CN101323872A - 一种降血糖红芪杂多糖及其提取分离工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种降血糖红芪多糖的分离工艺及其组成，将红芪药材用药材体积5～18倍量的水，30℃～100℃提取1～5次，每次提取0.5～3.0小时，合并水溶液，浓缩至体积为药材的1～5倍；向浓缩液中加乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀1；向滤液中再加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀2；向滤液中继续加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀3；然后将所得沉淀1、2、3分别干燥，纯化得到红芪多糖I，II，III。大量实验证明，本发明的红芪多糖3对实验性糖尿病小鼠和大鼠具有显著的降血糖作用。

Description

一种降血糖红芪杂多糖及其提取分离工艺

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种植物多糖的提取分离方法，尤其涉及一种降血糖红芪多糖的提取分离工艺；同时还涉及该分离纯化的红芪多糖的组成。

背景技术

红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedyssarum polybotrys Hand-Mazz)的干燥根，是我国独特品种，甘肃著名特产。以前中国药典将红芪列在黄芪项下，生产中成药时可用红芪代替黄芪。1985年版药典将红芪单列，红芪不能代替黄芪使用。由于红芪在中药处方中的应用较少，限制了红芪在医药中的应用。据记载，红芪具有补气固表，利尿脱毒，排脓，敛疮生肌等多种功效，用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，痈疽难溃，血虚萎黄，内热消渴等的治疗。现代医学研究表明，红芪多糖对慢性肾炎及蛋白尿也有一定的治疗作用。

国内对红芪多糖的研究主要是总多糖药效学研究，如增强细胞免疫功能的作用，抗衰老作用，试验性肝损伤的保护作用。1997年兰州大学的刘方明从红芪中提取分离出一种均多糖-葡聚糖，其提取方法是：用水在100℃提取4小时，过滤，滤液浓缩，用sevage法除蛋白后，水溶液用3倍量的乙醇沉淀，然后将沉淀溶解于水中，用Sephadex G-200柱层析纯化红芪多糖，得到3种不同分子量的红芪均多糖。

甘肃中医学院学报，2007年01期发表的《红芪多糖对实验性T2DM大鼠胰岛素抵抗和C肽分泌作用的研究》一文中指出，红芪均多糖可明显降低血糖，有效控制体重，改善2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗。中国中医药信息杂志，2007年05期刊登了《红芪多糖对改善2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗的影响》，文中指出，红芪多糖可通过多途径多环节减轻糖尿病模型大鼠的胰岛素抵抗。

发明内容

本发明的目的是提供一种降血糖红芪杂多糖的提取分离工艺。

本发明的另一目的是提供该提取分离的降血糖红芪杂多糖的组成。

一、红芪杂多糖的分离纯化

本发明红芪杂多糖的分离纯化工艺，包括以下工艺步骤：

(1)红芪杂多糖的分离

将红芪药材用药材体积5～18倍量的水，30℃～100℃提取1～5次，每次提取0.5～3.0小时，合并水溶液，浓缩至体积为药材的1～5倍；向浓缩液中加乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀1；向滤液中再加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀2；向滤液中继续加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀3；然后将所得沉淀1、2、3干燥，分别得红芪多糖1，红芪多糖2，红芪多糖3。红芪多糖1，2，3的含量都在50％以上。上述干燥可采用冷冻干燥、或喷雾干燥、或40℃～100℃下真空干燥、常压干燥。

为了除去药材中的杂质，红芪药材在水提取前，先用乙醇浸泡0-24小时，然后回流1-12小时，过滤，将药渣除去残留的乙醇后，再用水提取多糖。

本发明采用先分离(红芪多糖含量高，一般在50％以上)，后纯化的工艺，节约成本，并适合于工业化生产。

(2)红芪杂多糖的纯化

红芪多糖1，2，3除蛋白和色素：红芪多糖1，2，3分别加蒸馏水，加热溶解后，冷却，分别加入胃蛋白酶，37℃酶解，离心，弃去沉淀，上清液Sevage法除蛋白质，然后用双氧水脱色，再分别加乙醇，使乙醇浓度分别为20-85％，静置，离心，分别得红芪多糖I、II、III。

