CN108892733A - 一种红芪多糖修饰方法及修饰的红芪多糖的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种红芪多糖修饰方法，首先，将红芪用复合酶酶解；然后，进行超声处理；最后，用乙醇沉淀；所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成；所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到30‑85％。本发明提供了一种红芪多糖的修饰方法，通过一种酶解和超声结合的分子修饰技术，有效地提高了红芪多糖得率、纯度和水溶性；使用该方法可使红芪多糖发生降解、接枝和交联反应，进而使多糖分子量降低、空间构象发生改变，提高了多糖的生物活性，是一种简单方便、经济环保、效率高、能耗低、无污染的修饰技术。使用本发明的方法修饰的红芪多糖具有抗肝损伤、抗肝纤维化、抗骨质疏松、抗胃溃疡、降血糖、抗衰老、抗氧化、提高免疫力等生物活性。

Description

一种红芪多糖修饰方法及修饰的红芪多糖的应用
技术领域
本发明涉及一种简单方便、经济环保的分子修饰技术，即复合酶联合超声修饰红芪多糖的方法，本发明还涉及该修饰的红芪多糖的应用。
背景技术
现今，随着糖技术及糖科学的飞速发展，低毒、无残留、不产生耐药性且活性显著的多糖已成为研究热点。已经证实中药多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗应激、抗辐射及抗衰老等多种生物活性。研究发现，多糖的生物活性与多糖的空间结构、分子量、单糖组成、提取方式及分子构象等密切相关。中药多糖采用分子修饰技术，如化学修饰、酶修饰、物理修饰等，其空间结构发生了改变，产生新的构象，其物理化学性质、生物活性随之改变，可以增强或者赋予中药多糖更多的药理活性和减弱其毒性，因此对中药多糖进行分子修饰已经成为药学研究和应用的一种常用的改良方法。
红芪多糖(Hedysarum polysaccharides，HPS)是红芪的主要药效成分，具有降血糖、抗骨质疏松、抗肝纤维化、抗胃溃疡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力抗凝血和抗补体等药理作用。目前，提取红芪多糖的常用方法是热水浸提法，该法提取率低、得到的多糖纯度低、溶解度差、分子质量和体积较大，易形成黏度高、溶解度低的复合物，不利于多糖分子跨越细胞膜障碍进入生物体内发挥多糖的功能特性和生物活性。
发明内容
为了解决现有传统的热水浸提法存在的问题：提取率低、溶解度差、后期纯化困难，且所得天然结构的多糖，分子质量和体积较大，存在黏度高、溶解度低，生物利用度差等缺陷。本发明提供了一种复合酶联合超声的分子修饰红芪多糖的方法，因植物细胞壁由纤维素、果胶和结构蛋白等通过共价键和非共价键形成的多层纤维结构，利用纤维素酶可以使细胞壁疏松、破裂和减小传质阻力，且蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而促进细胞壁多糖和胞内多糖的溶出，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高多糖的纯度；而超声波可利用其空化作用和机械振动、乳化、击碎、热效应等次级效应使溶媒渗入细胞，加速有效成分的溶解。经复合酶联合超声修饰的红芪多糖，可引起多糖发生降解、接枝和交联反应，进而使多糖分子的大小、空间构象发生改变，在水中的溶解度增加，从而提高了生物活性。
本发明提供一种红芪多糖修饰方法，首先，将红芪用复合酶酶解；然后，进行超声处理；最后，用乙醇沉淀；所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成；所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到30-85％；
作为优选，所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到50-85％；
作为优选，所述红芪用复合酶酶解前进行脱脂处理。
作为优选，所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为5:1-1:5；
作为优选，所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为2:1。
作为优选，所述将红芪用复合酶酶解时，酶解温度为40-55℃，酶解时间为1-6h，pH值为3-7；复合酶的添加量是红芪质量的0.5-6.0％；
作为优选，所述将红芪用复合酶酶解时，酶解温度为45℃，酶解时间为1h，pH值为5；复合酶的添加量是红芪质量的1.0％。
作为优选，所述超声时，超声温度为30-70℃，超声功率为40-115W，超声时间为20-80min，超声处理1-5次；
作为优选，所述超声时，超声温度为60℃，超声功率为40W，超声时间为30min，超声处理1次。
作为优选，所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。
作为优选，所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到40-50％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1；在上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到60-85％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2。
