CN101433535A - 一种用于肿瘤化学治疗中的新型增敏和增效物质 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物学领域，公开了短叶老鹳草素的新用途，用于制备抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂。本发明首次揭示短叶老鹳草素在提高肿瘤对抗肿瘤药物敏感性方面的新用途，可有效逆转肿瘤对肿瘤药物的多药耐药性，并且所述的短叶老鹳草素毒性低、来源丰富，具有极好的药用前景。

Description

一种用于肿瘤化学治疗中的新型增敏和增效物质

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及一种对于肿瘤化学治疗有用的新型增敏和增效物质及其用途。

背景技术

多药抗药性(multidrug resistance，MDR)是指癌细胞接触一种来源于天然的抗肿瘤药物并产生抗药性的同时，对结构和作用机理不同的多种来源于天然的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。肿瘤病人在经过化疗后，往往会产生多药抗药性。多药抗药性是导致肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗急需解决的难题之一。多药抗药性的形成机理复杂。肿瘤细胞可通过不同途径导致MDR的产生，同时，单个MDR细胞可同时存在多种抗药性的机制。任何一种或多种机制联合作用均可导致MDR的产生。

MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。尽管许多化合物或药物具有体外逆转MDR的作用，但由于毒副作用很大，无临床应用价值。可作为临床应用的MDR逆转剂的药物至今尚未开发成功。

一些对于MDR有逆转效果的制剂的使用，尽管可以提高化疗药物的抗癌活性，但同时也增加了化疗药物的数量，加重了化疗病人的负担。反之，如果可找到在增加抗癌药物疗效的同时，又无毒副作用和抗药性的物质，那么癌症患者的生活质量将很大程度地得到改善。

因此，寻找低毒、不易产生MDR的物质或有效的MDR逆转物质是肿瘤化疗治疗领域急需解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种短叶老鹳草素作为抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂的用途。

本发明的另一目的在于提供一种含有短叶老鹳草素和抗肿瘤药物的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供一种短叶老鹳草素(Brevilin，6-O-angeloylenolin)的用途，用于制备抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自：长春新碱；阿霉素；顺铂；5-氟尿嘧啶；丝裂霉素；羟基喜树碱；或它们的混合物。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自：鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；前列腺癌；肺癌；宫颈癌；白血病；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤；软组织肿瘤；骨肿瘤；皮肤及附件肿瘤；恶性黑色素瘤；或神经系统肿瘤。

在另一优选例中，所述的增敏剂或逆转剂用于提高抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的累积量。

在本发明的第二方面，提供一种抗肿瘤的药物组合物，含有：

(a)有效量的短叶老鹳草素，和

(b)有效量的抗肿瘤药物；

其中，所述抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

在另一优选例中，短叶老鹳草素与抗肿瘤药物的重量比为1:(0.1-10000)。

在另一优选例中，短叶老鹳草素与抗肿瘤药物的重量比为1:(1-1000)；更优选的重量比为1:(1-200)。

在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有：

(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自：鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；前列腺癌；肺癌；宫颈癌；白血病；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤；软组织肿瘤；骨肿瘤；皮肤及附件肿瘤；恶性黑色素瘤；或神经系统肿瘤。。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂。

在本发明的第三方面，提供一种体外(优选非治疗性地)抑制肿瘤细胞的方法，所述方法包括：

给予肿瘤细胞有效量的有效量的短叶老鹳草素和有效量的抗肿瘤药物；

其中所述抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了不同浓度短叶老鹳草素对HCT-8和HCT-8/VCR细胞存活率的影响。

图2显示了短叶老鹳草素对耐药细胞内长春新碱累积的影响。

图3显示了短叶老鹳草素对结肠癌细胞内阿霉素和罗丹明123累积的影响。

具体实施方式

针对目前现有技术中缺乏安全可靠且无毒无害的提高化疗药物作用的制剂的现状，本发明人经过长期的研究和试验，首次揭示一种对化学治疗药物具有增敏作用和增效作用的物质——短叶老鹳草素。所述的短叶老鹳草素可有效逆转肿瘤对肿瘤药物的多药耐药性，提高化疗药物的作用，并且对哺乳动物没有毒性和副作用。在此基础上完成了本发明。