红芪多糖I，II的纯化：将红芪多糖I，II分别溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液上Sephadex G-200分离，用0.9％NaCl溶液洗脱，洗脱速度为0.2mL/min，每3mL收集一份，苯酚-硫酸法跟踪检测，红芪多糖I、II的凝胶色谱吸收曲线图分别见图1、图2，透析后干燥，得到红芪多糖Ia、IIa。

红芪多糖III的纯化：将红芪多糖III溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液用Sephadex G-25分离，分别用0.9％NaCl溶液和蒸馏水洗脱，洗脱速度0.2mL/min，每3mL收集一份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制凝胶色谱吸收曲线见图3，透析后干燥，得到红芪多糖IIIa和IIIb。

二、红芪多糖组成的测定：

1、红芪多糖的气相色谱测定：

1.1供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备

精密称取红芪多糖I、II、III、IIIa、IIIb各10mg，分别加入4mL(2mol·L^-1)三氟醋酸，于90℃水解8h，离心(3500r·min^-1)，取上清液，于80℃减压蒸干，残渣分别加10mg盐酸羟胺，再加0.5mL吡啶，于90℃反应0.5h，冷却后再加0.5mL醋酐于90℃反应0.5h；冷却，加入1mLH₂O和1mL氯仿萃取3次，取氯仿层，蒸干，残渣加100μL氯仿溶解，作为供试品溶液。

1.2对照品溶液的制备

精密称取鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖对照品10mg，同上述供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)相同的方法制备，作为对照品溶液。

1.3气相色谱条件

固定液：AT.XE-60；柱长：15m；内径：0.53mm；膜厚：1.0μm；柱温：225℃；汽化温度：250℃，检测温度：260℃；气体流速：N₂(载气)40mL·min^-1，分流比：40∶1；检测器：FID。

1.4测定方法

取上述对照品溶液、供试品溶液，按气相色谱条件，分别进样0.1μl，测定结果见图4～10，比较样品色谱峰与对照品色谱峰的保留时间，判断样品组成。红芪多糖样品通过水解断裂成单糖基，并制备成糖腈乙酰酯衍生物，单糖基衍生物是通过与对照品相应单糖衍生物出峰时间(即保留时间)一致来确定的。

2、红芪多糖分子量测定：

2.1色谱条件

Agilent 1100高效液相色谱系统；色谱柱：Shodex KS-805和KS-804串联；

示差检测器：Agilent G1362A；柱温：40℃；流动相：0.2M NaCl；流速：0.8ml/min；

2.2标准曲线绘制

分子量分别为738、5900、11800、212000、404000 Dalton的标准葡聚糖(Polymer Laboratories)用流动相配制成约1mg/ml的溶液，离心10min，转速10000rpm，取上清液进样测定。

2.3样品制备

分别取红芪多糖I、II、III、IIIa、IIIb各10mg，置于10ml容量瓶中，用流动相配制成约1mg/ml的溶液，离心10min，转速10000rpm，取上清液进样测定。数据由Agilent GPC软件处理。

3、结果

红芪多糖组成如下：

红芪多糖I：分子量为1000～270000，组成多糖的单糖基为：鼠李糖0.1～5％、阿拉伯糖1～12％、木糖0.1～7％、半乳糖1～12％、葡萄糖65～95％；

红芪多糖II：分子量为1000～90000，组成多糖的单糖基为：鼠李糖1～16％、阿拉伯糖5～45％、木糖1～15％、半乳糖1～8％、葡萄糖30～90％；

红芪多糖III：分子量为1000～100000，组成多糖的单糖基为：鼠李糖0.1～6％、阿拉伯糖5～55％、木糖1～35％、半乳糖1～20％、葡萄糖20～70％；同时紫外检测表明其还含有部分糖醛酸。

