CN113278535B - 一种灵芝新菌种zl167及其新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵芝新菌种ZL167，它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.22443的灵芝；本发明还提供了所述新的灵芝提取的灵芝多糖，其具有通过激活NF‑κB途径，增加内皮细胞ICAM‑1表达；进一步地还可增加T细胞肿瘤浸润，发挥肿瘤抑制的作用。本发明的灵芝菌种、灵芝多糖在食品、保健品领域以及药品领域均具有非常优异的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于中医药领域，具体涉及一种灵芝新菌种ZL167及其用途。
背景技术
灵芝(Ganoderma sp.)隶属于担子菌纲(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)，是一种重要的药用真菌，在传统中医中被广泛应用，其药理作用多有论述。《神农本草经》中记载灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效，现代药理学与临床试验进一步证明灵芝具有抗衰老、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、保肝等作用。其中赤芝是仅有的两个被《中华人民共和国药典》收录的灵芝属之一。《中华人民共和国药典》(2015年版一部)规定的标准为：水分不得过17.0％，总灰分不得过3.2％，浸出物不得少于3.0％，多糖不得少于0.9％，三萜及甾醇不得少于0.5％。然而，而灵芝的产地、品种使得我国灵芝品质良莠不齐。
灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，具有免疫调节作用，也是评价灵芝品质好坏的重要标准之一。然而，尽管对灵芝多糖免疫相关作用机制研究较多，但目前尚未见对灵芝多糖促进T细胞肿瘤浸润的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝的新菌种。
本发明提供了一种灵芝——ZL167，它于2021年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为灵芝(Ganoderma lucidum)，保藏编号为CGMCC No.22443。
本发明提供了一种灵芝多糖，它是由上述的灵芝提取得到的灵芝多糖。
本发明还提供了上述的灵芝的灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)灵芝子实体粉碎后，加水蒸馏提取，得水提液；
(2)水提液浓缩，加无水乙醇，得沉淀；
(3)沉淀复溶于水中，采用Sevag法除蛋白；得到多糖溶液；
(4)多糖溶液加无水乙醇，得到沉淀，即为灵芝多糖。
进一步地，步骤(3)所述Sevag法是将溶液与Sevage试剂混合，振荡，离心；所述Sevage试剂是氯仿和正丁醇的混合试剂。
本发明还提供了上述灵芝或灵芝多糖在提升内皮细胞ICAM-1表达的保健品或药品中的用途。
进一步地，上述提升内皮细胞ICAM-1表达的保健品或药品是调节细胞NFκB通路的药品；优选为提升NF-κB p65蛋白、磷酸化NF-κB p65蛋白和磷酸化IκBα蛋白表达，降低IκBα蛋白表达的保健品或药品。
进一步地，上述保健品或药品是提升免疫应答的保健品或药品。
更进一步地，上述提升免疫应答的药品为提升T淋巴细胞的肿瘤浸润的药品。
更进一步地，上述提升T淋巴细胞的肿瘤浸润的药品为抗肿瘤药品，优选为抑制肿瘤生长的药品；更优选为抑制黑色素瘤生长的药品。
进一步地，上述药品是诱导组织生长及分化、诱导血管生成、诱导炎症反应的药品。
本发明还提供了一种食品、保健品或药品，它是以上述的灵芝或灵芝多糖为活性成分，加上辅料或辅助性成分制备而成的食品、保健品或药品。
本发明的新灵芝——ZL167生产周期短，产量高，且具有非常优异的品质：水分9.2％，灰分0.8％，浸出物6.02％，多糖1.22％，三萜及甾醇0.68％，优于《中华人民共和国药典》(2015版)标准：“水分不得过17.0％，总灰分不得过3.2％，浸出物不得少于3.0％，多糖不得少于0.9％，三萜及甾醇不得少于0.5％”，而且与对照品种“药灵芝1号(川审药2009005)”相比，药效成分提高10％以上。本发明灵芝菌种所提取的灵芝多糖具有提升ICAM-1表达的作用，可应用于食品、保健品领域，调节免疫，强生健体；更进一步地，通过对免疫的调节，还可提升T淋巴细胞的肿瘤浸润的作用，能够有效抑制肿瘤细胞，例如皮肤黑色素瘤细胞的增殖。说明本发明灵芝菌种及其提取的灵芝多糖在食品、保健品、药品领域均具有极高的应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织CD8+细胞浸润的影响(100×)。
