CN1304934A - 一种抗肿瘤药物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种抗肿瘤药物及其生产方法,药物为蛇葡萄素,取葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄、蛇葡萄、小叶蛇葡萄,显齿蛇葡萄、光叶蛇葡萄的干燥的全株或根或叶,经酒精回流提取,回收酒精,加适量水,用石油醚,氯仿萃取,水层减压蒸馏至固体析出。过滤,所得固体用水溶解,加活性炭煮沸,趁热过滤,静置,析出结晶,即为蛇葡萄素,其具有疗效确切、疗效高、毒副作用小的优点。其有较广的抗瘤谱。本生产方法提取率高。

Description

一种抗肿瘤药物及其生产方法
本发明涉及一种抗肿瘤药物及其生产方法。
葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄(Ampelopsis cantoniensis Planch)主要盛产于我国华南一带，其根(《中药大辞典》称“无莿根”)或全株是民间的传统用药，被广泛用于消炎解毒，治皮肤病、疖肿及骨髓炎、急性淋巴炎等感染性疾病，疗效显著。该植物的干制品“白茶”(又称“藤茶”、“藤婆茶”)历来是民间作清凉解毒的代茶饮品。国内于1989年开始对粤蛇葡萄中的蛇葡萄素进行结构鉴别、含量测定以及抗氧化作用的研究。对于同属植物，除了已入药典的白蔹外，还有蛇葡萄、小叶蛇葡萄、显齿蛇葡萄、光叶蛇葡萄等，它们均有消炎解毒、活血散瘀、消肿止痛等功效。
目前尚未有关于蛇葡萄素的肿瘤抑制作用的报道。文献报道蛇葡萄素的提取方法是药材经醇热提取得总黄酮后，采取(1)上聚酰胺柱层析分离，以大量的甲醇水溶液洗脱；(2)上硅胶柱层析分离，以大量的二元或三元有机溶剂洗脱。上述两种方法均使用较大量有较大毒性的有机溶剂，流程长且得率低，不适用于工业化大生产。
本发明的目的就是为了提供一种疗效确切、疗效高、毒副作用小、提取效率高的抗肿瘤药物及其生产方法。
本发明是这样实现的。
取葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄、蛇葡萄、小叶蛇葡萄、显齿蛇葡萄、光叶蛇葡萄的干燥的全株或根或叶，原料药经粉碎后，先用30～100％酒精浸泡过夜，滤过。药渣再用酒精回流提取1～3次。滤过。合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，使固体溶解。先用石油醚萃取2次，再用氯仿萃取3次，分去有机溶剂。水层液减压蒸馏至固体析出，经静置过夜，析出大量沉淀，过滤。所得固体再加入水加热溶解，加入粉末活性炭，煮沸后，趁热过滤。滤液再如上法经静置、析晶、水溶解、活性碳除杂质及重结晶，共1～3次。最后收集结晶，真空40℃干燥后，得白色针状结晶。取上述结晶，测定其理化性质如下：白色针状结晶，mp246～247℃。易溶于热水、热乙醇，溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水、乙酸乙酯，难溶于氯仿、石油醚。
进行结构鉴定：
[元素分析]C15H12O8实验值(％)：C56.04,H3.79；计算值(％)：C56.25,H3.78
[FAB-MS]m/z:321(M++1),315,304,292(M+-CO),291(M+-CHO),259,241,223,186,167,153,149,139,124
[UV]λmax MeOH,nm(logε):290.5(4.27),226.5(4.41)
[IR]]ymax KBr,cm-1:3200～3600(-OH),1717,1640(＞=O),1600,1548,1509,1472,1166,1084,1026,840