红芪多糖IIIa：分子量为2000～100000，组成多糖的单糖基为：鼠李糖1～9％、阿拉伯糖30～90％、木糖0.1～6％、半乳糖1～35％、葡萄糖1～20％。

红芪多糖IIIb：分子量为1000～10000组成多糖的单糖基为：葡萄糖100％。

三、红芪多糖降血糖作用

(一)红芪多糖对实验性糖尿病小鼠降血糖作用

1材料

1.1试验药物本发明提取分离的红芪多糖1，2，3，现有技术提取分离的均多糖(红芪多糖4)。

1.2动物昆明种小白鼠(清洁级)，

，200只，体重为20±2g，由兰州大学动物中心提供。

1.3试剂四氧嘧啶(ALX)(Sigm-a A7413)，生理盐水，罗氏优越电子感应血糖仪(ACCU-CHEK Advantage)。

2方法

2.1四种红芪多糖降血糖作用对比实验

2.1.1四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠模型建立及给药方法

取健康昆明种雄性小鼠80只，适应性饲养1周，禁食(不禁水)16h后，腹腔注射2％的新鲜四氧嘧啶溶液。末次给药后72h，禁食(不禁水)5h，断尾取血，用血糖仪测空腹血糖值(FBG)。FBG＞11.1mmol·L^-1，并出现多饮、多食、多尿者，判为建模成功。取建模成功的小鼠60只，随机分为模型组、HPS-1组、HPS-2组、HPS-3组、HPS-4组，组间血糖值差不大于1.1mmol·L^-1，每组10只。以上各组小鼠灌胃给药，1次/d，连续2周。模型组给予等容积生理盐水。

2.1.2检测指标

各组连续给药12d，在4d、8d、12d分别在末次给药后禁食12小时，断尾取血，及时离心(3500r·h^-1，15min)，取血清，用血糖仪测定血糖水平。

2.2HPS-3对实验性糖尿病小鼠的降血糖作用

2.2.1四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠模型建立及给药方法

取健康昆明种雄性小鼠120只，适应性饲养1周，将小鼠随机分成正常对照组和实验组。正常对照组14只小鼠腹腔注射生理盐水。实验组按“2.1.1”方法建立四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠模型。取建模成功的小鼠84只，随机分为正常对照组、模型组、HPS-3小剂量组、中剂量组、大剂量组，组间血糖值差不大于1.1mmol·L^-1，每组14只。给药按“2.1.1”方法。正常对照组和模型组给予等容积生理盐水。

2.2.2检测指标

用血糖仪测血糖；

糖耐量：测定方法为小鼠禁食12小时后，先测定空腹血糖，然后灌胃给予5g/kg体重的葡萄糖溶液，0.5、1、2小时断尾采血测血糖，并计算各组给葡萄糖后不同时间点血糖曲线下面积。

2.3HPS-3对实验性2型糖尿病大鼠降血糖作用

雌性Wistar大鼠以高脂高糖饲料饲养4周后再以链脲佐菌素，30mg·kg^-1.i.p.诱发2型糖尿病模型。继续以高脂高糖饲料喂养4周，第9周检测空腹血糖值，血糖值大于11.1mmol·L^-1者纳入实验。大鼠分为正常对照组、2型糖尿病模型组、HPS-4组、HPS-3大中小剂量组。各组均灌胃给药，正常对照组及模型组给予等量生理盐水，连续给药5周后断尾采血，2000rpm离心15分钟，取血清-70℃冷冻保存，用血糖仪测血糖。

2.4统计学处理

以SPSS软件15.0版建立数据库，各组实验数据用x士s表示，组间差异的显著性用方差分析(Oneway ANOVA)方法进行统计学处理，P＜0.05表示两组间有显著性差异。

3结果和讨论

3.1四种红芪多糖降血糖作用比较

3.1.1一般观察：用四氧嘧啶造模后小鼠多饮、多食、多尿、体重减轻即“三多一少”症状十分明显，伴有反应迟钝，毛竖无光泽等症状；给药后小鼠“三多一少”症状均有不同程度的改善，反应灵活，毛发平伏有光泽，体重增加，尤以HPS-3组最为明显(P＜0.05)，依次为HPS-1组、HPS 4组(P＜0.05)，HPS-2组则改善不明显(P＞0.05)。

