CN101045721B - 蛇葡萄素不饱和钠盐的制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的蛇葡萄素不饱和钠盐，及其制法和用途。本发明的蛇葡萄素不饱和钠盐与蛇葡萄素相比，其物理化学性质发生了显著的不同；经动物毒性试验证明两者的毒性发生了根本性的变化；药理试验证明，蛇葡萄素不饱和钠盐具有与许多抗肿瘤药物协同作用，可大大减少肿瘤药物的使用剂量而不影响疗效。

Description

蛇葡萄素不饱和钠盐的制剂及其应用 

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地，涉及一种新的蛇葡萄素不饱和盐，及其制法和用途。 

背景技术

蛇葡萄素(AMP)是一种已知的来自植物的化合物，其二水合物的分子式为：C₁₅H₁₂O₈·2H₂O，结构式如下： 

蛇葡萄素(AMP)被证明具有抗肿瘤的药理作用，同时AMP与其他肿瘤药物配伍使用，可以显著地降低肿瘤药物的使用剂量，从而达到降低肿瘤药物副作用的效果。 

AMP也存在着很大的障碍，这主要是因为AMP在水溶液中的溶解度非常低，需采用异丙醇，DMSO，DMF等有机试剂助溶。而有机试剂存在着较大的毒性，不适合作为临床药物的使用。另一方面，AMP本身也有较大的毒性，这也为药物使用的安全性方面带来一些问题。 

因此，本领域迫切需要开发减低蛇葡萄素毒性的方法。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种显著减低蛇葡萄素毒性的方法和制剂。 

在本发明的第一方面，提供了一种蛇葡萄素盐或其衍生物，所述的蛇葡萄素盐是用一价阳离子替代蛇葡萄素上的氢原子所形成的盐，且所述替代为不饱和替代。 

在另一优选例中，所述的衍生物是水合物、或溶剂合物(solvate)。 

在另一优选例中，所述的蛇葡萄素盐具有式I所示： 

C₁₅H₆O₈H_αM_β(I) 

式中， 

M为选自下组的一价阳离子：Li⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺或其组合； 

α+β＝6，2≤β≤5。 

在另一优选例中，M为Na。 

在另一优选例中，所述的蛇葡萄素盐为具有蛇葡萄素不饱和钠盐的二水合物或五水合物。 

在另一优选例中，所述的衍生物是α＝2，β＝4的含不饱和钠盐蛇葡萄素的水合物，分子式为：C₁₅H₈O₈Na₄·5H₂O。 

在另一优选例中，所述的五水合物具有下式结构： 

在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明所述的蛇葡萄素盐或其衍生物的方法，包括步骤： 

(a)将蛇葡萄素与式II所示的成盐剂反应，形成式I所示的蛇葡萄素盐； 

[0022] 蛇葡萄素+M_mZ→C₁₅H₆O₈H_αM_β

[0023] 式II    式I 

式中， 

M为选自下组的一价阳离子：Li⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺或其组合， 

Z为选自下组的阴离子：HCO₃ ^-，CO₃ ^2-，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，Ac^-、或其组合； 

m为1、2、或3， 

α+β＝6，2≤β≤5。 

其中步骤(a)中，蛇葡萄素摩尔数与成盐剂中M的摩尔数之比为1∶2至1∶5； 

(b)分离出形成的蛇葡萄素盐或其水合物。 

在另一优选例中，所述的成盐剂选自下组：碳酸氢钠、碳酸钠、或其组合。 

在另一优选例中，所述的步骤(a)中反应在水性溶剂或水中进行，温度为4-80℃。 

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明所述的蛇葡萄素盐或其衍生物以及药学上可接受的盐。 

在另一优选例中，所述的药物组合物是注射剂、溶液剂、片剂、冻干粉剂、或胶囊。 

在另一优选例中，所述的药物组合物含有0.2ug～500mg/ml蛇葡萄素盐。 

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有额外的抗肿瘤药物。 

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自下组：卡铂、5FU、阿霉素、CTX、秋水仙素、或其组合物。 

