CN102477039B - 瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。它是取瓜馥木粉末，用80%的乙醇溶液反复提取，至提取液颜色变淡，回收乙醇，蒸干提取物；提取物用水溶解，超声助溶，用石油醚萃取脱色，直至石油醚提取液颜色清亮；再用二氯甲烷萃取，直至颜色清亮，合并二氯甲烷萃取物，回收二氯甲烷，得萃取物；萃取物上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇洗脱，分段收集洗脱液，得到化合物。本发明从贵州特色植物独山瓜馥木对新生血管具有显著的抑制活性，从中分离了多种活性化合物，经试验表明，该化合物不但能抑制新生血管形成，而且对肿瘤细胞株有抑制作用，进一步做动物体内抗癌试验，发现该化合物对多种实体瘤、肺癌有明显的抗癌活性。

Description

瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种内酰胺碱化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一。世界卫生组织调查表明癌症患者正在逐年增加，我国癌症年发病人数在130万左右。我国为肺癌的高发区域，癌症死亡率居高不下。

针对大部分癌症患者，目前尚无理想药物。现有的化疗药物中不管是合成药物还是天然药物，疗效均不理想，而且毒副作用极大。顺铂等有机金属配合物抗癌性强，但存在毒副作用大、抗癌谱狭窄、造价高等缺点；烷化剂、亚硝脲类抗癌药物对骨髓具有很强的毒性。天然抗癌药物如紫杉醇，具有高敏反应、骨髓抑制等副作用，还存在明显的神经毒性、心脏毒性；喜树碱类抗癌药物有较大的胃肠道毒性，水溶性差等问题。从总体上看，现有的抗肿瘤药物存在的主要问题是毒性大、副作用大。

新生血管抑制剂能抑制肿瘤血管的生长，切断肿瘤组织的血液供应，导致肿瘤组织不能增殖，从而发挥抗肿瘤作用。这类药物的毒性低、抗瘤谱较广，是未来抗癌药物的发展主流。本发明人立足于这一研究思路，结合贵州丰富的药用植物资源，开展药物筛选工作。发现贵州特色植物独山瓜馥木毒性低、对新生血管具有明显的抑制作用，此外对肿瘤细胞株也有抑制活性，通过活性跟踪分离，确认一种内酰胺碱化合物为活性成分。该成分具有毒性小、抗肿瘤机制独特等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种从纯天然植物中提取内酰胺碱化合物的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，以解决目前药物疗效均不理想，而且毒副作用极大的问题。

本发明的技术方案：取瓜馥木粉末，用80%的乙醇溶液反复提取，至提取液颜色变淡，回收乙醇，蒸干提取物；提取物用水溶解，超声助溶，用石油醚萃取脱色，直至石油醚提取液颜色清亮；再用二氯甲烷萃取，直至颜色清亮，合并二氯甲烷萃取物，回收二氯甲烷，得萃取物；萃取物上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇洗脱，分段收集洗脱液，得到化合物，其分子结构为：

                                                         

。

瓜馥木粉末过20目筛。

硅胶柱粒度为200-300目。

二氯甲烷-甲醇体积比为8︰2。

瓜馥木内酰胺碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明从肿瘤发生、发展与血管新生有关的机制考虑，用鸡胚绒毛尿囊膜新生血管模型，对贵州天然植物药进行了广泛筛选，经过几年艰苦研究，发现贵州特色植物独山瓜馥木对新生血管具有显著的抑制活性，从中分离了多种活性化合物，经试验表明，该化合物不但能抑制新生血管形成，而且对肿瘤细胞株有抑制作用，进一步做动物体内抗癌试验，发现该化合物对多种实体瘤、肺癌有明显的抗癌活性。

该化合物能显著抑制鸡胚新生血管形成，能显著抑制S180细胞诱导的新生血管形成，用SRB方法检测，对人肺癌细胞株A549的抑制活性强，IC₅₀为1.25×10^－5 mol/L,用MTT方法检测，人白血病细胞株K562有抑制作用，IC₅₀为1.36×10^－5 mol/L。小鼠体内抗S180试验，IC₅₀为24.5 mg/Kg，对小鼠移植性肺癌有显著作用，IC₅₀为36.2 mg/Kg，抑制小鼠艾氏腹水癌（实体型）的生长，其IC₅₀为40.8 mg/Kg，对小鼠毒性小，LD₅₀为987±26 mg/kg。

具体实施方式

实施例1：取独山瓜馥木粉末，过20目筛，得五千克，用80%的乙醇溶液反复提取，至提取液颜色变淡，旋转蒸发仪回收乙醇，蒸干提取物，得500克干提取物。提取物用水溶解，超声助溶，用石油醚萃取脱色，直至石油醚提取液颜色清亮。再用二氯甲烷萃取，直至颜色清亮，合并二氯甲烷萃取物，旋转蒸发仪回收二氯甲烷，得萃取物200克。萃取物上硅胶柱，硅胶柱粒度为200-300目，用二氯甲烷-甲醇（体积比为8︰2）洗脱，分段收集洗脱液，根据TLC检测，共得5个组分。将第三组分继续上柱分离，得到化合物20克。