3.1.2四种红芪多糖对实验性糖尿病小鼠降血糖作用的影响，结果见表1

表1的结果表明，HPS-1组、2组、4组治疗后小鼠血糖降低，在12天血糖趋于正常；并且在不同时间点上小鼠血糖降低与模型组比较具有统计学意义(P＜0.05)；尤其以HPS-3降血糖作用最佳，依次为HPS-1组、HPS-4组，HPS-2则改善不明显。说明HPS-3对改善糖尿病小鼠血糖作用比HPS-4好。

表1红芪多糖对实验性糖尿病小鼠不同时间点血糖浓度的影响比较(x±s)

与模型组对比，^*P＜0.05；与HPS-4对比，^☆P＜0.05。

3.2红芪多糖-3对实验性糖尿病小鼠的降血糖作用

3.2.1红芪多糖-3对实验性糖尿病小鼠降血糖作用的影响，结果见表2。

表2红芪多糖3对实验性糖尿病小鼠降血糖作用的影响(x±s，n＝14)

注：与空白组和模型组对比，^*P＜0.05。

由表2可见，HPS-3组和正常组、模型组比较，在不同时间点上小鼠血糖降低有统计学意义(P＜0.05)，显示HPS-3治疗后小鼠血糖降低，并且随着给药量增加血糖减低，可见HPS-3降血糖作用具有量效关系。

3.2.2红芪多糖-3对实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响，结果见表3。

由表3可见HPS-3三个剂量组在2h均可不同程度地降低葡萄糖小鼠血糖，与正常对照组和模型组相比，均有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组(P＜0.01)；三个不同剂量组血糖曲线下面积的降低与正常对照组和模型组相比，均有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组(P＜0.01)；说明模型组存在糖耐量减退，HPS-3可改善2型糖尿病及胰岛素抵抗，且有明显的量效关系。

表3红芪多糖-3对实验性糖尿病小鼠糖耐量的影响(x±s，n＝14)

注：与空白组和模型组对比，^*P＜0.05 ^☆☆P＜0.01。

3.3HPS-3对实验性2型糖尿病大鼠血糖的影响，结果见表4。

表4HPS-3对实验性2型糖尿病大鼠降血糖作用的影响(x±s，n＝10)

注：与空白组对比^*P＜0.05，与模型组对比

P＜0.05，与HPS-4对比^☆P＜0.05

由表4可见实验性2型糖尿病大鼠的血糖值很高，而HPS-3组和HPS-4组的血糖值较低，与模型组比较具有统计学意义(p＜0.05)。HPS-3组血糖值比HPS-4组低，具有统计学意义(P＜0.05)，说明HPS-3在高脂饲料加小剂量链脲佐菌素诱导的实验性2型糖尿病大鼠模型上的降血糖作用比HPS-4强，实验中还观察到HPS-3可明显改善糖尿病大鼠“三多一少”症状。

附图说明

图1为红芪多糖I凝胶色谱吸收曲线图

图2为红芪多糖II凝胶色谱吸收曲线图

图3为红芪多糖III凝胶色谱吸收曲线图

图4为阿拉伯糖对照品糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

图5为鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖对照品糖腈乙酰酯衍生物气相色谱

图6为红芪多糖I糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

图7为红芪多糖II糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

图8为红芪多糖III糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

图9为红芪多糖IIIa糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

图10为红芪多糖IIIb糖腈乙酰酯衍生物气相色谱图

具体实施方式

(1)红芪多糖的分离

将红芪药材用药材体积5～18倍量的水，于30℃～100℃提取1～5次，每次提取0.5～3.0小时，合并水溶液，浓缩至体积为药材的1～5倍；向浓缩液中加乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀1；向滤液中再加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀2；向滤液中继续加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀3；然后将所得沉淀1、2、3分别冷冻干燥，得红芪多糖1，红芪多糖2，红芪多糖3；红芪多糖1，2，3的含量都在50％以上。