本发明还提供红芪多糖在制备抗氧化、抗衰老、提高免疫力、降血糖、抗骨质疏松、保肝护肝、抗肝纤维化、抗胃溃疡的药物和保健食品中的应用；所述红芪多糖是应用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的。
本发明还提供一种药物，其有效成分含有应用上述方法制备得到的红芪多糖。
作为优选，所述药物还包括医学上可接受的辅料。
作为优选，所述药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
本发明的有益效果：
与传统提取工艺相比，本发明采用复合酶酶解联合超声修饰红芪多糖，并通过对复合酶用量、复合酶配比、酶解温度、超声功率、超声时间、超声温度等工艺参数进行研究，确定了复合酶酶解联合超声修饰红芪多糖最佳工艺条件。
本发明提供了一种红芪多糖(HPS)的修饰方法，通过一种以物理方法(超声波法)和生物方法(酶降解法)相结合的分子修饰技术，有效地提高了红芪多糖得率、纯度和水溶性；使用该方法可使红芪多糖发生降解、接枝和交联反应，进而使多糖分子量降低、空间构象发生改变，提高了多糖的生物活性，是一种简单方便、经济环保、效率高、能耗低、无污染的修饰技术。使用本发明的方法修饰的HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2具有抗肝损伤、抗肝纤维化、抗骨质疏松、抗胃溃疡、降血糖、抗衰老、抗氧化、提高免疫力等生物活性。本发明方法是一种新型的红芪多糖修饰提取工艺，具有良好的应用和发展前景，为更好地提取和利用红芪多糖提供一种新的途径和方法。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1-4为不同红芪多糖样品的分子构象。
图5为不同红芪多糖样品对羟基自由基的清除能力。
图6为不同红芪多糖样品对免疫抑制小鼠肝脏匀浆中MDA水平的影响。
图7为不同红芪多糖样品对免疫抑制小鼠血清中IFN-γ水平的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地说明本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。如无特殊说明，在本发明中，“％”表示体积浓度百分比，“倍量”为质量体积比(药材为质量单位：g，溶剂体积单位：mL)。
(一)本发明的红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过20-80目筛，用3-10倍量的乙酸乙酯和85-95％乙醇各脱脂1-5次，每次0.5-3h，干燥；
(2)称取脱脂的红芪干粉，加入10-50倍量自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝3-7，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量是红芪质量的0.5-6.0％，酶解温度为40-55℃，酶解时间为1-6h；没有灭活。复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为5:1-1:5；
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度30-70℃，超声功率40-115W，超声时间20-80min，超声处理1-5次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3；
(4)将步骤(3)中浓缩后的滤液加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率12％-16％，多糖含量80％-95％。
将步骤(3)中浓缩后的滤液加乙醇使乙醇体积浓度达到40-50％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1，多糖得率4％-8％，多糖含量90％-93％；上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到60-85％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2，多糖得率2％-5％，多糖含量90％-94％。
(二)应用传统热水浸提法制备红芪多糖，步骤如下：
取1.0g脱脂药粉，加入10-50mL自来水，40-60℃温浸1-3次，每次1-6h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度为70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，即得热水浸提的红芪多糖(HPS-R)。
(三)传统热水浸提法和复合酶联合超声修饰红芪多糖法所得多糖样品理化特性的比较
比较上述4种多糖样品的理化性质：准确称取0.25g样品，定容于50mL容量瓶中，使用粘度计测定其绝对粘度；采用凝胶渗透色谱法(GPC-MALLS)，按柱温35℃、流动相0.02％NaN3+0.9％NaCl、流速1.0mL·min-1，和进样量30μL的色谱方法进样，测定样品的分子量与分子构象；采用考马斯亮蓝法，测定样品中蛋白质含量；采用硫酸-咔唑法，测定样品中糖醛酸含量；将700mg红芪多糖样品溶解在10mL纯水中，转移至已知恒重的玻璃离心管中，3000r/min离心20min，90℃水浴蒸发至离心管表面无水。105℃烘干至恒重，计算溶解度。测定结果见表1。
表1不同红芪多糖样品的理化特性