图2为灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织CD3+细胞浸润的影响(100×)。
图3为灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织ICAM-1表达的影响(100×)。
图4为灵芝多糖对EA.hy926细胞生成ICAM-1的影响。
图5为灵芝多糖对EA.hy926细胞黏附能力的影响。
图6为灵芝多糖对EA.hy926细胞NFκB通路的影响。
具体实施方式
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
数据统计与分析：
数据采用x±s表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较组间差异，两组数据差异比较采用LSD法。
实施例1、本发明的灵芝菌种
本发明灵芝菌种的亲本来源于四川峨眉山一株野生灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)。将其进行组织分离、驯化栽培，筛选出的药效成分含量高的本发明的灵芝菌种ZL167，其遗传性状稳定一致，子实体产量较高，内在品质优。
主要特征特性:
1、外观
具典型的赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.]形态特征。子实体外形呈伞状，菌盖肾形，直径10-16cm，厚1-2cm，皮壳坚硬，红褐色，有光泽，具明显环状棱纹，边缘薄而平截，腹面黄白色，断面浅褐色。
菌丝浓白、粗壮，具有锁状联合，异宗结合。
灵芝孢子呈卵圆形至卵形，长9-12μm，宽6-8μm，顶端平截或呈印圆锥形，表面分布有一些微小的凹陷或洞穴。
2、生产周期：约120天。
3、产量：按常规段木栽培技术，第一潮芝产量≥25g/kg.段木。
4、内在品质：朵型大而美观，菌盖、菌柄颜色较深，气微香，味苦涩。各项检验应符合《中华人民共和国药典》(2015年版一部)标准。
实施例2、本发明灵芝多糖的制备
实施例1的灵芝子实体粉碎后，加入20倍体积蒸馏水，回流提取1h，过滤，收集滤液，滤渣重复提取1次。合并两次滤液，减压浓缩。加入3倍体积无水乙醇，4℃过夜，10000rpm离心10min收集沉淀。沉淀复溶于蒸馏水中，采用Sevag法除蛋白。多糖溶液加入3倍体积无水乙醇，4℃过夜，10000rpm离心10min收集沉淀。50℃干燥，粉碎，得灵芝多糖，4℃保存备用。采用硫酸-蒽酮法，测定制得的灵芝多糖样品多糖含量为92.3％。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、多点试验结果
以药灵芝1号(获得四川省农作物品种审定证书的审定编号为：川审药2009005的灵芝品种)为对照，对灵芝菌种ZL167进行了连续两年的品种多点试验和一年生产试验。
2015年和2016年分别在峨眉山市胜利镇、德阳市旌阳区、彭州市通济镇进行了品种比较试验，结果表明：
1、生产周期：ZL167生产周期约120天，较对照药灵芝1号相比缩短13天左右。
2、外观形态：ZL167皮壳坚硬，红褐色，有光泽，具明显环状棱纹，边缘薄而平截，腹面黄白色，断面浅褐色。
3、产量：段木栽培，ZL167两年产量均≥25g/kg.段木(一潮)，与对照品种药灵芝1号相当。
4、内在品质：ZL167两年品种比较试验内在品质均符合《中华人民共和国药典》(2015年版)，浸出物、多糖、三萜及甾醇三项关键指标较对照药灵芝1号分别提高17.95％、16.52％、15.31％和16.80％、17.13％、15.53％。
试验结果表明，ZL167遗传性状稳定一致，符合《中华人民共和国药典》(2015年版)标准，与对照药灵芝1号相比具有药效成分含量高的特点。
实验例2、灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤增殖的作用
1、实验方法：
试验第0d，取对数生长期B16-F10细胞，按1×106个/只接种于C57BL/6N小鼠右侧腋下，每只接种体积0.2ml。试验第1d，将接种后的小鼠随机分为4组，即：对照组，灵芝多糖(GLP，实施例2制备)小剂量、中剂量、大剂量组，每组10只。对照组每日腹腔注射生理盐水，灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组每日分别腹腔注射灵芝多糖25、50、100mg/kg，注射体积均为0.1ml/10g体重，连续给药14d。末次给药后，解剖肿瘤组织，称重。
2、实验结果：