在本发明的第四方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，它包括步骤：给需要治疗的对象使用安全有效量的本发明所述的蛇葡萄素盐或其衍生物。 

在另一优选例中，还包括在施用蛇葡萄素盐或其衍生物之前、之后或之中，施用额外的抗肿瘤药物。 

在另一优选例中，所述的安全有效量是施用1-5000mg蛇葡萄素盐/人/次。 

在本发明的第五方面，提供了一种制备药物组合物的方法，它包括步骤： 

(a)将式I所示的蛇葡萄素盐或其衍生物与药学上可接受的载体混合，从而形成药物组合物： 

C₁₅H₆O₈H_αM_β    (I) 

式中， 

M为选自下组的一价阳离子：Li⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺或其组合； 

α+β＝6，2≤β≤5。 

在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括混入额外的抗肿瘤药物。 

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自下组：卡铂、5FU、阿霉素、CTX、秋水仙素、或其组合物。 

在本发明的第六方面，提供了本发明的蛇葡萄素盐或其衍生物的用途，它们被用于制备抗肿瘤的药物，或者与其他肿瘤药物配伍使用，从而降低其他肿瘤药物副作用。 

附图说明

图1显示了AMP-Na与AMP-DMSO在48h和72h对K562细胞的杀伤作用量效曲线的比较。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，使用一价碱金属离子的弱酸盐对AMP进行成盐修饰，并且对于AMP上6个游离氢原子进行不饱和替代，可显著改变其理化性质。采用饱和替代或不作任何替代时，AMP的溶解性质基本没有任何改变，在水溶液中不易溶解或逐步折出成微晶，导致注射后对人体的局部刺激反应。而采用一价阳离子进行不饱和替代(如以2-5摩尔一价阳离子比1摩尔AMP进行替代)，就可以显著提高AMP的溶解度。 

术语 

如本文所用，术语“AMP”指蛇葡萄素。 

如本文所用，术语“AMP-M”指用成盐修饰法，对蛇葡萄素进行部分成盐修饰，得到的不饱和一价阳离子蛇葡萄素盐(下简称：AMP-M)。 

如本文所用，术语“蛇葡萄素盐或其衍生物”指蛇葡萄素盐、其水合物、或溶剂合物。 

如本文所用，术语“本发明的蛇葡萄素盐”、或“不饱和的蛇葡萄素盐”、“一价阳离子的不饱和蛇葡萄素盐”可互换使用，都指部分取代蛇葡萄素中的6个羟基中的氢而形成的盐。此外，还术语还可包括蛇葡萄素盐的活性衍生物(如水合物或溶剂合物)。 

如本文所用，术语“AMP-Na₄”指用4个钠离子取代蛇葡萄素分子中6个羟基中4个氢而形成的盐或衍生物(如水合物)。 

成盐剂 

可用于本发明的成盐剂没有特别限制，可以是常规的强碱弱酸型盐。可以是由强碱离子与弱酸根形成的强碱弱酸型盐。 

代表性的弱酸根包括Ac，HPO₄，H₂PO₄，HCO₃，CO₃等，较佳的是采用HCO₃，CO₃，更佳的是采用CO₃，使pH值更稳定地达到中性范围。 

代表性的强碱离子是Li⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺或其组合；更佳地是钠离子。 

在另一优选例中，所述的成盐剂选自下组：碳酸氢钠、碳酸钠、或其组合。 

制备方法 

本发明还提供了一种制备蛇葡萄素盐的方法，它包括步骤： 

(a)将蛇葡萄素与式II所示的成盐剂反应，形成式I所示的蛇葡萄素盐； 

[0066] 蛇葡萄素+M_mZ→C₁₅H₆O₈H_αM_β

[0067] 式II       式I 

式中， 

M为选自下组的一价阳离子：Li⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺或其组合， 

Z为选自下组的阴离子：HCO₃ ^-，CO₃ ^2-，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，Ac^-、或其组合； 

m为1、2、或3， 

α+β＝6，2≤β≤5。 

其中步骤(a)中，蛇葡萄素摩尔数与成盐剂中M的摩尔数之比为1∶2至1∶5； 

(b)分离出形成的蛇葡萄素盐或其水合物。 

通常，所述的步骤(a)中反应在水性溶剂(与水与乙醇的混合溶剂)或水中进行，温度为4-80℃。 

药物组合物 

本发明的蛇葡萄素盐可用于治疗或辅助治疗肿瘤。通常，可将本发明的蛇葡萄素盐配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。 