由表1可知，复合酶联合超声法与传统的热水浸提法相比，极显著的提高了红芪多糖产量。传统提取的多糖样品，需经多次脱蛋白和脱色素，大量耗费时间、人力和成本高，通过运用复合酶联合超声波降解的分子修饰手段，显著降低蛋白质含量，增加了多糖在水中的溶解度，极大减少多糖纯化工序，节约成本。多分散系数Mw/Mn处于2～3，属于中等分布宽度样品；多分散系数接近于1，属于窄分布样品，故HPS-R、HPS-MC和HPS-MC1属于中等分布宽度样品，而HPS-MC2属于窄分布样品。图1-4是由以均方根旋转半径(Rg)对重均分子量(Mw)作图，由Astra处理软件计算4种红芪多糖样品组分在溶液状态的中分子构象，HPS-R斜率为-0.19，类似U型曲线，在流动相溶液中为高枝化度结构；HPS-MC斜率为-0.49，为高枝化度结构，但是其枝化程度比HPS-R低；HPS-MC1斜率约为0.36，则表示其为球状形态；HPS-MC2的斜率为0.52，则表示高分子在溶液中呈线性无规则线团。
图1-4为不同红芪多糖样品的分子构象。
其中，图1为HPS-R的均方根半径对摩尔质量的关系(斜率＝-0.19±0.01)。
图2为HPS-MC的均方根半径对摩尔质量的关系(斜率＝-0.49±0.01)。
图3为HPS-MC1均方根半径对摩尔质量的的关系(斜率＝0.36±0.02)。
图4为HPS-MC2均方根半径对摩尔质量的关系(斜率＝0.52±0.01)。
本发明的红芪多糖修饰方法关键参数的选择如下：
一、复合酶的选择
(1)采用本发明的红芪多糖修饰方法，在其他工艺条件均相同的条件下制备HPS-MC，HPS-MC1、HPS-MC2，用不同的复合酶进行实验，以下为实验结果：
表2不同类型的酶对红芪多糖含量及得率的影响
由表2可知，当选择不同的复合酶时，红芪多糖的得率和含量有很大差异，当复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶时，红芪多糖的得率和含量最高。
二、酶解和超声顺序对红芪多糖得率和含量的影响
采用本发明的红芪多糖修饰方法，在其他工艺条件相同的情况下制备HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2，复合酶酶解和超声同步进行、复合酶酶解前超声或复合酶酶解后超声对红芪多糖得率和含量的影响，以下为实验结果：
表3复合酶联合超声不同处理方式对红芪多糖和得率的影响
结果表明，复合酶酶解后超声红芪多糖的得率和提取率均高于复合酶酶解前超声和复合酶酶解超声同步。
三、复合酶联合超声修饰红芪多糖的参数选择
红芪药材粉碎过80目筛，依次用3倍量的乙酸乙酯和85％乙醇各脱脂1次，每次0.5h，干燥后备用。在酶解1h、酶解温度45℃、乙醇沉淀至体积浓度为70％、料液比1：10，超声处理1次、复合酶为纤维素酶和木瓜蛋白酶的提取条件下，取已脱脂的红芪药粉1.0g，预设复合酶添加量1.0％、复合酶配比2：1、pH＝5、超声功率40W、超声时间30min、超声温度60℃为提取流程中的常规量。复合酶用量、复合酶配比、酶解pH值、超声功率、超声时间、超声温度6个单因素变量分别替换提取流程中相应的常规量，提取液滤过，合并滤液，滤液浓缩至原体积的1/3，加乙醇使乙醇终浓度为70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，即得HPS-MC，并计算其含量和得率，优化因素水平见表4。筛选得复合酶联合超声修饰的红芪多糖的最佳工艺：实施例1中的工艺条件即为最佳工艺条件。
表4复合酶联合超声修饰红芪多糖的单因素试验
实验结果为：(1)随着酶用量的增加，多糖含量和得率均呈现先上升后逐渐下降的趋势，从酶解的效果和成本角度来看，复合酶的最佳加酶量为1.0％；(2)随提取液pH增大，多糖含量和得率均呈现先上升后下降的趋势。故最佳的酶解pH为5；(3)在实验范围内，随着纤维素酶与木瓜蛋白酶比例的减小，多糖含量先上升后下降最后趋于平缓，而多糖得率呈先上升后下降趋势。即纤维素酶:木瓜蛋白酶＝2:1时，多糖含量最高；纤维素酶:木瓜蛋白酶＝1:1时，多糖得率最高。综合考虑，故选择2:1为复合酶添加配比；(4)在实验范围内，当超声功率达到55W时，多糖得率达到峰值；当超声功率为40W时，多糖含量最高。推测这可能经酶解后的多糖结构有所改变，增大超声波功率可能导致多糖糖苷键的断裂，进而影响含量和得率。因此超声波功率以40W为宜；(5)在实验范围内，多糖含量随超声时间的延长呈先增大后减小的趋势。因此最佳的超声时间是30min；(6)在实验范围内，当温度继续升高时多糖的提取含量与得率随之增加。当温度超过60℃，多糖可能发生水解，导致多糖含量与得率下降。因此，超声温度选择60℃为宜。
实施例1
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过80目筛，用3倍量的乙酸乙酯和85％乙醇各脱脂1次，0.5h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入10mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝5，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的1.0％，酶解温度为45℃，酶解时间为1h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为2:1。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度60℃，超声功率40W，超声时间30min，超声处理1次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率为16％，多糖含量为95％。