见表1，给药过程中，灵芝多糖各组小鼠生活状态与对照组相比无显著差异。小鼠接种B16-F10细胞5d后，逐渐形成肉眼可见肿瘤组织，且灵芝多糖中剂量组和大剂量组肿瘤组织体积较对照组有较大程度减小。给药14d解剖肿瘤组织称重发现，灵芝多糖中剂量组和大剂量组肿瘤组织重量较对照组显著降低，具有显著性差异(p<0.05)，抑瘤率分别达到35.82％和49.31％，且在给药过程中未见动物毒性反应。上述结果表明灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤增殖有显著的抑制作用，并且安全性高。
表1灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤增殖的作用
注：与对照组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01
实验例3、灵芝多糖对B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织ICAM-1表达和T淋巴细胞浸润的影响
1、实验方法：
按照实验例2的方法完成肿瘤组织称重后，切取适量组织浸泡于4％中性多聚甲醛溶液中，固定24h。蒸馏水清洗去除多聚甲醛，并浸泡于75％乙醇中。常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，制备组织切片。石蜡切片经脱蜡、水化后，采用pH 6.0柠檬酸缓冲液在高压条件下维持5min修复抗原，并按常规方法进行免疫组化染色，采用Leica DM2000显微成像系统拍照后，以Image pro plus6.0软件对阳性表达区域进行累积光密度(IOD)分析。
2、实验结果：
分析B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织中CD3+、CD8+T淋巴细胞发现，对照组肿瘤组织内可见少量弱阳性染色区域，而灵芝多糖各剂量组肿瘤组织内阳性染色区域明显增加，且在中剂量组和大剂量组中呈现较强的聚集性，强阳性染色区域附近肿瘤细胞有明显的核固缩、胞间间隙增大等细胞坏死、凋亡表现(见图1、图2)。以上现象表明，腹腔注射灵芝多糖能够增加B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织内T淋巴细胞的浸润。
免疫组化结果(图3)显示，对照组肿瘤组织ICAM-1表达强度较低，而经灵芝多糖处理后肿瘤组织内ICAM-1表达强度和表达区域明显增加，说明灵芝多糖能够促进B16-F10荷瘤小鼠肿瘤组织内ICAM-1表达，从而进一步增加T淋巴细胞的浸润。
实验例4、灵芝多糖对EA.hy926细胞生成ICAM-1的影响
1、实验方法：
设置对照组、LPS组、灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组，取对数生长期EA.hy926细胞，按1×106个/孔，加入6孔细胞培养板，每孔2ml培养液，置于5％CO2饱和湿度细胞培养箱中培养过夜。各孔弃去原有培养液，加入2ml新鲜培养液，其中LPS组含终浓度为10μg/ml的LPS，灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组分别含终浓度为50、100、200μg/ml的灵芝多糖(实施例2制备，下同)。加药后继续培养6、24、48、72h，进行ICAM-1检测。
收集细胞，采用100μl RIPA裂解液(添加蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物)4℃裂解30min，13000rpm离心10min，取上清。采用BCA试剂盒测定蛋白含量。10％SDS-PAGE凝胶，30μg蛋白/泳道，浓缩胶恒压40V，直至样品到达分离胶上沿，分离胶恒压90V，直至蛋白质预染Marker相应分子量条带达到合适位置。取出分离胶，采用湿法转印，将蛋白在300mA恒流条件下转印90min，至0.22μm孔径硝酸纤维素膜。转印后的硝酸纤维素膜置于含3％BSA的TBST缓冲液中，室温封闭1h。按蛋白质预染Marker指示裁剪硝酸纤维素膜，分别对应置于1：1000稀释的β-actin、ICAM-1一抗缓冲液中，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次5min。分别将对应硝酸纤维素膜置于1：2000稀释的HRP标记二抗缓冲液中，室温孵育2h。TBST洗涤3次，每次5min。滴加ECL工作液，室温反应1min。采用X光片记录图像。采用ImageJ软件分析实验数据。
2、实验结果
ICAM-1是T淋巴细胞向肿瘤组织浸润的最为关键的黏附分子之一。在常规细胞培养液中，人内皮细胞株EA.hy926细胞在6、24、48、72h时，其ICAM-1表达水平极低，而在添加50、100、200μg/ml灵芝多糖后，在以上各时间点ICAM-1表达水平呈剂量依赖性增加，且具有显著性差异(p<0.05)(见图4)。以上试验结果说明，灵芝多糖能够显著增加内皮细胞生成ICAM-1。