短叶老鹳草素

短叶老鹳草素是一种倍半萜内脂类化合物。在过去研究中，已经发现短叶老鹳草素具有抗炎、抗原生虫、抗肿瘤的作用。短叶老鹳草素的结构式如式(I)所示。

在本发明中，所述的“短叶老鹳草素”可以是纯净形式存在的式(I)所示的化合物，或纯度大于85％的式(I)所示的化合物；也可以是含有0.001-90wt％，更佳地含有1-85wt％的短叶老鹳草素的短叶老鹳草素的提取物。该术语还包括短叶老鹳草素的浓度大于0.001wt％的混合物。

作为本发明的优选方式，所述的短叶老鹳草素可提取自任何含有短叶老鹳草素的植物中，所述的植物包括但不限于：鹅不食草、橄榄树(特别是存在于其茎中)。鹅不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.et Ascher.)系菊科(Compositae)石胡荽属植物，生长于海拔300-1900米的阴湿处。可将短叶老鹳草素的植物提取物直接给药；或者可将短叶老鹳草素的植物提取物进行提纯和加工，制成纯净形式的短叶老鹳草素、或各种形式的短叶老鹳草素的制剂后，用于给药。

此外，所述的短叶老鹳草素也可通过化学合成、半合成、生物转化的方式获得。

在本发明中，还包括短叶老鹳草素的药学上可接受的盐或酯，只要所述的叶老鹳草素的盐或酯也具有提高肿瘤细胞对化学治疗药物敏感性的作用。所述的“药学上可接受的盐或酯”包括短叶老鹳草素与无机酸或有机酸反应生成的盐或酯。所述的无机酸或有机酸例如如下(但不限于)：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。所述的“药学上可接受的盐”还包括短叶老鹳草素与碱金属或碱土金属所形成的盐。所述的碱金属或碱土金属例如如下：钠、钾、钙或镁。其它“药学上可接受的盐”还包括：以常规的“前体药物”形式存在的盐(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

用途

本发明提供了短叶老鹳草素、其药学上可接受的盐的用途，用于制备抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂。

为了论证短叶老鹳草素的上述用途，本发明人随机选择了结肠癌细胞株(HCT-8)的耐长春新碱亚系HCT-8/VCR为多药耐药模型，测试了短叶老鹳草素对于传统抗肿瘤用化疗药物的抗肿瘤敏感性影响。结果发现，短叶老鹳草素可显著提高多药抗药性细胞株对抗肿瘤用化疗药物的敏感性，即可以逆转肿瘤细胞的多药抗药性。

进一步的试验还证明，短叶老鹳草素可显著地提高肿瘤细胞内抗肿瘤药物的累积，有效地阻止或延缓抗肿瘤药物被排出细胞。

体内试验证明，短叶老鹳草素可显著地增强抗肿瘤药物的抑制肿瘤增殖作用，显著降低肿瘤的重量。

在本发明的优选实施例中，采用了本领域人员常用的经典肿瘤模型即结肠癌细胞HCT-8和HCT-8/VCR作为细胞模型验证了短叶老鹳草素的增敏和增效作用；然而本领域人员应理解，由于肿瘤的发病机制和不同类型、不同组织的肿瘤细胞的共性，所述的短叶老鹳草素对于其它种类的肿瘤也是适用的。

由于短叶老鹳草素对于多药抗药性的逆转机制不是通过直接作用于某一抗肿瘤药物来实现的，而是作用于肿瘤细胞，通过增加抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的积聚、阻止或延缓外排来实现的。因此，本发明对于所述的抗肿瘤药物没有特别的限制，可以是本领域常规用于肿瘤化学治疗的任何抗肿瘤药物。

作为本发明的优选方式，所述的抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

更优选地，所述的抗肿瘤药物选自：长春新碱；阿霉素；顺铂；5-氟尿嘧啶；丝裂霉素；羟基喜树碱；或它们的混合物。

所述短叶老鹳草素适用于提高多种肿瘤对于抗肿瘤药物的敏感性。作为本发明的优选方式，所述的肿瘤是多药抗药性肿瘤。

作为本发明的优选方式，所述的肿瘤包括(但不限于)：鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；前列腺癌；肺癌；宫颈癌；白血病；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤；软组织肿瘤；骨肿瘤；皮肤及附件肿瘤；恶性黑色素瘤；或神经系统肿瘤。

组合物

本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的短叶老鹳草素，(b)有效量的抗肿瘤药物；其中，所述抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

更优选的，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的药物组合物传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述的载体可以是液体或固体。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂。本发明的短叶老鹳草素或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