实施例2传统热水浸提法和复合酶联合超声修饰红芪多糖法制备红芪多糖
(1)传统热水浸提法：取1.0g脱脂药粉，加入10mL自来水，60℃温浸3次，每次1h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度为70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，即得热水浸提的红芪多糖(HPS-R)。多糖得率为6％，多糖含量为80％。
(2)复合酶联合超声修饰红芪多糖法制备红芪多糖(HPS-MC1)和红芪多糖(HPS-MC2)：
步骤(1)和步骤(2)的制备方法与实施例1相同，步骤(3)为：
经复合酶酶解后，进行超声，超声温度60℃，超声功率40W，超声时间30min，超声处理1次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到40％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1，多糖得率为4％，多糖含量为92％。上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到60％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2。多糖得率为2％，多糖含量为93％。
实施例3实施例1和实施例2中制备的不同红芪多糖样品体外抗氧化活性试验
羟自由基清除能力测定利用Fenton反应体系产生·OH(H2O2+Fe2++H+＝·OH+H2O2+Fe3+)，用水杨酸法测定羟自由基。
·OH是最强氧化剂，其可与活细胞中蛋白质、脂蛋白和核酸等生物大分子发生反应，引发组织细胞病变，导致各种病理和生理现象。由图5可知，在试验浓度范围1～7mg/mL内，HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2均对羟基自由基的清除率呈量效依赖关系，浓度为7mg/mL时，对·OH自由基的清除率达最高；HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2对·OH自由基的清除率高于HPS-R，但低于Vc对·OH自由基的清除率作用。
实施例4实施例1和实施例2中制备的不同红芪多糖样品的体内免疫调节和抗氧化试验
SPF级雄性昆明种小鼠120只，体重(20±2g)，由兰州大学动物实验室中心提供，合格证号：SCXK(甘)2013-002。适应性饲养一周，试验研究过程遵从试验动物饲养管理与使用指南。120只小鼠随机分成10组，分别为空白对照组(blank)、模型对照组(M odel)、4种红芪多糖样品的高剂量组(400mg/kg)和4种红芪多糖样品的低剂量组(100mg/kg)。空白对照组(blank)和模型对照组(Model)均给与生理盐水，其他组按相应药物灌胃给药。连续灌胃10天，除空白组外，其余各组小鼠连续3天腹腔注射55mg/Kg新鲜配置的环磷酰胺溶液。第14天摘眼球取血，脱颈椎处死，取其肝脏、测定血清中的细胞因子IFN-R，测定肝脏组织匀浆液中的抗氧化指标MDA。
4种多糖样品对免疫抑制小鼠的免疫能力提高和抗氧化作用结果见图6和图7，HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2体内抗氧化活性和免疫调节能力均高于HPS-R，其中HPS-MC2抗氧化能力和免疫调节能力最强。
图6为不同红芪多糖样品对免疫抑制小鼠肝脏匀浆中MDA水平的影响；
注：与空白组比较，+P<0.05，++P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
图7为不同红芪多糖样品对免疫抑制小鼠血清中IFN-γ水平的影响；
注：与空白组比较，+P<0.05，++P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
实施例5实施例1和实施例2中制备的不同红芪多糖样品的降血糖作用
SPF级雄性昆明种小鼠132只，体重(20±2g)，由兰州大学动物实验室中心提供，合格证号：SCXK(甘)2013-002。适应性饲养一周，禁食(不禁水)16h后，腹腔注射2％的新鲜ALX溶液(220mg/kg)。末次给药后72h，禁食(不禁水)5h，断尾取血，用葡萄糖氧化酶(GOD-PAP)法测空腹血糖值(FPG)。FPG>11.1mmol/L，并出现多饮、多食、多尿者，判为造模成功。取造模成功的小鼠132只，组间血糖差值不大于1.1mm ol/L，随机分成11组，分别为空白对照组、模型对照组、消渴丸组(1000mg/kg)、4种红芪多糖样品的高剂量组(400mg/kg)和4种红芪多糖样品的低剂量组(100mg/kg)。其中消渴丸购于兰州大学第二医院。空白对照组和模型对照组均给与生理盐水，其他组按相应药物灌胃给药，每组12只。每天灌胃给药1次，连续2周。模型对照组和空白组灌胃等容积生理盐水。检测指标：血糖用GODPAP法测定，第1、2周禁食3h，灌胃5h后的血糖值。
由表5可知，HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2降血糖作用强于HPS-R，其中HPS-M C2降血糖作用最强。
表5不同红芪多糖样品对实验性糖尿病小鼠血糖的影响
注：与空白组比较，+P<0.05，++P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