实验例5、灵芝多糖对EA.hy926细胞黏附能力的影响
1、实验方法：
设置对照组、LPS组、灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组(同实验例4)，取对数生长期EA.hy926细胞，按1×106个/孔，加入6孔细胞培养板，每孔2ml培养液，置于5％CO2饱和湿度细胞培养箱中培养过夜。各孔弃去原有培养液，加入2ml新鲜培养液，其中LPS组含终浓度为10μg/ml的LPS，灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组分别含终浓度为50、100、200μg/ml的灵芝多糖。加药后继续培养48h。
取对数生长期的Jurkat淋巴细胞，以PBS洗去培养液，加入10μM DiO并于37℃孵育20min。以PBS充分洗去残留染料。吸去EA.hy926细胞培养液，并以PBS洗涤3次，加入含按1×106个染色Jurkat淋巴细胞的培养液1ml，孵育1h。以PBS反复充分洗去未黏附细胞，置于荧光显微镜激发光450-490nm条件下，观察、拍照。
2、实验结果：
T淋巴细胞与内皮细胞黏附是其浸润进入相关组织的关键步骤。在未受到灵芝多糖或LPS刺激时，EA.hy926细胞对染色的人白血病T淋巴细胞株Jurkat淋巴细胞黏附能力极低，荧光倒置显微镜视野下几乎未见绿色荧光细胞黏附。通过在EA.hy926细胞培养液中添加灵芝多糖或LPS处理后，EA.hy926细胞对Jurkat淋巴细胞的黏附作用显著增强，视野中绿色荧光细胞数量显著增加，且具有剂量依赖效应(p<0.05)(见图5)。以上结果说明，通过灵芝多糖的处理能够显著提升内皮细胞对于T淋巴细胞的黏附作用。
实验例6、灵芝多糖对EA.hy926细胞NFκB通路的影响
1、实验方法：
设置对照组、LPS组、灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组(同实验例4)，取对数生长期EA.hy926细胞，按1×106个/孔，加入6孔细胞培养板，每孔2ml培养液，置于5％CO2饱和湿度细胞培养箱中培养过夜。各孔弃去原有培养液，加入2ml新鲜培养液，其中LPS组含终浓度为10μg/ml的LPS，灵芝多糖小剂量、中剂量、大剂量组分别含终浓度为50、100、200μg/ml的灵芝多糖。加药后继续培养48h，进行NF-κB p65、IκBα、pNF-κB p65、pIκBα检测。
收集细胞，采用100μl RIPA裂解液(添加蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物)4℃裂解30min，13000rpm离心10min，取上清。采用BCA试剂盒测定蛋白含量。10％SDS-PAGE凝胶，30μg蛋白/泳道，浓缩胶恒压40V，直至样品到达分离胶上沿，分离胶恒压90V，直至蛋白质预染Marker相应分子量条带达到合适位置。取出分离胶，采用湿法转印，将蛋白在300mA恒流条件下转印90min，至0.22μm孔径硝酸纤维素膜。转印后的硝酸纤维素膜置于含3％BSA的TBST缓冲液中，室温封闭1h。按蛋白质预染Marker指示裁剪硝酸纤维素膜，分别对应置于1：1000稀释的β-actin、NF-κB p65、IκBα、pNF-κB p65、pIκBα一抗缓冲液中，4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次5min。分别将对应硝酸纤维素膜置于1：2000稀释的HRP标记二抗缓冲液中，室温孵育2h。TBST洗涤3次，每次5min。滴加ECL工作液，室温反应1min。采用X光片记录图像。采用ImageJ软件分析实验数据。
2、实验结果：
NFκB通路是调节ICAM-1表达的重要途径之一，其中NF-κB p65、IκBα是通路中的两个关键蛋白。采用50、100、200μg/ml灵芝多糖处理EA.hy926细胞48h后，NF-κB p65蛋白表达水平较对照组明显增加，磷酸化NF-κB p65的水平也较对照组明显增加，相应地，IκBα蛋白含量随灵芝多糖处理浓度的增加而逐渐降低，磷酸化IκBα蛋白则随浓度增加而逐渐增加，且以上变化均具有显著性差异(p<0.05)(见图6)。上述结果说明，灵芝多糖通过对NFκB通路调控增加ICAM-1的表达。
ICAM-1在促进炎症部位的黏连性，控制肿瘤恶化和转移以及调节机体免疫反应中起重要作用。它通过与其受体的特异性结合，使白细胞、炎症细胞和肿瘤细胞等与内皮细胞间的黏附作用增强，促进内皮细胞活化，使它们更容易穿透内皮。内皮细胞上的细胞间黏附分子介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合，从而参与细胞的信号转导与活化、细胞组织生长及分化、免疫应答、炎症反应、血管生成及肿瘤转移等生理病理过程。