本发明的蛇葡萄素盐可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤方面的治疗。在使用本发明蛇葡萄素盐时，还可同时使用其他治疗剂，如卡铂、5FU、阿霉素、CTX、秋水仙素、或其组合物等。 

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％，更佳地0.01-90wt％)的本发明蛇葡萄素盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。 

这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针 剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。 

一种优选的药物制剂是蛇葡萄素盐浓度为0.2ug～500mg/ml的纯溶液。 

此外，在本发明的药物组合物中可添加或不添加无药理作用的其他化学试剂作为PH调节剂、稳定剂、助溶剂等等复配成份。 

本发明的药物组合物可制成单元剂型或多元剂型，可以单独或混合施用，可以应用于治疗肿瘤的药剂和/或药物增效剂。 

使用药物组合物时，是将安全有效量的ZZ蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 

本发明的主要优点在于： 

(a)溶解度高、稳定性好。采用成盐修饰后的AMP-M，溶解性质大大提高，并且该溶解性质很稳定，连续15天的稳定性观察未见任何混浊、析出等现象；且该成盐后的AMP-M可以与目前临床上广泛使用的磷酸缓冲液任意比例稀释调配而不影响产品质量或改变其理化性质。 

(b)毒性降低。本发明的经修饰的AMP-M，给予小鼠大容量注射后，未见有任何毒副作用，采用最大溶解度和最大容量施药后，动物半数致死剂量大于2g/kg；而使用AMP在1g/kg的剂量，半数动物致死。因此，可见AMP-M的毒性性质大大改变；更适合药物在安全性方面的评判。 

(c)可与其他肿瘤药物配伍使用。经修饰的AMP-M，可与多种肿瘤药物配伍使用，可以大幅度减少药物使用剂量，降低药物毒性，充分发挥出肿瘤药物的作用，是一种强烈的增效剂。同时，由于改变了溶解性质和毒性性质，使大剂量直接使用AMP-M成为可能，因此，AMP也可单独作为一种抗肿瘤的药物制剂应用于临床。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计算。 

实施例1AMP-Na盐的制备及溶解度和稳定性测定 

AMP与NaHCO₃按不同摩尔浓度比(即1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)计算用量，将AMP先用5％乙醇溶解，再按浓度比加入不同量NaHCO₃及双蒸水使之充分溶解，观察溶解时间、溶解稳定性并测量溶液pH值。取AMP与Na₂CO₃，按质量比AMP∶Na₂CO₃(w/w)＝5∶2、5∶3、5∶4计算药物、双蒸水用量并分别配制AMP-Na受试液，取一定量的受试液分别用生理盐水或pH＝6、6.5、7.0、7.4、8.0磷酸盐缓冲液10倍稀释，观察溶液的pH值、溶解情况和不同条件下放置溶液的稳定性。 

结果： 

AMP与NaHCO₃成盐溶解情况见下表： 

*室温为24℃。 

AMP与Na₂CO₃成盐溶解情况： 

按AMP∶Na₂CO₃(w/w)＝5∶2配制，AMP不能完全溶解，有微小颗粒析出。 

按AMP∶Na₂CO₃(w/w)＝5∶3配制，AMP可完全溶解，具体结果见下表： 

*AMP-Na受试液配制：AMP 0.025g+Na₂CO₃0.015g+双蒸水1ml 

*室温为24℃。 

结论： 

AMP纯品为白色粉末，不溶于水，溶于二甲基亚砜。而将AMP分别与NaHCO₃ 或Na₂CO₃按一定比例制成AMP钠盐溶液，可使AMP的溶解性显著提高。 

通过比较AMP与NaHCO₃和Na₂CO₃成盐溶解性和稳定性，可以将AMP和Na₂CO₃按溶液中摩尔数Na∶AMP＝4∶1进行配制，此时AMP可立即完全溶解，且稳定性可靠，溶液经pH＝6、6.5、7.0、7.4、8.0磷酸盐缓冲液10倍稀释后，4℃保存溶解性不变。 