在水提前，可先将红芪药材用乙醇浸泡10小时左右，再回流5小时左右，过滤，将药渣除去残留的乙醇后，再将药渣采用上述工艺进行水提。

(2)红芪多糖的纯化

红芪多糖1，2，3的纯化：向红芪多糖1，2，3分别加蒸馏水，加热溶解后，冷却，分别加入胃蛋白酶，37℃酶解，离心，弃去沉淀，上清液Sevage法除蛋白质，然后用双氧水脱色，再分别加乙醇，使乙醇浓度分别为20-85％，静置，离心，分别得红芪多糖I、II、III。红芪多糖I的分子量为1000～270000，组成多糖I的单糖基为：鼠李糖0.1～5％、阿拉伯糖1～12％、木糖0.1～7％、半乳糖1～12％、葡萄糖65～95％；红芪多糖II的分子量为1000～90000，组成多糖II的单糖基为：鼠李糖1～16％、阿拉伯糖5～45％、木糖1～15％、半乳糖1～8％、葡萄糖30～90％；红芪多糖III：分子量为1000～100000，组成多糖III的单糖基为：鼠李糖0.1～6％、阿拉伯糖5～55％、木糖1～35％、半乳糖1～20％、葡萄糖20～70％及少量糖醛酸。

红芪多糖III的纯化：将红芪多糖III溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液用Sephadex G-25分离，分别用0.9％NaCl溶液和蒸馏水洗脱，洗脱速度0.2mL/min，每3mL收集一份，透析后干燥，得到红芪多糖IIIa和IIIb，红芪多糖IIIa分子量为2000～100000，组成多糖的单糖基为：鼠李糖1～9％、阿拉伯糖30～90％、木糖0.1～6％、半乳糖1～35％、葡萄糖1～20％。红芪多糖IIIb分子量为1000～10000组成多糖的单糖基为：葡萄糖100％。

Claims (3)

1、一种红芪杂多糖的提取分离工艺，包括以下工艺步骤：

(1)红芪多糖的分离

将红芪药材用药材体积5～18倍量的水，30℃～100℃提取1～5次，每次提取0.5～3.0小时，合并水溶液，浓缩至体积为药材的1～5倍；向浓缩液中加乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀1；向滤液中再加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀2；向滤液中继续加入乙醇，使乙醇浓度达20％～85％，沉淀，过滤，得沉淀3；然后将所得沉淀1、2、3分别干燥，分别得红芪多糖1，红芪多糖2，红芪多糖3。

(2)红芪多糖的纯化

红芪多糖1，2，3的纯化：红芪多糖1，2，3分别加蒸馏水，加热溶解后，冷却，分别加入胃蛋白酶，37℃酶解，离心，弃去沉淀，上清液Sevage法除蛋白质，然后用双氧水脱色，再分别加乙醇，使乙醇浓度分别为20-85％，静置，离心，分别得红芪多糖I、II、III。

2、如权利要求1所述红芪杂多糖的提取分离工艺，其特征在于：红芪药材在水提前，先用乙醇浸泡0～24小时，再回流1～12小时，过滤，将药渣除去残留的乙醇后，进行水提。

3、如权利要求1所述方法提取分离的红芪杂多糖，红芪多糖I的分子量为1000～270000，组成多糖I的单糖基为：鼠李糖0.1～5％、阿拉伯糖1～12％、木糖0.1～7％、半乳糖1～12％、葡萄糖65～95％；红芪多糖II的分子量为1000～90000，组成多糖II的单糖基为：鼠李糖1～16％、阿拉伯糖5～45％、木糖1～15％、半乳糖1～8％、葡萄糖30～90％；红芪多糖III的分子量为1000～100000，组成多糖III的单糖基为：鼠李糖0.1～6％、阿拉伯糖5～55％、木糖1～35％、半乳糖1～20％、葡萄糖20～70％。

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