实施例6实施例1和实施例2中制备的HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2对去卵巢大鼠骨质疏松的影响
90只SD大鼠，由兰州大学动物实验室中心提供，适应性饲养1周后，随机分为9组，每组10只，分别为假手术组、模型组、阳性对照组、HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2高剂量组(400mg/kg)和HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2的低剂量组(200m g/kg)。除假手术组外，其余4组结扎并切除大鼠双侧卵巢，假手术组对卵巢附近脂肪处进行结扎，进行绝经后骨质疏松模型制备，手术后5d开始给药，阳性对照组ig给予戊酸雌二醇(0.1mg/kg)，模型组与假手术组ig给予等量生理盐水，每天给药1次，连续给药3个月。给药结束后，测大鼠全身骨密度，测定结果见表6。
表6 HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2对去卵巢大鼠骨质疏松的影响
注：与假手术组比较，+P<0.05，++P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
由表6可知，大鼠去卵巢3个月后，相比于模型组，随HPS-MC、HPS-MC1和HP S-MC2试验浓度的增大，大鼠全身骨密度均大于模型组，且差异显著(P＜0.05、0.01)，说明造模成功，药效显著。表明HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2对骨的矿化过程有显著的调节作用。
实施例7实施例1和实施例2中制备的HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2对CCl4损伤小鼠肝脏的保护作用
SPF级雄性昆明种小鼠，体重(20±2g)，由兰州大学动物实验室中心提供，合格证号：SCXK(甘)2013-002。适应性饲养一周，试验研究过程遵从试验动物饲养管理与使用指南。将雄性昆明种小鼠随机分成九组(每组12只)：(I)正常对照组(NC组)；(II)CCl4模型对照组(CCl4组)；(III)秋水仙碱片处理组(阳性对照组，PC组)；(IV-IX)，HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2治疗组。模型组皮下注射CCl4-花生油(体积比3∶7)溶液诱发肝损伤，0.1mL/10g(首剂加倍)，1次/5d，连续35d，即可形成肝损伤。除正常对照组外，其余各组均按模型组同法造模。造模同时，阳性对照组每天灌胃给予秋水仙碱片(0.6mg/kg)，HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2治疗组给予两种不同剂量(200和400mg/kg)灌胃，正常对照组和模型组每天分别给予生理盐水。最后一次给药24h后，摘眼球取血，5000r/min离心，静置10min后，分离出血清，按试剂盒说明测定天冬氨酸转氨酶指标，测定结果见表7。
表7 HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2对CCl4损伤小鼠肝脏的保护作用
注：与NC比较，+P<0.05，++P<0.01；与CCl4比较，*P<0.05,**P<0.01。
由表7可知，HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2的两个试验剂量均能显著改善CCl4所致的肝纤维化作用。
实施例8实施例1和实施例2中制备的HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2对乙酸烧灼型胃溃疡大鼠溃疡指数的影响
SD雄性大鼠90只，体重在220±20g，实验前禁食24h，自由饮水，采用乙醚吸入方式麻醉大鼠，常规消毒腹部皮肤，自剑突正沿腹中线偏左向下剪约2cm开口，进入腹腔后，轻轻拉出鼠胃，找到胃前壁窦体部，将20％乙酸溶液0.1mL注射至腺胃部前壁窦体交界处浆膜下造成损伤模型，然后缝合腹壁，结束手术后正常饮食饮水，第2天将其随机分成8组，每组10只，分别为：模型组，阳性对照组，HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2的高、低2个剂量组；另取10只大鼠作为假手术组，假手术组进行同样操作但不注射乙酸，各组大鼠按如下方法给药，每天1次，连续12d阳性对照组灌胃给予西咪替丁100mg/kg，HPS-MC、HPS-MC1和PS-MC2的高、低剂量组分别灌胃给予400和100mg/kg，模型组灌胃给予等量生理盐水(1mL/100g)给药后第13天脱颈椎处死大鼠，解剖取胃，结扎幽门和贲门，摘出全胃，用1％福尔马林溶液固定5min；将胃切开，用蒸馏水洗除内容物，平展在玻璃板上，观察胃黏膜损伤情况，计算溃疡指数。结果见表8。
表8 HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2对乙酸烧灼型胃溃疡大鼠溃疡指数的影响
注：与模型比较，*P<0.05,**P<0.01。
由表8可见，假手术组大鼠无胃溃疡形成，说明手术操作不会引起胃溃疡，胃溃疡是由于注射乙酸造成的。HPS-MC、HPS-MC1、和HPS-MC2高低剂量组及西咪替丁组均能抑制胃溃疡大鼠的溃疡指数。
实施例10实施例1和实施例2中制备的HPS-MC、HPS-MC1和HPS-MC2制剂的制备。