[1H-NMR](DMSO-d6)δ(ppm):11.89(1H,s,C3-OH),10.85(1H,s,C5-OH),5.85(2H,d,J=15.6Hz,C6,8-H),5.75(1H,s,C7-OH),4.41(1H,d,J=10.8Hz,C3-H),4.90(1H,d,J=10.8Hz,C2-H),6.39(2H,s,C2’,6’-H),8.23(1H,s,C4’-OH),8.93(2H,s,C3’5’-OH)[13C-NMR](DMSO-d6)δ(ppm):83.3,71.7,197.8,166.9,163.4,162.6,145.8,133.5,127.2,107.3,106.8,100.6,96.1,95.1,94.9
经分析,其结构式为
Figure A0011722500061
3,5,7,3’,4’,5’-hexahydroxy-2,3
化学名：3,5,7,3’,4’,5’,-六羟基-2,3-二氢黄酮，
又名：蛇葡萄素，二氢杨梅黄素、福建茶素
蛇葡萄素经小鼠腹腔注射，LD50为1034mg/kg(95％可限为866～1236mg/kg)，显示蛇葡萄素应用较为安全。与之相比抗肿瘤药氮烯咪胺的LD50为859mg/kg。
(一)蛇葡萄素对小鼠移植性黑色素瘤的抑制实验1．实验材料[药品与试剂]：注射用氮烯咪胺(DTIC)，噻唑蓝(MTT)、碘丙啶(PI)；RMPI-medium 1640；HEPES。[动物]：C57BL/6小鼠，雌雄兼用，体重(20±2)g。[细胞株]：小鼠黑色素瘤B16细胞。2．C57BL/6小鼠移植性黑色素瘤抑制实验2.1 动物荷瘤
收集对数生长期小鼠黑色素瘤B16细胞，用注射用水洗涤两次，1000rpm离心5min，弃取上清液，B16细胞重悬于生理盐水中，稀释至浓度为1×107个/ml的单细胞悬液。无菌条件下接种于C57BL/6小鼠两侧腹股沟皮下，接种量为每只0.1ml细胞悬液(相当于1×106个/只)2.2 给药方案
C57BL/6小鼠，于接种B16细胞后第一天，按体重完全随机分组。在蛇葡萄素的1/10～1/5LD50之间设三个剂量组，分别为0.280mmol/kg、0.420mmol/kg、0.560mmol/kg；另设生理盐水阴性对照组、溶剂对照组、及0.330mmol/kg氮烯咪胺阳性对照组，每组小鼠10只。从接种后第五天开始，连续腹腔注射给药9天(每日一次)。2.3 药液配制
蛇葡萄素0.280、0.420、0.560mmol/kg剂量组，均以30％二甲基亚砜为溶剂，0.330mmol/kg氮烯咪胺阳性对照组以生理盐水为溶剂。(药液均临时配制，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌)2.4 黑色素瘤生长抑制率(GI)
蛇葡萄素的体内抗黑色素瘤作用，以移植性黑色素瘤的生长抑制率来评价。荷瘤小鼠连续给药9天后，停药24h后处死。剥离黑色素瘤肿块称重以各处理组瘤重为指标与对照组瘤重比较，评价蛇葡萄素在体内的抗黑色素瘤的作用，蛇葡萄素对小鼠移植性黑色素瘤的生长抑制结果见表1。各组瘤重差异，应用SPSS PC/windows 9.0统计软件作单因素方差分析。
    表1 蛇葡萄素对小鼠移植性黑色素瘤的生长抑制结果
    组别   N(只) 瘤重(g) 抑制率％  t-检验
30％二甲亚砜溶剂对照组蛇葡萄素0.280mmol/kg剂量组蛇葡萄素0.420mmol/kg剂量组蛇葡萄素0.560mmol/kg剂量组DTIC阳性对照组0.330mmol/kg生理盐水对照组     101010101010 2.1700±0.73941.7150±0.28871.5700±0.55991.0500±0.29530.9430±0.50312.3100±0.4909     /25.7632.0354.5559.18/     /P＜0.05P＜0.05P＜0.05P＜0.05/