实施例2AMP-Na₄盐的药理作用以及同AMP的比较 

运用MTT法，比较AMP-Na与AMP-DMSO体外对人白血病K562细胞的杀伤作用，以观察AMP钠盐制剂与传统DMSO溶解方法在药效学作用方面是否存在差异。经比较AMP-Na与AMP-DMSO在48h和72h对K562细胞的杀伤作用，结果发现AMP-DMSO的IC50值为32.27μg/ml，AMP-Na的IC50值为29.56μg/ml，二者对人白血病K562细胞的体外杀伤作用无明显差异。 

药物采用：AMP粉末颗粒0.5g/支(购自中山医科大学化学教研室)，Na₂CO₃(分析纯)，双蒸水，磷酸盐缓冲液(PH＝6.5、7.4)，二甲亚砜(DMSO)，5-氟脲嘧啶(5-FU，上海旭东海普药业有限公司生产，批号：H31020593)，RPMI1640培养液，小牛血清，MTT，10％SDS。 

按如下方法配制： 

①AMP-Na：根据实施例1的方法，选择AMP∶Na₂CO₃(w/w)＝5∶3的比例制备AMP-Na溶液，再用pH＝6.5磷酸盐缓冲液将其10倍稀释，制成AMP-Na贮备液。用pH＝7.4磷酸盐缓冲液将AMP-Na贮备液配成细胞用浓度。 

②AMP-DMSO：AMP用5％DMSO溶解并配成细胞用浓度。 

③5-FU：用生理盐水将5-FU配成细胞用浓度。 

以上各药物均为临用前新鲜配制，药物细胞用终浓度均为100、50、25、12.5、6.25μg/ml。 

肿瘤细胞株： 

人白血病K562细胞，购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。 

细胞培养： 

所用细胞为RPMI 1640培养液培养，培养液中含有10％小牛血清和100U/ml的青霉素、链霉素。 

实验分组： 

实验设空白对照组(溶媒+RPMI1640培养液)、阴性对照组(溶媒+细胞悬液)、阳性对照组(5-FU)、DMSO+AMP组和AMP-Na组。 

实验方法： 

①收集处于对数生长期的K562细胞，1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1×10⁵/ml。 

②96孔培养板中以10ul/孔依次加入不同浓度药物，以90ul/孔加入细胞悬液或培养液，置CO₂孵箱培养。 

③于实验终止前4h以10ul/孔加入MTT，继续培养至48或72小时，再以100ul/孔加入10％SDS终止实验。 

④培养板用微量震荡器震荡10分钟，于波长570nm处测定吸光值，打印并记录结果。 

数据统计： 

按下式计算抑制率： 

抑制率(％)＝[(阴性OD均值-空白OD均值)-(受试药OD均值-受试药空白OD均值)]/(阴性OD均值-空白OD均值)×100/％ 

由药物浓度对抑制率进行线性回归，计算IC50值。 

实验结果： 

通过测定量效曲线，比较AMP-Na与AMP-DMSO在48h和72h对K562细胞的杀伤作用的强弱，结果发现细胞培养48h时AMP-DMSO和AMP-Na的IC50值分别为32.27μg/ml和29.56μg/ml，细胞培养72h时AMP-DMSO和AMP-Na的IC50值分别为4.09μg/ml和4.23μg/ml，二者对人白血病K562细胞的体外杀伤作用无明显差异(图1)。 

AMP-DMSO与AMP-Na的IC50比较 

结论： 

以前AMP用二甲基亚砜为溶媒助溶，但该法溶解度低，而且此溶媒很难应用于临床；且在进行体外、体内实验时，二甲基亚砜对实验结果存在一定的干扰。本发明述及的方法制备的AMP-Na溶液，并用pH＝6.5磷酸盐缓冲液调节其pH至7.4，考察AMP钠盐制剂与DMSO助溶方法在药效学作用方面是否存在差异，本实验运用MTT法，比较了AMP-Na与AMP-DMSO 48h和72h对人白血病K562细胞的体外杀伤作用，结果发现AMP-Na对K562细胞的体外杀伤作用与AMP-DMSO的作用相似。且AMP-Na为水溶性，可用于临床，是AMP最理想的制剂方法。 