(1)HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2粉，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂、压片，制片剂。
(2)HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒。
(3)HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊(装量为0.1g～1.0g)。
(4)HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2粉，加注射用水使浓度达每mL含0.01mg～10mg HPS-MC、HPS-MC1、HPS-MC2，封装于安瓶中，每瓶1mL～5mL,高压灭菌，制成灭菌注射剂，用于肌肉注射或静脉注射。
实施例11
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过50目筛，用5倍量的乙酸乙酯和95％乙醇各脱脂2次，2h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入30mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝3，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的6.0％，酶解温度为40℃，酶解时间为2h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为5:1。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度30℃，超声功率60W，超声时间50min，超声处理3次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率为15％，多糖含量为92％。
实施例12
本实施例与实施例11的不同之处在于：步骤(3)中，加乙醇使乙醇体积浓度达到30％，其余均相同。多糖得率为3％，多糖含量为82％。
实施例13
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过20目筛，用10倍量的乙酸乙酯和90％乙醇各脱脂5次，1h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入50mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝7，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的3.0％，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为1:1。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度70℃，超声功率115W，超声时间30min，超声处理2次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率为13％，多糖含量为91％。
实施例14
本实施例与实施例13的不同之处在于：步骤(3)中，加乙醇使乙醇体积浓度达到50％，其余均相同。多糖得率为8％，多糖含量为93％。
实施例15
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过60目筛，用8倍量的乙酸乙酯和85％乙醇各脱脂3次，3h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入40mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝4，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的6.0％，酶解温度为55℃，酶解时间为6h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为1:5。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度30℃，超声功率40W，超声时间80min，超声处理1次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率为16％，多糖含量为88％。
实施例16
本实施例与实施例15的不同之处在于：步骤(3)中，加乙醇使乙醇体积浓度达到85％，其余均相同。多糖得率为15％，多糖含量为92％。
实施例17
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过80目筛，用7倍量的乙酸乙酯和90％乙醇各脱脂5次，1.5h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入20mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝5，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的2.0％，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为1:3。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度50℃，超声功率80W，超声时间30min，超声处理2次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心得沉淀，沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。多糖得率为15％，多糖含量为90％。