2.5 蛇葡萄素对小鼠移植性黑色素瘤的生长抑制结果
蛇葡萄素0.280mmol/kg、0.420mmol/kg、0.560mmol/kg剂量组小鼠连续给药9天后，小鼠黑色素瘤瘤重均有显著减小(P＜0.05)，抑制率分别为25.76％、32.03％、54.55％。3个剂量组均能有效抑制小鼠黑色素瘤的生长，且蛇葡萄素0.560mmol/kg剂量组与0.330mmol/kg氮烯咪胺阳性对照组疗效相当。3．流式细胞仪测含药血清对B16细胞周期及增殖的影响
浓度为5.25×104个/ml的B16细胞，按4ml/瓶接种至25ml培养瓶中。在5％CO2、37℃(饱和湿度)条件下培养24h后，加入蛇葡萄素0.420mmol/kg及0.560mmol/kg剂量组的小鼠10min时间点含药血清1ml(相当于20％体积的血清加入量)。在5％CO2、37℃(饱和湿度)条件下继续培养72h，收集细胞用无血清的RMPI-1640培养液将细胞洗涤后，重悬为单细胞悬液，加入-20℃预冷的乙醇(使含醇量至70％)固定，待测。PI染色30min，用350目筛网过滤，流式细胞仪检测含量及细胞周期分布，计算机软件处理结果。根据公式计算细胞分裂增殖指数(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100％。蛇葡萄素含药血清对B16细胞的周期影响如表2.
    表2．蛇葡萄素含药血清对B16细胞的周期影响
G1(％) S(％) G2M(％) PI(％)
空白对照0.420mmol/kg剂量组含药血清0.560mmol/kg剂量组含药血清   61.868.669.6   26.114.311.4   12.817.119   38.631.430.4
在2种剂量组蛇葡萄素含药血清的作用下，小鼠黑色素瘤B16细胞均表现为G1期及G2M期细胞含量相对比未加药阴性对照组细胞有不同程度的上升；S期细胞含量相对比未加药阴性对照组细胞则有不同程度的下降；细胞分裂增殖指数均降低；表明蛇葡萄素有可能抑制细胞的DNA合成。(二)蛇葡萄素对人的肿瘤细胞的抑制效果1．蛇葡萄素在2.7×10-4mol/L的浓度下，对人早幼粒白血病HL60细胞的抑制率达94.1％,IC50为3.4×10-5mol/L；对K562细胞的抑
制率为88.9％，其IC50为5.0×10-5mol/L；2． 蛇葡萄素对人鼻咽癌HK-1细胞株的IC50为1.4×10-4mol/L；3． 蛇葡萄素对人肝癌BEL-7402细胞株的IC50为1.1×10-4mol/L。
结果表示，蛇葡萄素对黑色素瘤及几种人的肿瘤细胞均有较好的抑制作用。提示是一种广谱抗癌药物。
将蛇葡萄素制备成药剂学上所说的任何剂型包括口服剂型如片剂、冲剂、胶囊、口服液等，也可制备成注射剂型，如注射用粉针剂、注射液等；也可以制成靶向制剂，如脂质体等。采用的制剂的辅料为药剂学常用的辅料，按常规生产方法制成所需剂型。还可以与其它抗肿瘤药物复方制成复方制剂。
本发明的药物剂型中含有重量比为0.01～99.5％的蛇葡萄素。
本发明的药物的用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、肿瘤类型而改变。其剂量可以是0.5～1g，可以皮下或肌肉注射，或静脉内注射或滴注，也可以口服用药。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1  从粤蛇葡萄中提取蛇葡萄素。
取葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄的干燥全株或嫩叶或根，原料药经粉碎后，先用2倍体积量的药用酒精(95％)浸泡过夜，滤过。药渣再用等体积量的95％酒精回流提取3次。滤过。合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，使固体溶解。先用等体积的60～90°石油醚萃取2次，再用等体积的氯仿萃取3次，分去氯仿层。水层液减压蒸馏至固体析出，经静置过夜，析出大量沉淀，过滤。所得固体再加入3倍重量水加热溶解，加入溶液总量1％～2％的粉末活性炭，煮沸10分钟，乘热过滤。滤液再如上法经静置、析晶、水溶解、活性碳除杂质及重结晶，共3次。最后收集结晶，真空40℃干燥后，得白色针状结晶。
取上述提取的蛇葡萄素100克，溶解于适量2％的吐温-80中，再加入适量甘露醇，经冻干，制成皮下或肌注注射用粉针剂。
本实施例1中，蛇葡萄素的得率为10.2％，纯度为98％以上。
实施例2，从蛇葡萄中提取蛇葡萄素，并制成片剂。
取蛇葡萄的干燥的全株或嫩叶或根，原料药经粉碎后，先用3倍体积量的药用酒精(50％)浸泡过夜，滤过。药渣再用半体积量的50％酒精回流提取3次。滤过。合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，使固体溶解。先用等体积的60～90°石油醚萃取2次，再用等体积的氯仿萃取3次，分去有机溶剂。水层液减压蒸馏至固体析出，经静置过夜，析出大量沉淀，过滤。所得固体再加入等重量水加热溶解，加入溶液总量4％～5％的粉末活性炭，煮沸10分钟，趁热过滤。滤液再如上法经静置、析晶、水溶解、活性碳除杂质及重结晶，共4次。最后收集结晶，真空40℃干燥后，得白色针状结晶。
取上述提取的蛇葡萄素，加淀粉制粒，加滑石粉、硬脂酸镁压片，制成蛇葡萄素片剂。
实施例3，将实施例2中的蛇葡萄，换成小叶蛇葡萄，其提取方法同实施例2。取上述提取的蛇葡萄素，用含适量乙醇20％的丙二醇溶解，再加入甘露醇，制成蛇葡萄素供静脉注射用粉针剂。
实施例4，将实施例1中的粤蛇葡萄换成显齿蛇葡萄，其提取方法同实施例1，按常规方法制成胶囊。
实施例5，将实施例1中的粤蛇葡萄换成光叶蛇葡萄，回流提取的酒精浓度换为30％，其提取工艺同实施例1，按常规方法制成口服液。
本发明的各实施例具有相同的疗效。本发明不限于上述实施例。

Claims (8)

1．一种抗肿瘤药物，其结构式为
Figure A0011722500021
化学名：3,5,7,3’,4’,5’-六羟基-2,3-二氢黄酮。
2．根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于剂型采用药剂学上所说的任何剂型。
3．根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于剂型采用注射剂。
4．根据权利要求1或3所述的抗肿瘤药物，其特征在于注射剂采用粉针剂。
5．根据权利要求所述的抗肿瘤药物，其特征在于与其它抗肿瘤药物制成复方制剂。
6．权利要求1所述的抗肿瘤药物的生产方法，为中药提取方法，其原料为粤蛇葡萄、蛇葡萄、小叶蛇葡萄，显齿蛇葡萄、光叶蛇葡萄、大叶蛇葡萄的干燥的全株或根或叶，原料药经粉碎后，先用30～100％酒精浸泡过夜，滤过；药渣再用酒精回流提取1～3次。滤过；合并滤液。回收酒精至有固体析出，加入适量水，使固体溶解；先用石油醚萃取2次，再用氯仿萃取3次，分去有机溶剂；水层液减压蒸馏至固体析出，经静置过夜，析出大量沉淀，过滤；所得固体再加入水加热溶解，加入粉末活性炭，煮沸后，趁热过滤；即得。
7．根据权利要求2所述的抗肿瘤药物的生产方法，其特征在于经石油醚、氯仿萃取后的水层减压蒸馏后析出的固体，加水溶解后，投入的活性炭的用量为溶液总量的1～5％。
8．根据权利要求2所述的抗肿瘤药物的生产方法，其特征在于用活性炭除杂质及重结晶共3～5次。
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