实施例3AMP-Na₄盐的抗肿瘤作用及增效作用 

为研究AMP-Na的抗肿瘤作用，并确定其单独用药对肿瘤生长的影响及与化疗药联合应用的协同作用，本实施例中，用荷S180肉瘤的KM小鼠对AMP-Na的体内抑瘤作用进行了试验。实验共观察了AMP-Na单独用药及与3种化疗药(CTX、5-FU和卡铂)联合应用的协同作用。小鼠腋窝皮下接种小鼠S180肉瘤细胞 0.5-1×10⁶细胞/只，接种后次日分组给药。联合用药组先腹腔注射化疗药，15分钟后再腹腔注射AMP-Na，二者均为隔日给药1次，共给药6-8次。实验终点时取瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。以抑瘤率40％并经统计学处理P＜0.05为有效，观察受试药的抑瘤效果。实验结果发现AMP-Na单独用药无或仅有较弱的抗肿瘤作用，而AMP-Na与化疗药合用对S180肉瘤却具有明显的协同抗肿瘤作用。具体实验结果如下： 

按实施例1中的方法制备AMP-Na，再用PH＝6.5的磷酸盐缓冲液180ml调整溶液PH值，使PH＝7.2。溶液经0.45、0.22um滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。AMP-Na临用前用经高压灭菌的PH＝7.4的磷酸盐缓冲液配制成目的浓度后给药。 

1.25-FU、CTX和卡铂均为用前用生理盐水新鲜配制。 

动物采用昆明种小鼠，SPF级，18-22g，雌雄兼用，购自兰州大学实验动物中心(生产许可证号：医动字第14-005)。同一批实验使用同一性别的动物。 

肿瘤细胞株为小鼠S180肉瘤细胞株，均用昆明种小鼠腹腔内传代保种。 

移植瘤种植及药物治疗：无菌取S180和H22细胞悬液(2.5×10⁶个细胞/ml)，每鼠0.2ml接种于小鼠右侧腋窝皮下(相当于每鼠接种5×10⁵个细胞)。接种次日随机分组，给予药物治疗。给药方法为AMP-Na 50、75、112、167mg/kg，0.1ml/10g，ip；联合用药时，给化疗药后15分钟再给AMP-Na。两者均隔日给药一次，共6-8次。 

肿瘤重量测定及抑瘤率(％)的计算：于末次给药后次日称体重，处死动物，解剖剥取瘤块，称瘤重。按下式计算抑瘤率(％)： 

抑瘤率(肿瘤生长抑制率，％)＝(阴性对照组平均瘤重(g)-给药组平均瘤重(g))/阴性对照组平均瘤重(g)×100％ 

有效判定标准：抑瘤率(即肿瘤生长抑制率)＜40％为无效；抑瘤率40％并经统计学处理P＜0.05为有效。 

实验结果： 

1.AMP-Na与CTX在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用。 

与阳性对照组相比，AMP-Na与CTX联合用药组可使肿瘤重量明显减轻，差别有显著性；其中AMP-Na 50、75mg/kg与CTX联合用药组的瘤重明显低于CTX 单独用药组。AMP-Na 50、75、112、167mg/kg单独用药组的抑瘤率分别为7.66、6.84、-3.86和-16.25％；AMP-Na 50、75、112、167mg/kg与CTX联合用药组的抑瘤率分别为64.45、68.07、46.13和64.52％；CTX组抑瘤率为53.30％。 