本研究中，腹腔注射灵芝多糖后，B10-F10荷瘤小鼠肿瘤组织中ICAM-1的表达强度显著增加(p<0.05)。同时，在体外试验中，50、100、200μg/ml灵芝多糖处理后，在6-72h时间内ICAM-1表达水平呈剂量依赖性增加，且具有显著性差异(p<0.05)，表明灵芝多糖能够对内皮细胞的ICAM-1表达有显著的促进作用，从而能够实现机体的免疫调节，说明本发明的灵芝、灵芝多糖在食品、保健品领域具有极高的应用价值，可调节免疫、强生健体。进一步地，通过CAM-1表达水平提高对免疫的调节，还可增加T淋巴细胞的肿瘤浸润，证明了灵芝在肿瘤预防和治疗中的有效性，说明本发明的灵芝、灵芝多糖作为药物应用时，能够实现抗肿瘤的效果，与肿瘤免疫疗法相结合，很可能具有良好的协同作用。
综上，本发明提供了一种灵芝的新菌种以及其提取得到的灵芝多糖，该灵芝新菌种生长周期短、产量高且品质优异；提取的灵芝多糖具有通过激活NF-κB途径，增加内皮细胞ICAM-1表达从而实现对机体的免疫调节作用，还可增加T细胞肿瘤浸润，发挥肿瘤抑制的作用，说明本发明灵芝菌种不但在食品、保健品领域具有很高的应用价值，而且具有优异的药用性能，具有极佳的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省中医药科学院
<120> 一种灵芝新菌种ZL167及其新用途
<130> GYKH1201-2021P0113308CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> ITS序列
<400> 1
cctgcggaag gatcattatc gagttttgac cgggttgtag ctggccttcc gaggcatgtg 60
cacgccctgc tcatccactc tacacctgtg cacttactgt gggcttcaga ttgcgaggca 120
cgctctttac cgggcttgcg gagcatatct gtgcctgcgt ttatcacaaa ctctataaag 180
taacagaatg tgtattgcga tgtaacacat ctatatacaa ctttcagcaa cggatctctt 240
ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc 300
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccgag gagcatgcct 360
gtttgagtgt catgaaatct tcaacctaca agcttttgtg gtttgtaggc ttggacttgg 420
aggcttgtcg gccgttatcg gtcggctcct cttaaatgca ttagcttggt tccttgcgga 480
tcggctctcg gtgtgataat gtctacgccg tgaccgtgaa gcgtttggcg agcttctaac 540
cgtcttataa gacagcttta tgacctctga cctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac 600
ttaagcatat ca 612
Claims (7)
1.一种灵芝（Ganoderma lucidum），其特征在于，它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO. 22443的灵芝。
2.一种灵芝多糖的制备方法，所述灵芝多糖是由权利要求1所述的灵芝提取得到的，其特征在于，包括如下步骤：
（1）灵芝子实体粉碎后，加水蒸馏提取，得水提液；
（2）水提液浓缩，加无水乙醇，得沉淀；
（3）沉淀复溶于水中，采用Sevag法除蛋白；得到多糖溶液；
（4）多糖溶液加无水乙醇，得到沉淀，即为灵芝多糖。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述Sevag法是将溶液与Sevage试剂混合，振荡，离心；所述Sevage试剂是氯仿和正丁醇的混合试剂。
4.权利要求1所述的灵芝或其提取得到的灵芝多糖在制备提升免疫应答的保健品中的用途。
5.权利要求1所述的灵芝或其提取得到的灵芝多糖在制备抗肿瘤药品中的用途，所述肿瘤为黑色素瘤。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药品是提升T淋巴细胞的肿瘤浸润的抗肿瘤药品。
7.一种保健品或药品，其特征在于，它是以权利要求1所述的灵芝或其提取得到的灵芝多糖为活性成分，加上辅料或辅助性成分制备而成的保健品或药品。
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