CN101690463B - 一种北冬虫夏草诱变菌株及培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种北冬虫夏草诱变菌株及培育方法，通过化学诱变得到一株高产北冬虫夏草新菌株，其保藏号为CGMCC NO.2909，菌丝体干重较原出发菌提高了103％，腺苷含量提高了536％，多糖含量提高了22.2％，蛋白含量提高了55.5％，甘露醇含量提高了37.5％。本发明的北冬虫夏草新菌株经20次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并利用随机扩增多态DNA(RAPD)的研究，验证菌株在DNA水平上与原出发菌株存在差异。本发明还公开了北冬虫夏草多糖和腺苷提取的最佳工艺条件。
Description
技术领域
本发明公开一种北冬虫夏草诱变菌株，为一种新的菌株品种，本发明还提供了该菌株的培育方法，属于微生物技术领域。
背景技术
北冬虫夏草(Cordyceps militaris(L)Link)，又名蛹虫草、北虫草或武式虫草，与冬虫夏草同属子囊菌亚门核菌纲球壳目麦角菌科虫草属，主要分布在我国的山西、陕西、吉林、河北、广东等地。北冬虫夏草是真菌寄生在昆虫蛹或幼虫尸体部分而形成的复合体。中医常用的冬虫夏草是珍贵的药用真菌，但其自然资源稀少，价格昂贵，且人工培养非常困难，至今未能实现规模化生产。
目前国内外人工培养北冬虫夏草多以其中一种或两种主要成分为评价指标。如果能够获得一株北冬虫夏草菌株，经液态深层发酵培养后，其菌丝体产量、腺苷、虫草多糖、蛋白质、甘露醇等有效成分含量均较野生北冬虫夏草有明显提高，将大大提高该北冬虫夏草的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种北冬虫夏草诱变菌株，为一种新的菌株，其有效成分包括腺苷、多糖、蛋白和虫草酸的含量及菌丝体干重均较原出发菌株有明显提高。
本发明还提供了该菌株的培育方法。
本发明还公开了北冬虫夏草诱变菌株多糖和腺苷提取的最佳工艺条件。
本发明的北冬虫夏草诱变菌株为：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC NO.2909；分类：蛹虫草；分类命名：Cordyceps militaris(L.)Link；保藏日期2009年3月2日。
本发明所述的北冬虫夏草菌株培育方法，包括以下步骤：
1)将保藏号为CGMCC 5.699北冬虫夏草菌株，接种于PDA斜面，24-26℃恒温箱中培养4-8天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为2×107-4×107个/mL的孢子悬液；
2)在培养皿中加入亚硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用pH＝6.0无菌磷酸缓冲液9mL溶解亚硝基胍，亚硝基胍终浓度为1mg/mL，加入步骤1)中得到的孢子悬液1mL，开始诱变；分别诱变2-20min之后，取菌悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，至浓 度为3×104个/mL，PDA培养基平板培养3-4天后，将菌株于96孔板保存；
3)利用平板初步筛选生长迅速的菌株；
4)将筛选获得的菌株在摇瓶中复苏，传代后26℃150rpm恒温摇床中培养3～5天，得菌丝体。
5)获得的高产诱变北冬虫夏草诱变菌株经过连续传代，培养条件为26℃150rpm恒温摇床中培养84h，测定菌丝体干重、多糖、甘露醇、腺苷以及蛋白质含量，考察诱变菌株的遗传稳定性，从而最终确定目的菌株。
本发明北冬虫夏草诱变菌株的鉴定：
将所得到的北冬虫夏草诱变菌株和野生型原出发菌株的总DNA，并以10聚核苷酸随机引物对总DNA进行随机扩增多态DNA(RAPD)比较，确认DNA变异情况，验证菌株在DNA水平上与原出发菌株存在差异，是一株能够稳定遗传的北冬虫夏草诱变菌株。
用全自动凯氏定氮仪测定北冬虫夏草菌丝体中蛋白总量。利用分光光度法测定甘露醇含量。
