CN103933060A - 红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用 - Google Patents
红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。试验结果表明，卵巢摘除大鼠骨的钙含量和骨密度均明显下降，而HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A，HPS3-B，HPS3-C，HPS3-D治疗组均能有效增强骨质疏松大鼠的钙含量及骨密度，明显抑制骨矿的溶解和丢失，HPS3-D作用效果最为明显。
Description
技术领域
本发明涉及红芪多糖的用途，属于医学技术领域。
背景技术
红芪(Radix Hedysari)系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪(Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz)的根.为甘肃特产名贵药材，中医将其作为传统中药，在临床上其具有强心，降糖，利尿，抗病毒，抗衰老等功效。红芪多糖(Radix Hedysari polysaccharides HPS)作为其主要活性成分之一,其中HPS-1，HPS-3，HPS-4部分具有较明显的降血糖及体外抗氧化等作用。
骨质疏松症(osteoporosis OP)是以骨量减少,骨组织显微结构退化，骨的脆性增高及骨折危险性增加为特征的一种全身性骨病，是老年人的常见病、多发病。随着我国逐渐进入老龄化社会，骨质疏松症的发病率呈现不断上升的趋势。对其进行有效的预防和治疗，正日益成为人们关注的焦点和重点研究领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了红芪多糖的一种新用途--在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应。
红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
进一步优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是防治绝经后妇女骨质疏松的药物，其用量在8.3mg/Kg既有效。
更优的，所述红芪多糖为红芪多糖3-D，试验表明，红芪多糖3-D预防和治疗骨质疏松的效果更加明显。其用量在用量为口服8.3mg/Kg、注射1.67mg/Kg，即有明显的效果(大鼠与人的换算剂量是6:1)。
上述红芪多糖制剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
一种可预防和治疗骨质疏松的药物，其主要成分为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。优选红芪多糖3-D。
优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
进一步优选的，所述预防或治疗骨质疏松药物是针对防治绝经后妇女骨质疏松的药物
本发明首次探讨了HPS-1，HPS-3，HPS-3及其分离物促进成骨细胞分化，对卵巢摘除引起的大鼠骨质疏松的防治作用，上述研究对促进红芪药材资源的有效利用和产地经济的发展具有重大意义。
为了进一步的说明本发明的进步性和实质，申请人进行了充分的试验。
一、红芪多糖促进成骨细胞分化的研究
1.试验材料
1.1细胞株：小鼠MC3T3-E1成骨细胞株购自中国医学科学院细胞库。
1.2主要试剂：低糖DMEM培养基(Hyclone，USA)，胎牛血清(GIBCO，USA)，青霉素-链霉素双抗(武汉博士德)，碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成，中国)，β-actin(中山金桥)、Runx-2(Santa Cruze，USA)、Osterix(Santa Cruze，USA)一抗，辣根过氧化物酶二抗(中山金桥)，总RNA提取液(TaKaRa，Japan)，PCR反转录试剂盒(TaKaRa，Japan)，β-actin、OPN、OCN、BSP、Runx-2、Osterix引物(TaKaRa，Japan)。
1.3主要仪器：细胞培养箱(Heal force，USA)，倒置相差显微镜(Olympus，USA)，PCR仪(ABI7500，USA)，DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪(北京六一，中国)
2.试验步骤
2.1.成骨细胞培养：细胞在温度37℃、二氧化碳饱和度5％的孵育箱中培养传代。用含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml的DMEM/F-12培养液培养，待细胞融合至90％时，用0.25％胰酶消化，接种至25cm2培养瓶中传代培养。
2.2.红芪多糖溶液配制：HPS1，HPS4，HPS3及其分离物(HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D)溶解于含10％胎牛血清的DMEM/F-12培养液中，分别配制成浓度为1.0g/ml的储存液。然后分别经过0.2μm无菌滤器过滤后无菌条件下4℃保存。