在所述药物组合物中，所述的短叶老鹳草素与抗肿瘤药物的比例可随待治疗的肿瘤的种类、抗药性程度、或抗肿瘤药物的种类而定；所述比例对于本领域人员而言是可以根据临床状况而确定的。通常，短叶老鹳草素与抗肿瘤药物的比例(重量比)在1:(0.1-10000)范围内；优选的在1:(1-1000)范围内；更优选的在1:(1-200)范围内；最优选的在1:(1-50)范围内。

本发明的药物组合物的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的药物组合物每天以约0.001-100mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地增加或减少。

所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现了短叶老鹳草素在提高肿瘤对抗肿瘤药物敏感性方面的新用途，可有效逆转肿瘤对肿瘤药物的多药耐药性，提高化疗药物的作用，因而具有极好的药用前景。

(2)所述的短叶老鹳草素可以直接提取自植物中，在毒性低的同时，还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

短叶老鹳草素的制备

短叶老鹳草素购自湖北省中药资源与化学重点实验室；此外，也可根据Taylor，R.S.等(1998)，Anti-bacterial constituents of the Nepalesemedicinal herb，Centipeda minima.Phytochemistry.47，631-634中提供的方法制备获得。

实施例2

短叶老鹳草素对MDR细胞和药物敏感性细胞的细胞毒性作用

本实施例中，比较短叶老鹳草素对MDR细胞和药物敏感性细胞的细胞毒性作用。MDR细胞HCT-8/VCR(购自中南大学湘雅中心实验室，HTCC-90)和药物敏感性细胞HCT-8(购自中南大学湘雅中心实验室，HTCC-86)的细胞毒性作用。HCT-8/VCR和HCT-8是本发明人随机选择的两种较具代表性的肿瘤细胞模型。

将短叶老鹳草素用RPMI1640培养液稀释成浓度适当浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定短叶老鹳草素MDR细胞(HCT-8/VCR)和药物敏感性细胞(HCT-8)的细胞毒性作用。

将对数生长期细胞10⁴细胞/ml接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的短叶老鹳草素，使短叶老鹳草素的终浓度为4μM、8μM、16μM、32μM、64μM，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％ CO₂及饱和湿度的培养箱培养24小时，实验终止时每孔加入5mg/ml MTT10μl，培养4小时后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用Thermo Multiskan Mk3型酶标仪，以550nm为实验波长，630nm为参照波长测定其吸收度，计算肿瘤细胞的存活率和药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果显示：在HCT-8/VCR中IC₅₀＝24.55μM，同时在IC₉₀＝5.6μM；而在HCT-8细胞中短叶老鹳草素的IC₅₀＝5.75μM。

以上结果说明，短叶老鹳草素具有良好的杀灭肿瘤细胞的作用，不论是对多药抗药性细胞还是药物敏感细胞都可产生相似的抑制效果，而且这种抑制效果还具有剂量依赖性。

实施例3

短叶老鹳草素与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较

采用MTT法(具体实验操作参照实施例2)考察五种临床上较为常用的抗癌药物长春新碱(VCR)、顺铂(DDP)、5氟尿嘧啶(5FU)、丝裂霉素(MMC)和羟基喜树碱(HEPT)不同浓度一定作用时间下(24h)对HCT-8和HCT-8/VCR的细胞毒性，以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，计算耐药倍数(Resistance Factor，RF＝IC50(HCT-8/VCR)/IC50(HCT-8))。并且，将短叶老鹳草素(Brevil in)相同作用时间下与这五种传统的肿瘤化疗药物耐药倍数进行比较。

短叶老鹳草素与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较结果如表1所示。

表1

以上结果说明，HCT-8/VCR细胞具有非常明显的抗药性而HCT-8对药物的反应却很敏感。尤其是VCR和DDP的耐药倍数为40.7和19.7倍。与之相比较的短叶老鹳草素的耐药倍数只有4.3倍。但是，短叶老鹳草素的耐药倍数略高于5FU、MIT和HEPT。说明短叶老鹳草素对癌细胞的抑制效果在敏感型菌株和抗药型菌株都能收到比较好的效果。

实施例4

短叶老鹳草素对五种传统肿瘤化疗药物的抗癌效果的影响

将对数生长期HCT-8/VCR细胞10⁴细胞/ml接种于96孔培养板，每孔0.2ml，先分别加入终浓度为1.4μM短叶老鹳草素和常用的化疗药物，每组平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％ CO₂及饱和湿度的培养箱培养培养24小时，实验终止后加入5mg/ml MTT 10μl，再培养4小时，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用Thermo Multiskan Mk3型酶标仪，以550nm为实验波长，630nm为参照波长测定其吸收度，求出半数抑制浓度(IC₅₀)，计算逆转倍数(reversalindex，RI)。