AMP-Na与CTX在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用 

*代表p＜0.05，**代表p＜0.01 

2.AMP-Na与5-FU在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用。 

与阳性对照组相比，AMP-Na与5-FU联合用药组可使肿瘤重量明显减轻，差别有显著性，并且对肿瘤的抑制率有剂量依赖性关系；其中AMP-Na 50、75、112mg/kg与5-FU联合用药组的瘤重明显低于5-FU单独用药组。AMP-Na 50、75、112、167mg/kg单独用药组的抑瘤率分别为4.43、31.28、33.49和4.45％；AMP-Na 50、75、112、167mg/kg与5-FU联合用药组的抑瘤率分别为57.75、51.87、59.21和36.65％；5-FU组抑瘤率为45.55％。 

AMP-Na与5-FU在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用 

*代表p＜0.05，**代表p＜0.01 

3.AMP-Na与卡铂在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用。 

与阳性对照组相比，AMP-Na与卡铂联合用药组可使肿瘤重量明显减轻，差别有显著性；其中AMP-Na 50、75、112、167mg/kg与卡铂联合用药组的瘤重明显低于卡铂单独用药组。AMP-Na 50、75、112、167mg/kg单独用药组的抑瘤率分别为23.22、3.99、13.87和-7.47％；AMP-Na 50、75、112、167mg/kg与卡铂联合用用药组的抑瘤率分别为65.11、54.35、66.37和59.26％；卡铂的抑瘤率为49.52％。 

AMP-Na与卡铂在治疗小鼠肉瘤S180时的协同作用 

*代表p＜0.05，**代表p＜0.01 

结论 

AMP-Na腹腔注射与3种化疗药CTX、5-FU和卡铂联合应用均具有协同抗小鼠S180肉瘤的作用。AMP-Na 50-167mg/kg与化疗药5-FU、CTX和卡铂联合应用，可不同程度抑制小鼠S180肉瘤的生长，同单独应用化疗药5-FU、CTX和卡铂组相比，差别有显著性。剂量为75-112mg/kg范围内的AMP-Na与化疗药合用抗小鼠S180肉瘤的作用更为明显。 

实施例4AMP-Na₄盐的毒性研究 

为研究AMP-Na对小鼠的急性毒性作用，确定其LD50值及最大耐受量，并与AMP作对比。 

用昆明种小鼠给予AMP-Na静脉注射，观察给药后7天内动物死亡表现及死亡分布情况。慢性死亡动物解剖取主要脏器及肉眼可见病变脏器，固定，做病 理切片观察。结果，AMP-Na静脉注射，雄性和雌性小鼠的LD50值均大于2000mg/kg，LD0＞1000mg/kg。而AMP-DMSO组中动物的LD50值为1000mg/kg，表明可显著降低毒性. 

取AMP-PEG溶液5ml，加Na₂CO₃1.25g使AMP∶N a₂CO₃(w/w)＝5∶3，加生理盐水36.25ml及37％HCl 0.75ml，得AMP-Na浓度为50mg/ml(其中溶媒的浓度为PEG 4000.03g/ml，丙二醇0.0445g/ml，乙醇0.015g/ml)，最终AMP-Na溶液的pH值为7.3。将AMP-Na贮备液用生理盐水配成所需浓度，按0.2ml/10g，腹腔或静脉注射给药。 

实验动物为昆明种小鼠，SPF级，18-22g，雌雄兼用，购自兰州大学实验动物中心(生产许可证号：医动字第14-005)。实验分别设AMP-Na溶媒组和AMP-Na系列剂量组，具体分组见结果。各组数据均为计数资料，用DAS软件进行计算分析。 

结果： 

AMP-Na 1000mg/kg一次静脉注射给药结果统计： 

AMP-Na总量2000mg/kg分2次静脉注射给药结果统计： 

AMP-DMSO总量1000mg/kg一次静脉注射给药结果统计： 

结论： 

小鼠LD50值大于2000mg/kg。其中雄性动物对AMP-Na的最大耐受量大于2000mg/kg；静注LD₀＞1000mg/kg；而采用DMSO为溶媒时，LD50为1000mg/kg。 

实施例5蛇葡萄素钠盐的化学结构分析 

对实施例1中制备的AMP钠盐，分子式为：C₁₅H₈O₈Na₄·5H₂O，进行了化学结构分析 

【热重分析】 

室温(20℃)至80.2℃失重量3.41％，80.2℃至176.0℃失重量12.31％，总计15.72％，该值与样品中4.5个结晶水的理论计算值16.57％基本相符。在差示扫描量热法检测结果也显示在119.6℃出现吸热峰，间接佐证了该结构中结晶水的存在。 