2.3.噻唑蓝试验(MTT)测量细胞增殖情况：将成骨细胞悬液按照每孔100μl(2×104密度)接种于96孔板，每组设置5个复孔。约24小时后，细胞处于对数生长期，每组分别加入HPS1，HPS4，HPS3及其分离物(HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D)溶解后终浓度达到8mg/ml。孵育72小时后加入20μl MTT(5mg/ml)继续孵育4小时，然后加入150ul二甲基亚砜，室温摇床振荡10min。酶标仪检测OD490nm处各孔的吸光值。
2.4.成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测：取对数生长期的成骨细胞，以1×105/孔密度接种于24孔板中贴壁培养12h，分别给予终浓度为8mg/ml的HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D刺激72小时后，吸出培养液，用PBS冲洗3次后每孔加入0.5mL含体积分数0.1％的Triton X-100，10分钟后将每孔溶液收集离心，取上清液，按照ALP试剂盒说明书进行操作，测定ALP活性。
2.5.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测：使用RNA iso TM Plus(TaKaRa)按照使用说明提取细胞总RNA，并检测RNA浓度。取约500ng总RNA配制成10μl反转录体系，反转录条件如下：反转录反应37℃15min，反转录酶的失活反应85℃5s。荧光定量PCR反应：采用双标记荧光探针法，反应条件为：预变性95℃30s，反应95℃3s，60℃30s，共40个循环。引物设计为：OPN,5′-CTCCAATCGTCCCTACAGTCG-3′,antisense strand OPN,5′-CCAAGCTATCACCTCGGCC-3′；sense strand OCN,5′-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3′,antisense strand OCN,5′-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3′；sense strand BSP,5′-GGCTATTGATCAAGCAGCACACA-3′,antisense strand BSP,5-CGCAGTTAGCAATAGCACAAACAC-3′；sense strandβ-actin,5-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′,antisense strandβ-actin,5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′.。
2.6.统计学方法：所有试验数据以均数±标准差表示,用SPSS13.0统计软件包进行统计处理。采用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较及各组均值的两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。
3.结果与讨论
3.1红芪多糖对成骨细胞活性的影响
如表1示，经过72小时的刺激，浓度为1mg/ml的HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D对成骨细胞活性无明显影响，表明HPS对成骨细胞无毒性作用。
表1HPS对成骨细胞活性的影响
注：**与正常组比较P>0.05。
3.2HPS对成骨细胞分化的影响
HPS对成骨细胞活性分化标志物，如碱性磷酸酶(ALP)活性和骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)及骨涎蛋白(BSP)mRNA表达的影响。表2结果示，成骨细胞分别被浓度为1mg/ml的HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D刺激72h后，ALP活性和OPN、OCN及BSP mRNA表达均显著升高，以HPS-3D刺激后升高幅度最高。
表2HPS对成骨细胞不同分化标志物表达的影响
.注：**与正常组比较P<0.05。
3.3HPS-3D对成骨细胞分化的影响
不同浓度HPS-3D对成骨细胞ALP活性和OPN、OCN及BSPmRNA表达的影响。表3，成骨细胞分别被浓度为0～8mg/ml的HPS3d刺激72h后，ALP活性和OPN、OCN及BSP mRNA表达在1.0mg/ml开始出现浓度依赖性升高(P<0.05)并在8mg/ml达到平台期(P>0.05)。
表3不同浓度HPS-3D对成骨细胞不同分化标志物表达的影响
注：##与正常组比较，P>0.05，**与正常组比较P<0.05，#与4.0mg/ml比P>0.05。
3.4讨论