实验结果如表2。

表2

从图11可以看出：经过无细胞毒性的短叶老鹳草素(1.4μM)与五种传统肿瘤化疗药物共同作用后，单独使用VCR的IC₅₀值从250μg下降倒12.5μg；其它四种化疗药物的IC₅₀值也有不同程度的降低。逆转倍数由20到2.2倍不等。而且这种增敏作用非常明显而且不是经过累加作用得到的。由此可以得出：短叶老鹳草素具有提高多药抗药性细胞株对抗癌药物敏感性的作用，即可以其它化疗药物的逆转多药抗药性。

实施例5

短叶老鹳草素在体外对肿瘤细胞内抗肿瘤药物累积的影响

采用HPLC法测定HCT-8/VCR细胞内长春新碱的累积量。色谱条件为色谱柱采用Eclipse C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)；流动相采用甲醇:磷酸二氢钾(0.06M)＝55:45；流速1ml/min；检测波长：297nm；进样量：20μl；柱温：20℃。

对照样品采用100μg/ml长春新碱溶液，采用对半稀释的方法分别稀释为10个浓度。其测定结果作为标准曲线的依据。将1×10⁶HCT-8/VCR细胞培养于6cm培养皿中，加入长春新碱使其终浓度为10μg/ml，继续培养24h。加入不同浓度的短叶老鹳草素并培养3小时。最后用PBS洗三次，收集细胞并超声破碎。14000rpm离心10min，取上清真空干燥24h。加入PBS 70μl，混匀后上机检测细胞内长春新碱的累积量。

结果见图2，表明随着短叶老鹳草素用量的升高，细胞内累积长春新碱的量也显著上升，也即短叶老鹳草素可促进长春新碱在细胞内的累积量。

实施例6

短叶老鹳草素在体外对肿瘤细胞阿霉素和罗丹明123浓度测定

将生长良好的耐药(HCT-8/VCR细胞(图中HCT-8/V))和敏感株细胞(HCT-8细胞)经RPMI1640洗涤2次，将细胞终浓度调至1×10⁴细胞/ml，加入不同浓度的短叶老鹳草素(0、0.35、0.7、1.4μM)培养3天后加入50μM阿霉素(本身有荧光效应)和10μM Rh123反应3小时，PBS洗三次，应用多功能酶标仪进行测定其荧光强度，阿霉素(ADR)检测波长530nm，激发波长为485nm；罗丹明123(Rh123)检测波长530nm，激发波长为550nm。维拉帕米(Verapamil，Ver)为阳性对照。

结果见图3，在不加入短叶老鹳草素时，HCT-8/VCR细胞中阿霉素和罗丹明123的积累量显著低于HCT-8细胞，而加入老鹳草素后，HCT-8/VCR细胞内阿霉素和罗丹明积累量显著升高。

此外，采用如上类似的方法，本发明人还测定了短叶老鹳草素在体外对其它多种耐药肿瘤细胞株(包括经低剂量阿霉素长期诱导产生的耐阿霉素等化疗药的耐药乳腺癌细胞系，经低剂量长春新碱长期诱导产生的耐长春新碱等化疗药的细胞系等)中阿霉素和罗丹明123积累的影响，结果也发现耐药肿瘤细胞内阿霉素和罗丹明123积累量显著升高。

实施例7

短叶老鹳草素在体内对长春新碱的肿瘤增殖作用的影响

将HCT-8/VCR细胞常规方法消化后收集到离心管中，然后用磷酸缓冲液(PBS)制成浓度为10⁷/ml的细胞悬液。按照每个注射点2×10⁶细胞，总体积为0.2ml的方法皮下注射到裸小鼠的左右前肢的腋下。等到肿瘤直径达到2.0cm左右时将肿瘤解剖下来，然后用磷酸缓冲液(PBS)小心匀浆制备成细胞悬液。再以细胞数量2×10⁶，注射体积0.2ml的方法皮下注射到每只小鼠的右侧前肢的腋下，总共40只。