【元素分析】 

结果证明，样品中的碳、氢元素含量实测值分别为35.87％、3.66％，与理论计算值(碳、氢分别为36.16％、3.64％)基本一致。 

【离子色谱分析】 

测定样品中的钠元素含量实测值为18.6％，与理论计算值(18.46％)基本相符。 

【紫外吸收光谱】 

在水溶剂中的紫外吸收光谱显示，E带存在芳环的精细结构，分别在204.6nm、206.1nm、210.1nm及218.1nm出现4个吸收峰；B带在328.3nm出现1个吸收峰，比无钠的蛇葡萄素(在甲醇中)的吸收峰292.2nm红移了36.1nm。 

【核磁共振谱】 

仪器：美国Varian ^UNITY INOVA 500超导脉冲付里叶变换核磁共振谱仪 

(1)氢谱 

¹H核磁共振谱数据及解析 

溶剂：DMSO 

谱峰序  号	蛇葡萄素化  学位移δ  (ppm)	蛇葡萄素钠  盐化学位移  δ(ppm)	蛇葡萄素钠盐经  中和至pH6的化  学位移δ(ppm)	裂分峰  数	质子  数	备注
							a	4.45	4.05	4.41	d	1	3位CH
b	4.94	4.49	4.90	d	1	2位CH
							c	5.73		5.73	br s	1	3位OH
d	5.90	5.05	5.86	d	1	8位CH
							e	5.94	5.07	5.90	d	1	6位CH
f	6.45	6.28	6.44	s	2	2’/6’位CH
							g	8.16	8.29	8.30	br s	1	4’位OH
h	8.89		8.88	br s	2	3’/5’位OH
							i	10.82		10.90	br s	1	7位OH
j	11.87	12.3(br  s)	11.88	s	1	5位OH

[0192] (2)碳谱 

¹³C核磁共振谱数据及解析 

谱峰  序号	蛇葡萄素化学  位移δ(ppm)  (溶剂DMSO)	蛇葡萄素钠盐化学  位移δ(ppm)  (溶剂D2O)	多重性  (DEPT)	碳原  子数	备注
						A	71.83	71.64	d	1	3位CH
B	83.40	83.72	d	1	2位CH
						C	95.16	97.92	d	1	8位CH
D	96.20	99.05	d	1	6位CH
						E	100.65	99.82	s	1	10位C
F	107.19	107.50	d	2	2’/6’位CH
						G	127.37	126.34	s	1	1’位C
H	133.63	137.29	s	1	4’位C
						I	145.86	147.61	s	2	3’/5’位C
J	162.66	161.72	s	1	9位C
						K	163.49	162.84	s	1	5位C
L	166.95	163.46	s	1	7位C
						M	197.58	194.04	s	1	C＝O

注：由于蛇葡萄素钠盐在DMSO溶剂中的溶解度较差，故采用D₂O作溶剂。 

从氢谱和碳谱数据可得到如下信息： 

(1)蛇葡萄素钠盐位于12.3(1H，br s)ppm处，显示了5位羟基质子与4位氧形成分子内氢键。 

(2)与蛇葡萄素的氢谱比较，蛇葡萄素钠盐氢谱在3位OH、7位OH、3’/5’位OH的吸收峰消失。 

(3)与蛇葡萄素的碳谱比较，蛇葡萄素钠盐碳谱在8位CH、6位CH、4’位C、3’/5’位C、7位C以及C＝O的吸收峰约位移了2～3ppm。 

(4)蛇葡萄素钠盐经中和至pH6的氢谱与蛇葡萄素的氢谱，各个H的化学位移基本一致。 

上述结果说明，蛇葡萄素形成钠盐后，其A环、B环和C环3个环结构没发生 变化，2，3位的氢仍然存在，5位羟基质子与4位氧形成了分子内氢键。综合上述数据，推测在3、7、3’、5’位OH上的每个H分别被Na取代。 