ALP和OPN被认为是成骨细胞早期分化的指示性蛋白，OCN是成骨细胞分化晚期的指示性蛋白，同时BSP可以促进成骨细胞钙沉积与矿化结节的形成。最终使成骨细胞分化为骨细胞，形成成熟的骨组织。我们的结果显示浓度为1mg/ml的HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D可以有效的促进上述成骨细胞分化的指示性蛋白活性增强，表达升高。表明，HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D均可以有效的促进成骨细胞分化，以HPS3-D作用效果最为明显。进一步研究表明，浓度为1.0～8.0mg/ml的HPS-3D可以有效的促进成骨细胞分化成骨，并且具有浓度依赖性。同时，各组分HPS对成骨细胞无明显的毒性作用。
二、红芪多糖对大鼠骨质疏松的影响
1.材料与方法
1.1试验动物：健康三月龄雌性Wister大鼠，体重250g一300g，由兰州大学GLP试验动物中心提供。
1.2主要药品试剂：戊巴比妥钠，青霉素注射液(16万单位/mL)，6mol/L盐酸。
1.3主要仪器:原子吸收仪器，马福炉，自动生化分析仪(日本日立)，XR一36型双能X线骨密度仪。
1.4去卵巢骨质疏松动物模型建立：取Wister大鼠腹腔注射0.3％的戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，无菌条件下经腰背部双侧切口进入腹腔，切除双侧卵巢，伤口分层缝合。术后庆大霉素预防感染，1周后用药组开始用药。
1.5假手术组的建立：手术方法与去卵巢动物模型组的手术方法相同，但只切除卵巢旁的一小块脂肪垫，不切除卵巢。
1.6手术后分组与用药：术后骨质疏松模型组灌胃给予饮用水；试验组灌胃或腹腔注射给予相应HPS溶液；并以体重、鼠龄相匹配的假手术大鼠作为对照组给予饮用水。手术一个月后开始给药，连续给药3个月。
1.7观察指标与方法:
1.7.1标本采集在试验期间，每周称量体重一次。末次给药后禁食24小时后处死动物，剥离左右双侧股骨、胫骨进行测定。
1.7.2股骨骨钙含量的测定采用原子吸收分光光度法。从股骨的骨灰中取出30mg～40mg左右，精密称定，用盐酸溶解定容后测定。原子吸收仪器工作条件：波长422.2nm，灯电流4mA，光谱通带0.2nm，空气流量350ml/min，乙炔流量65ml/min。
1.7.3骨密度测定(双能X线吸收(DEXA)法),应用XR一36型双能x线骨密度仪，分辨率为1.0×1.0mm，速度为40mm/s，测厚离体股骨的骨密度。
1.8统计学处理试验数据均采用均数±标准差来表示，组间差异显著性用t—test比较，P<0.05为有显著性差异。采用SPSS13统计软件进行数据处理。
2.结果与讨论
2.1对大鼠骨钙含量的影响
结果由表4可见，去卵巢大鼠股骨钙含量，与对照组相比显著降低(P<0.01)。说明去卵巢大鼠骨钙丢失严重。给予HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D治疗后，与模型组相比，各组能够显著增加骨质疏松大鼠的股骨钙含量(P<0.05)，并且均能达到对照组水平。其中HPS-3D作用效果最为明显。
表4HPS对骨质疏松大鼠股骨钙含量影响(x±S)
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
2.2对大鼠股骨骨密度的影响
结果由表5可见去卵巢大鼠股骨的骨密度，与假手术对照组比显著降低(P<0.05)。给予HPS1，HPS4，HPS3及HPS3-A,HPS3-B,HPS3-C,HPS3-D治疗后，各组能显著提高骨质疏松大鼠股骨的骨密度，HPS-3D给药后动物的骨密度恢复水平最高，能够恢复到与假手术组相近的水平。
表5HPS对骨质疏松大鼠股骨骨密度影响(x±S)
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
2.3不同浓度HPS-3D对大鼠股骨钙含量及骨密度的影响
结果由表6-7可见，去卵巢大鼠股骨钙含量及骨密度在给予HPS-3D低、中、高剂量治疗一月、二月及三月后均能够显著增加(P<0.05)，并具有剂量依赖性与时间依赖性。由此，选择灌胃给药50mg/Kg即可产生较好的效果。
表6不同浓度HPS-3D对骨质疏松大鼠股骨钙含量影响(x±S)
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
表7不同浓度HPS-3D对骨质疏松大鼠股骨骨密度影响(x±S)
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
2.4注射与灌胃给药对大鼠股骨钙含量及骨密度的影响的比较
结果由表8-9可见，去卵巢大鼠股骨钙含量及骨密度在灌胃给予200mg/Kg HPS-3D和腹腔注射10mg/Kg HPS-3D治疗一月、二月及三月后均能够显著增加(P<0.05)，并具有剂量依赖性与时间依赖性。
表8腹腔注射与灌胃给药对大鼠股骨钙含量的影响
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
表9腹腔注射与灌胃给药对大鼠股骨骨密度的影响
注：##与假手术组比较P<0.05；**与模型组比较P<0.05。
2.2讨论
