量的当归多糖效果好。
2.不同配比的抗癌增效作用
试验方法
肿瘤接种:按照文献方法进行。取接种肿瘤7~10天状态良好的荷瘤HepA(肝癌腹水)动物,常规消毒后抽取少量腹水,推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤细胞数不少于75%后将腹水抽出,以腹水与生理盐水之比为1∶4比例稀释,制备成接种用的肿瘤细胞混悬液。肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下(超净工作台中)完成。吸取上述制备的肿瘤细胞混悬液0.2ml接种于小鼠右侧腋窝皮下,从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。
①环磷酰胺增效实验:
肿瘤细胞接种后24小时,动物随机分组,每组动物数量为10~14只不等。实验分组为:生理盐水对照组(NS组)、环磷酰胺80mg/kg组、环磷酰胺40mg/kg组、环磷酰胺20mg/kg组、环磷酰胺40mg/kg合用不同配比0.25g/kg组及环磷酰胺20mg/kg合用不同配比0.25g/kg组。分组后随即给药(即肿瘤接种后24小时),环磷酰胺为腹腔注射给药,不同配比为灌胃给药,环磷酰胺给药1次,不同配比每日给药1次,连续8天。
②顺铂增效实验:
肿瘤细胞接种后24小时,动物随机分组,每组动物数量为10~14只不等。实验分组为:生理盐水对照组(NS组)、顺铂2mg/kg×2d组、顺铂2mg/kg组、顺铂1mg/kg组、顺铂2mg/kg合用不同配比0.25g/kg组及顺铂1mg/kg合用不同配比0.25g/kg组。分组后随即给药(即肿瘤接种后24小时),顺铂腹腔注射,不同配比灌胃给药。除顺铂2mg/kg×2d组外顺铂均给药1次,顺铂2mg/kg×2d组第2次给药在第1次给药后72小时,不同配比给药同环磷酰胺增效实验。
③氟尿嘧啶增效实验:
肿瘤细胞接种后24小时,动物随机分组,每组动物数量为10~14只不等。实验分组为:生理盐水对照组(NS组)、氟尿嘧啶40mg/kg×4d组、氟尿嘧啶25mg/kg×4组、氟尿嘧啶15mg/kg×4d组、氟尿嘧啶25mg/kg×4d合用不同配比0.25g/kg组、氟尿嘧啶15mg/kg×4d合用不同配比25mg/kg组。分组后随即给药(即肿瘤接种后24小时),氟尿嘧啶腹腔注射给药,1次/日,连续4天。不同配比给药同前。
疗效评价:末次给药后24小时,处死动物,称取体重,解剖并取出肿瘤组织,称取肿瘤重量,以肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果,计算公式为:肿瘤生长抑制率=(1-T/B)×100%,式中T为给药组平均瘤重,C为对照组平均瘤重。
结论:不同配比对环磷酰胺、顺铂增效显著,对氟尿嘧啶具有一定的增效趋势,提示不同配比对抗肿瘤化疗药可能具有广谱增效作用。
3.不同配比减毒作用
试验方法
将动物随机分为6组,即生理盐水对照组、环磷酰胺对照组、环磷酰胺合用维血宁颗粒(阳性对照药)组以及环磷酰胺合用不同配比组。不同配比组灌胃给予0.25g/kg;维血宁颗粒灌胃给药4.8g/kg(人用剂量的02倍,相当于人的等效剂量),均1次/日,连续9日,环磷酰胺,腹腔注射,100mg/kg,1次/日,连续2日,在上述药物给药后第8、9日给入。末次环磷酰胺给药后24小时,动物眼眶静脉丛取血做白细胞计数测定,而后处死动物,剖取右侧股骨,获取骨髓细胞涂片,做骨髓有核细胞计数。白细胞及骨髓有核细胞计数采取显微镜计数法。
试验结果:在环磷酰胺的作用下动物的白细胞计数和骨髓有核细胞计数明显减少,说明造模成功。动物给予不同配比组后对动物骨髓有核细胞的减少没有影响,但对白细胞数量的减少有明显的保护作用。结论:不同配比组小鼠灌胃给药对因腹腔注射环磷酰胺所致白细胞减少的毒性反应有显著的保护作用。
4.不同配比对正常小鼠及荷瘤小鼠的碳粒廓清功能的影响
试验方法
荷瘤动物组先进行肿瘤接种:以1∶4稀释之肝癌腹水(HepA)0.2ll(相当于5×106个细胞)接种于每鼠腹腔。接种后24小时随机分组,每组10只。正常动物组亦同时分组:空白对照组,不接种肿瘤,不给任何药物。荷瘤对照组,接种肿瘤,不给药物。贞芪扶正胶囊,为阳性药荷瘤对照组。不荷瘤不同配比给药组。荷瘤不同配比给药组。各给药组在接种肝癌腹水后次日即开始给药,各组均每日给药一次,连续给药8日。各组小鼠在末次给药后24小时,于静脉注射印度墨汁(按1∶3稀释)0.1ml/10g,在注入墨汁后2分钟及10分钟从小鼠眼眶球后静脉丛取血0.025ml,立刻吹入0.1%Na2CO3液2ml中,以分光光度计(λ=650nm)比色,记录OD值,以下列公式计算吞噬指数K值和吞噬系数(校正吞噬指数)α值。取血后处死动物取肝、脾称重。
实验结果:以吞噬指数K及吞噬系数α值为评价指标,阳性对照药贞芪扶正胶囊及不同配比组对荷瘤小鼠以及正常小鼠均无明显的促进碳粒廓清的作用,表明不同配比组对正常小鼠及荷瘤(HepA)小鼠的碳粒廓清功能无明显影响。
5.不同配比对荷瘤小鼠迟发超敏反应(DTH)的影响
试验方法
分组及肿瘤接种:以1∶4稀释之肝癌腹水0.2ml(相当于5×106个细胞)接种于每鼠腹腔。接种后24小时随机分组:荷瘤对照组;贞芪扶正胶囊(阳性药对照组);不同配比组。给药各组小鼠在肿瘤接种后次日开始给药,剂量为贞芪扶正胶囊8.33g/kg,不同配比组0.25g/kg,每日一次,连续给药8日。各组小鼠首次给药后24小时于颈背部皮下注射5%DNCB丙酮麻油溶液0.02ml/只致敏。在末次给药后半小时以1%DNCB丙酮麻油溶液0.05ml/只均匀涂于小鼠左耳耳壳。
试验观测指标:
(1)存活情况:每日观察动物存活情况即一般状况,记录死亡数及时间。
(2)耳片肿胀度:各组小鼠左耳片攻击后24小时处死动物剪下左右耳壳以直径7mm打孔器取下圆形耳片,以电子天平称重,其左右耳片重量之差即为肿胀度(mg),为DTH的主要观察指标。
(3)脾指数:各组小鼠处死后取脾脏,电子天平称重,以每10g体重之脾脏重量作为脾指数(mg/10g)。
(4)胸腺指数:各组小鼠处死后取胸腺,以每10g体重之胸腺重量作为胸腺指数(mg/10g)。
试验结果:耳壳肿胀程度表示了细胞免疫反应的能力,肿胀程度高说明免疫细胞具有更好的功能。不同配比组动物耳壳的肿胀程度均高于生理盐水对照组。其中样品组(1∶1)统计学处理经t检验有显著性差异。结论:不同配比组灌胃给药对荷瘤小鼠的T细胞免疫功能具有增强作用。