蛇葡萄素钠盐(Amp-Na)的分子式为C₁₅H₈O₈Na₄·5H₂O，相对分子质量498.03，其结构式如下： 

实施例6蛇葡萄素钠盐的制备例II 

重复实施例1的步骤，不同点在于用摩尔比为1∶2的Na₂HPO₄替换碳酸氢钠。 

结果，同样制得AMP钠盐，分子式为：C₁₅H₈O₈Na₄·5H₂O。 

测试结果表明，形成的蛇葡萄素钠盐的溶解性和稳定性同样有显著改善。 

实施例7蛇葡萄素钠盐的制备例III 

重复实施例1的步骤，不同点在于用摩尔比为1∶4的NaAc替换碳酸氢钠。 

结果，同样制得AMP钠盐，分子式为：C₁₅H₈O₈Na₄·5H₂O。 

测试结果表明，形成的蛇葡萄素钠盐的溶解性和稳定性同样有显著改善。 

实施例8含蛇葡萄素钠盐的药物组合物 

制备以下配方的药物组合物。 

AMP钠盐，分子式为：C15H8O8Na4·5H2O	500毫克
		50mM PBS缓冲液(pH 6.8)	50毫升

该药物组合物可用于抑制肿瘤。 

实施例9含蛇葡萄素钠盐的复方药物组合物 

制备以下配方的药物组合物。 

AMP钠盐，分子式为C15H8O8Na4·5H2O	500毫克
		CTX	25毫克
50mM PBS缓冲液(pH 6.8)	50毫升

该药物组合物可利用AMP钠盐和CTX的协同效果，降低CTX的副作用。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (9)

1.一种蛇葡萄素盐或其衍生物，其中所述的衍生物是水合物，其特征在于，所述的蛇葡萄素盐是用一价阳离子替代蛇葡萄素上的氢原子所形成的盐，

并且，所述的蛇葡萄素盐具有式I所示：

C₁₅H₆O₈H_αM_β            (I)

式中，

M为选自下组的一价阳离子：K⁺、Na⁺或其组合；

α+β＝6，2≤β≤5。

2.如权利要求1所述的蛇葡萄素盐或其衍生物，其特征在于，M为Na。

3.如权利要求2所述的蛇葡萄素盐或其衍生物，其特征在于，所述的蛇葡萄素盐的衍生物为蛇葡萄素不饱和钠盐的二水合物或五水合物。

4.如权利要求3所述的蛇葡萄素盐或其衍生物，其特征在于，所述的五水合物具有下式结构：

5.一种制备权利要求1所述的蛇葡萄素盐或其衍生物的方法，其中所述的衍生物是水合物，其特征在于，包括步骤：

(a)将蛇葡萄素与式II所示的成盐剂反应，形成式I所示的蛇葡萄素盐；

蛇葡萄素+M_mZ→C₁₅H₆O₈H_αM_β

         式II         式I

式中，

M为选自下组的一价阳离子：K⁺、Na⁺或其组合，

Z为选自下组的阴离子：HCO₃ ^-，CO₃ ^2-，PO₄ ^3-，HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，Ac^-或其组合；

m为1、2或3，

α+β＝6，2≤β≤5；

其中步骤(a)中，蛇葡萄素摩尔数与成盐剂中M的摩尔数之比为1∶2至1∶5；

(b)分离出形成的蛇葡萄素盐或其水合物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的成盐剂选自下组：碳酸氢钠、碳酸钠或其组合。

7.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1-4中任一所述的蛇葡萄素盐或其衍生物，其中所述的衍生物是水合物。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有额外的抗肿瘤药物，其中所述的抗肿瘤药物选自：卡铂、5FU、或CTX。

9.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)将式I所示的蛇葡萄素盐或其衍生物与药学上可接受的载体混合，其中所述的衍生物是水合物，从而形成药物组合物：

C₁₅H₆O₈H_αM_β                   (I)

式中，

M为选自下组的一价阳离子：K⁺、Na⁺或其组合；

α+β＝6，2≤β≤5。

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