骨质疏松症治疗主要有抑制破骨细胞骨吸收和促进成骨作用两种主要途径，目前应用的药物大多是前一种，而这些药物只能起到稳定骨量的作用，为了恢复行使正常功能所需的骨量和力学结构，需要发展能够促进成骨功能的药物。本试验结果表明，卵巢摘除大鼠骨的钙含量和骨密度均明显下降,而HPS1，HPS4，HPS3及HPS-3A,HPS-3B,HPS-3C,HPS-3D治疗组均能有效增强骨质疏松大鼠的钙含量及骨密度,明显抑制骨矿的溶解和丢失，HPS3-D作用效果最为明显，用量为8.3mg/Kg时有明显的效果。并且具有浓度依赖性及时间依赖性。同时，注射给药同灌胃给药相比，用量小，仍能获得相同的疗效。我们认为HPS1、HPS3及HPS4对去卵巢大鼠骨质疏松均具有防治作用，对抑制去卵巢大鼠的骨吸收及促进其骨形成均有作用。HPS-3D对骨质疏松治疗具有时间依赖性与浓度依赖性，注射给药具有更好的使用价值。近期研究显示长期使用激素替代疗法具有一定副作用，而红芪多糖是滋补之要药，有诸多功效，且无明显的毒副作用，用于防治绝经后妇女骨质疏松的效果更加明显。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下提取1～5次，每次1～3h。合并提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为0～70％乙醇沉淀，过滤，沉淀；上述沉淀后的上清液用终浓度为20％～80％乙醇再沉淀；再沉淀后的上清液再用终浓度为30％～90％乙醇沉淀，过滤，沉淀60℃以下干燥，加60％-95％乙醇制颗粒，装1号胶囊(装量为0.1g-1.0g)，得到红芪多糖3的胶囊剂。
实施例2：
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下提取1～5次，每次1～3h。合并提取液，将提取液浓缩为每1ml液体相当于0.01-1g红芪药材的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，制成红芪多糖3饮料。
实施例3：
红芪多糖3-A,3-B,3-C,3-D粉，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂，压片，制片剂。
实施例4：
红芪多糖3-A,3-B,3-C,3-D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒剂。
实施例5：
红芪多糖3-A,3-B,3-C,3-D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊(装量为0.1g-1.0g)。
实施例6：
红芪多糖3-A,3-B,3-C,3-D粉，加注射用水使浓度达每ml含0.01mg-10mg3-A,3-B,3-C,3-D，封装于安瓶中，每瓶1ml-5ml,高压灭菌，制成灭菌注射剂，用于肌肉注射或静脉注射。
实施例7：
红芪多糖3-A,3-B,3-C,3-D粉，加注射用水使浓度达每ml含0.01mg-10mg3-A,3-B,3-C,3-D，高压灭菌，在百级净化环境中装于西林瓶中，冷冻干燥，制成冻干粉针剂，用于肌肉注射或静脉注射。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.红芪多糖在制备预防或治疗骨质疏松药物或保健品中的应用，其中，红芪多糖具体为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于：所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于：所述预防或治疗骨质疏松药物是防治绝经后妇女骨质疏松的药物。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用方法，其特征在于：所述红芪多糖为红芪多糖3-D，用量为口服8.3mg/Kg、注射1.67mg/Kg。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用方法，其特征在于：红芪多糖制剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂。
6.一种可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于：其主要成分为红芪多糖1、红芪多糖4、红芪多糖3或红芪多糖3的分离物一种或多种的组合，所述红芪多糖3的分离物为红芪多糖3-A、红芪多糖3-B、红芪多糖3-C或红芪多糖3-D中的一种或多种的混合。
7.根据权利要求6所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于：其主要成分为红芪多糖3-D。
8.根据权利要求6或7所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于：所述预防或治疗骨质疏松药物是通过促进成骨作用途径治疗骨质疏松的药物。
9.根据权利要求8所述的可预防和治疗骨质疏松的药物，其特征在于：所述预防或治疗骨质疏松药物是针对防治绝经后妇女骨质疏松的药物。
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