待小鼠体内肿瘤的直径达到5×5mm左右时将所有小鼠随机分为5组，每组8只，包括对照组、短叶老鹳草素单独作用组、长春新碱单独作用组、低剂量短叶老鹳草素+长春新碱组和高剂量短叶老鹳草素+长春新碱组。给药方式为：每天10:00腹腔注射短叶老鹳草素，以3.5mg/kg和7mg/kg剂量注射，共计9次，连续9天，即1～9天；和/或每天14:00腹腔注射长春新碱，以2.5mg/kg剂量注射，共计9次，小鼠在接种肿瘤细胞后24天时处死，把肿瘤完整地解剖下来，然后立即称量瘤的重量。

实验结果如表3。

表3

从表3中可以看出，短叶老鹳草素能够显著增强长春新碱的抑制肿瘤增殖作用，明显增加了肿瘤对化疗药物长春新碱的敏感性。

此外，单独给予健康小鼠低剂量(每天2mg/kg)或高剂量(每天10mg/kg)的短叶老鹳草素，观察其对于小鼠是否有毒副作用。结果发现，与没有给予短叶老鹳草素的小鼠相比，低剂量或高剂量给药小鼠的活动、食量等均没有显著的变化。因此可见，短叶老鹳草素对于动物没有显著的毒性，安全可靠。

实施例7药物组合物

制备注射剂，注射剂的配方如表4和表5所示。根据常规的注射剂制备方法来制备即可。

表4

 

成分	用量(g/1000ml)	用量(g/1000ml)	用量(g/1000ml)
				短叶老鹳草素	5	2	100
长春新碱	20	100	3
				亚硫酸氢钠	0.2	0.2	0.2
羧甲基纤维素钠	5	5	5
				吐温-80	1.5	1.5	1.5
注射用水	加至1000ml	加至1000ml	加至1000ml

表5

 

成分	用量(g/1000ml)	用量(g/1000ml)	用量(g/1000ml)
				短叶老鹳草素	25	120	5
阿霉素	10	2	150
				亚硫酸氢钠	0.15	0.15	0.15
羧甲基纤维素钠	3	3	3
				吐温-80	2	2	2
注射用水	加至1000ml	加至1000ml	加至1000ml

经验证，所述包含短叶老鹳草素和抗肿瘤药物的组合物的抑癌效果明显优于单独使用短叶老鹳草素或单独使用该抗肿瘤药物时的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种短叶老鹳草素的用途，其特征在于，用于制备抗肿瘤药物的增敏剂或逆转剂。

2.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；5-氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

3.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述的肿瘤选自：鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；前列腺癌；肺癌；宫颈癌；白血病；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤；软组织肿瘤；骨肿瘤；皮肤及附件肿瘤；恶性黑色素瘤；或神经系统肿瘤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的增敏剂或逆转剂用于提高抗肿瘤药物在肿瘤细胞内的累积量。

5.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，含有：

(a)有效量的短叶老鹳草素，和

(b)有效量的抗肿瘤药物；

其中，所述抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，短叶老鹳草素与抗肿瘤药物的重量比为1∶(0.1-10000)。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中还含有：

(c)药学上可接受的载体。

8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤选自：鼻咽癌；食管癌；胃癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；前列腺癌；肺癌；宫颈癌；白血病；口腔癌；唾液腺肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤；阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌；恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤；软组织肿瘤；骨肿瘤；皮肤及附件肿瘤；恶性黑色素瘤；或神经系统肿瘤。

9.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂。

10.一种体外抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

给予肿瘤细胞有效量的有效量的短叶老鹳草素和有效量的抗肿瘤药物；

其中所述抗肿瘤药物选自：阿霉素；长春新碱；紫杉醇；顺铂；放线菌素；博来霉素；白消安；卡培他滨；卡铂；卡莫司汀；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；阿糖胞苷；柔红霉素；表阿霉素；依托泊甙；足叶乙甙；鬼臼乙叉甙；氟阿糖腺苷酸；氟尿嘧啶；吉西他滨；赫赛汀；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；依立替康；洛莫司汀；环己亚硝脲；美法仑；左旋苯丙氨酸氮芥；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；丝裂霉素；米托蒽醌；二羟基蒽酮；奥沙利铂；丙卡巴肼；甲苄肼；美罗华；类固醇；链佐星；链脲霉素；紫杉醇，泰索帝；硫鸟嘌呤；噻替哌；硫替哌；三胺硫磷；雷替曲塞；拓扑替康；曲奥舒凡；尿嘧啶；长春碱；长春花碱；长春地辛；长春瑞宾；格列卫；羟基喜树碱；或它们的混合物。

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