实施例2：独山瓜馥木内酰胺碱胶囊的制备

1、制备处方

独山瓜馥木内酰胺碱5g，微晶纤维素（MCC）4.5g，乙基纤维素（EC）5g，羟丙甲纤维素（K4M）7g，50%乙醇溶液适量。

2、制备过程

先将独山瓜馥木内酰胺碱、辅料粉碎过100目筛。称取处方量原料及辅料，并混合均匀，加适量50%乙醇，制成软材，用挤出筛板（孔径0.8mm）挤成细条状，然后使条状物料进滚圆机使其充分滚圆，取出微丸，于60℃烘干2 h左右，使水分含量控制在3% - 4%，取24目的微丸，装量为每胶囊250 mg，用充填机进行胶囊充填。

实施例3：独山瓜馥木内酰胺碱化合物的鸡胚血管抑制试验

1、实验材料

来航鸡受精种蛋（由贵州省种畜禽良种场提供），化学试剂均为分析纯级。

2、实验方法

将受精鸡蛋放入温度为37.8 ⁰C、湿度为60 %的孵化箱中，8 天后在鸡蛋气室端钻约1.0 – 2.0 mm的小孔并穿透气室壳膜；在胚头右下方处用小砂轮磨切开窗口 (0.5cm×1.5cm)，切破壳膜，暴露出绒毛尿囊膜；在膜表面小心加入含药纸片（纸片直径为5毫米，以不加药的纸片做对照）；用灭菌透明胶带封窗后，放入孵化箱； 孵化3天后揭除透明胶带观察、照相记录纸片周围血管生长情况，用图像软件做数据处理。

    3、结 果

不含药的对照纸片周围新生血管呈放射状生长，含该化合物的纸片周围新生血管稀疏。

     实验结果表明（表1），该化合物能抑制鸡胚新生血管的生长，IC₅₀为6.24±1.28×10^-5 mol/L。

实施例4：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对人肺癌细胞株A549细胞的抑制试验

1、试验原理

 SRB是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在特对波长范围内的OD值与细胞数量呈良好的线性关系，本方法根据SRB结合物的OD值来检测样品对肿瘤细胞的作用情况。

2、试验材料与方法

A549细胞购自CCTCC，SRB购自TCI公司，1640培养液购自Hyclone公司，其它试剂均为国产分析纯。按磺酰罗丹蛋白染色法（SRB法）进行，样品用DMSO溶解，阳性对照为阿霉素。试验样本每个浓度平行3次，重复2次，结果以M±SD表示。

抑制率（%）= （对照组OD值－样品组OD值）/对照组OD值×100

3、结 果

结果表明，该化合物的IC₅₀为1.25×10^－5 mol/L，阳性对照的IC₅₀为1.02×10^－6 mol/L。由此可见，该化合物对人肺癌细胞有抑制作用。

实施例5：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对人白血病细胞株K562的抑制试验

1、试验原理

活细胞的线粒体中存在着与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的Formanzan，死细胞此酶无活性，MTT不被还原。本方法根据MTT的还原程度来检测样品对肿瘤细胞的作用情况。

2、试验材料与方法

K562细胞购自CCTCC，MTT购自Amresco公司，1640培养液购自Hyclone公司，其它试剂均为国产分析纯。按标准MTT法进行，样品用DMSO溶解，阳性对照为阿霉素。试验样本每个浓度平行3次，重复2次，结果以M±SD表示。

 3、结 果

结果表明，该化合物的IC₅₀为1.36×10^－5 mol/L，阳性对照的IC₅₀为1.21×10^－6 mol/L。由此可见，化合物G对人人白血病细胞有抑制作用。

实施例6：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对小鼠S180实体瘤的体内抗肿瘤试验

1、实验材料

选用18-22g昆明种小白鼠，雌雄均可，但同批实验治疗组与对照组性别一致，由贵阳医学院动物室提供。肉瘤180（S180）由上海药物研究所提供。

2、实验方法

无菌条件下抽取S180瘤液，以生理盐水1：3稀释，取0.2ml注入小鼠右腋皮下，24小时后称重分组。生理盐水组与环磷酰胺组分别为阴性和阳性对照组。化合物组设高、中、低三个剂量，分别为15 ，30，60 mg/kg。连续口服给药10天，每日一次，停药次日处死小鼠，称重，剥离小鼠皮下瘤块，称瘤重，计算各组小鼠瘤块重量，并计算抑瘤率。