实施例18
本实施例与实施例17的不同之处在于：步骤(3)中，加乙醇使乙醇体积浓度达到40％，其余均相同。多糖得率为4％，多糖含量为92％。
实施例19
红芪多糖的修饰方法，具体包括以下步骤：
(1)红芪药材，洗净后，粉碎过80目筛，用7倍量的乙酸乙酯和90％乙醇各脱脂5次，1.5h/次，干燥。
(2)称取脱脂的红芪干粉1.0g，加入20mL自来水，再加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH＝5，用复合酶进行酶解，复合酶的添加量为红芪质量的2.0％，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，酶解后不需要灭活；复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成，两者的质量比为1:3。
(3)经复合酶酶解后，进行超声，超声温度50℃，超声功率80W，超声时间30min，超声处理2次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到45％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1。多糖得率为6％，多糖含量为91％；上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2，多糖得率3％，多糖含量93％。
实施例20
本实施例与实施例19的不同之处在于：
步骤(3)中，经复合酶酶解后，进行超声，超声温度50℃，超声功率80W，超声时间30min，超声处理2次，离心，滤液浓缩至滤液体积的1/3，加乙醇使乙醇体积浓度达到50％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1。多糖得率为8％，多糖含量为93％；上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到85％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2，多糖得率5％，多糖含量94％。
其余步骤均与实施例19相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红芪多糖修饰方法，其特征在于：首先，将红芪用复合酶酶解；然后，进行超声处理；最后，用乙醇沉淀；所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成；所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到30-85％；
作为优选，所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到50-85％；
作为优选，所述红芪用复合酶酶解前进行脱脂处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为5:1-1:5；
作为优选，所述复合酶中纤维素酶与木瓜蛋白酶的质量比为2:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将红芪用复合酶酶解时，酶解温度为40-55℃，酶解时间为1-6h，pH值为3-7；复合酶的添加量是红芪质量的0.5-6.0％；
作为优选，所述将红芪用复合酶酶解时，酶解温度为45℃，酶解时间为1h，pH值为5；复合酶的添加量是红芪质量的1.0％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超声时，超声温度为30-70℃，超声功率为40-115W，超声时间为20-80min，超声处理1-5次；
作为优选，所述超声时，超声温度为60℃，超声功率为40W，超声时间为30min，超声处理1次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到70％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用乙醇沉淀是加乙醇使乙醇体积浓度达到40-50％，4℃静置过夜，离心，分别收集上清液和沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC1；上清液中再加乙醇使乙醇体积浓度达到60-85％，4℃静置过夜，离心，收集沉淀，将沉淀真空冷冻干燥，得HPS-MC2。
7.红芪多糖在制备抗氧化、抗衰老、提高免疫力、降血糖、抗骨质疏松、保肝护肝、抗肝纤维化、抗胃溃疡的药物和保健食品中的应用；所述红芪多糖是应用权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的。
8.一种药物，其特征在于：其有效成分含有应用权利要求1-6任一项权利要求制备得到的红芪多糖。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物还包括医学上可接受的辅料。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
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