3、结果

本实验重复三批，结果见表2，抗肿瘤阳性药环磷酰胺抑制作用较强。该化合物有明显抑制S180肿瘤生长作用，其IC₅₀为24.5 mg/Kg，且其抗肿瘤作用呈良好量效关系。

实施例7：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对小鼠Lewis肺癌移植模型的体内抗肿瘤试验

1、实验材料

C57BL/6小鼠，雄性，体重18-22克，鼠龄6-8周，购自中国医学科学院动物中心，Lewis肺癌荷瘤小鼠购自中国医学科学院药物研究所。

2、实验方法

无菌条件下制备Lewis肺癌细胞悬液（1.8×10⁶/ml），取0.2ml注入小鼠右腋皮下，24小时后称重分组。生理盐水组与环磷酰胺组分别为阴性和阳性对照组（N=10）。化合物组设高、中、低三个剂量（N=10），分别为15 ，30，60 mg/kg。连续口服给药10天，每日一次，停药次日处死小鼠，称重，剥离小鼠皮下瘤块，称瘤重，计算各组小鼠瘤块重量，并计算抑瘤率。

3、结果

抗肿瘤阳性药环磷酰胺抑制作用较强。该化合物有明显抑制肺癌肿瘤生长作用，其IC₅₀为36.2 mg/Kg，且其抗肿瘤作用呈良好量效关系。

实施例8：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对小鼠艾氏腹水癌（实体型）抗肿瘤试验

1、实验材料

选用18-22g昆明种小白鼠，雌雄均可，但同批实验治疗组与对照组性别一致，由贵阳医学院动物室提供。艾氏腹水癌（EAC）感染小鼠由贵阳医学院药理实验室提供。

2、实验方法

无菌条件下抽取EAC瘤液，以生理盐水1：3稀释，取0.2ml注入小鼠右腋皮下，24小时后称重分组。生理盐水组和环磷酰胺组分别为阴性和阳性对照级，受试化合物设低、中、高三个剂量组，分别为15 ，30，60 mg/kg，连续口服给药10天，每日一次，停药次日处死小鼠称重，剥离皮下瘤块并称重，计算各组小鼠瘤块重量，并计算抑瘤率，实验重复三批。

3、结果

本实验重复三批，结果见表3，抗肿瘤阳性药环磷酰胺抑制作用较强。该化合物能明显抑制小鼠艾氏腹水癌（实体型）的生长，其IC₅₀为40.8 mg/Kg，且其抗肿瘤作用呈良好量效关系。

实施例9：独山瓜馥木内酰胺碱化合物对小鼠的急性毒性试验

1、实验材料

选用18-22g昆明种小白鼠，雌雄各半，由贵阳医学院动物室提供。

2、实验方法

正式测定LD₅₀前，经预试验发现，当一次性口服剂量为480 mg/kg时，6只受试小鼠死亡1只。试验分组：共分5组，每组10只，剂量分别分：400、560、784、1098、1538 mg/kg，一次性口服，观察给药后动物行为变化与7天内动物死亡情况。 

3、结果

剂量（mg/kg）	给药前动物数（N）	7天后动物死亡数（N）	死亡率（%）
				400	10	0	0
560	10	1	10
				784	10	3	30
1098	10	6	60
				1538	10	8	80

表4 独山瓜馥木内酰胺碱化合物对小鼠的急性毒性试验

急性毒性试验结果见表4。给药后小鼠无明显行为异常，死亡主要发生在给药后24小时至48小时之间，死亡前动物有扭体表现，提示腹痛。解剖死亡动物发现肠道水肿充气、胃有点状出血病变，其余未见异常。所有成活小鼠均扑杀后剖检，未见异常变化。经改良寇氏法计算，LD₅₀为987±26 mg/kg，可见独山瓜馥木内酰胺碱化合物毒性较小。

Claims (5)

1.一种瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法，其特征在于：取瓜馥木粉末，用80%的乙醇溶液反复提取，至提取液颜色变淡，回收乙醇，蒸干提取物；提取物用水溶解，超声助溶，用石油醚萃取脱色，直至石油醚提取液颜色清亮；再用二氯甲烷萃取，直至颜色清亮，合并二氯甲烷萃取物，回收二氯甲烷，得萃取物；萃取物上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇洗脱，分段收集洗脱液，得到化合物，其分子结构为：

。

2.根据权利要求1所述的瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法，其特征在于：瓜馥木粉末过20目筛。

3.根据权利要求1所述的瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法，其特征在于：硅胶柱粒度为200-300目。

4.根据权利要求1所述的瓜馥木内酰胺碱化合物的制备方法，其特征在于：二氯甲烷-甲醇体积比为8︰2。

5.一种如权利要求1所述的瓜馥木内酰胺碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。