北冬虫夏草诱变菌株的鉴定中，采用苯酚-氯仿法提取北冬虫夏草诱变菌株CGMCCNO.2909和原出发菌株CGMCC 5.699的总DNA。以总DNA为模板，分别以10聚核苷酸随机引物对其进行PCR扩增反应。反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。选取的30个随机引物中，每个引物至少重复两次PCR反应，从扩增结果中筛选出条带清晰，重复性良好，并具有差异性条带的随机引物。最后，切下北冬虫夏草诱变菌株和原出发菌株的差异性条带和空白条带，凝胶回收差异性条带后，利用与RAPD相同的扩增体系和扩增引物进行二次PCR扩增，差异性条带依然存在，说明该北冬虫夏草突变株和原出发菌株相比，在DNA水平上确实发生了改变，是一株不同于原出发菌株的北冬虫夏草诱变菌株。
本发明所述的高产优质北冬虫夏草突变株的特征为：
(1)北冬虫夏草诱变菌株菌丝体干重及腺苷、粗多糖、蛋白质和甘露醇这四种有效成分的含量均有明显提高，其中，菌体体干重达12.490g/L，较原出发菌提高了103％；腺苷含量可达0.070g/L，较原出发菌提高了536％；多糖含量可达0.780g/L，较原出发菌提高了22.2％；蛋白含量可达6.482g/L，较原出发菌提高了55.5％；甘露醇含量可达1.391g/L，较原出发菌提高了37.5％。
表1诱变菌株与原出发菌株有效成分含量
(2)北冬虫夏草诱变菌株经过20次以上的连续传代培养不退化，具有遗传稳定性。
(3)北冬虫夏草诱变菌株与原始菌株在DNA水平上存在差异。
从本发明北冬虫夏草诱变菌株菌丝体中提取多糖的方法，包括以下步骤：
液体深层发酵获得北冬虫夏草诱变菌株菌丝体，冷冻干燥至恒重，粉碎，过60目筛。称取0.1g菌丝体干粉，按液料比(20～110)∶1(mL∶g)加入去离子水，水浴中超声波提取；离心分离得上清液，即得。测定上清中总糖和还原糖的含量。采用蒽铜-硫酸法测定总糖含量；采用DNS法测定还原糖含量。总糖含量减去还原糖含量等于多糖含量。
经响应面法优化后，北冬虫夏草诱变菌株菌丝体多糖超声提取的最佳工艺条件为提取时间8.4min，提取功率466W，液料比104∶1(mL∶g)。
该方法与传统水提法相比(表2)，提取时间缩短96％，多糖得率提高5.62％。
表2超声提取法和水浸提法比较
本发明北冬虫夏草诱变菌株菌丝体中提取腺苷的方法，包括以下步骤：
液体深层发酵获得北冬虫夏草诱变菌株菌丝体，冷冻干燥至恒重，粉碎，过60目筛。称取0.15g经预处理后的菌丝体，按液料比(10～50)∶1(mL∶g)加入去离子水，在恒温水浴锅内浸提；8000rpm，离心10min，测定上清液中腺苷含量。采用HPLC法测定虫草菌丝体中腺苷含量；
经响应面法优化后，北冬虫夏草诱变菌株菌丝体腺苷水提的最佳工艺条件为提取温度44℃，提取时间2.3h，液料比38∶1。在该最佳工艺条件下北冬虫夏草诱变菌株菌丝体腺苷得率可达70mg/L。
本发明的积极效果在于：提供的北冬虫夏草诱变菌株，经系统考核传代20次以上不退化，具有遗传稳定性，其产量和有效成分含量均较原始菌株均有明显提高，其中，菌体体干重较原出发菌提高了103％，腺苷含量较原出发菌提高了536％，多糖含量较原出发菌提高了22.2％，蛋白含量较原出发菌提高了55.5％，甘露醇含量较原出发菌提高了37.5％，其中腺苷和甘露醇两种有效成分含量高于目前文献和专利报道的含量值，该北冬虫夏草诱变菌株具有较高的实际应用价值，大大提高了人工培养北冬虫夏草的经济价值，为珍稀的北冬虫夏草菌株的发展开辟了一条新的途径。另外，通过人工培养北冬虫夏草，对保护野生资源、维护生态平衡起到了一定的辅助作用。
利用响应法对北冬虫夏草诱变菌株中多糖超声提取工艺进行优化，与传统水提法相比，提取时间缩短96％，多糖得率提高5.62％。
利用响应法有效的优化了诱变菌株中多糖超声提取工艺，以提高其腺苷得率，为北冬虫夏草腺苷产业化生产奠定了一定的理论基础。
附图说明
图1、本发明菌株和野生型原出发株CGMCC 5.699的RAPD扩增结果，随机引物为OPH16，共有三条差异性条带，从左向右的上样顺序为空白、CGMCC 5.699、诱变菌株的八次重复结果、100bp Ladder Marker；
图2、本发明菌株和野生型原出发株CGMCC 5.699的RAPD扩增结果，随机引物为OPG07，共有三条差异性条带，从左向右的上样顺序为诱变菌株的八次重复结果、CGMCC 5.699、空白、100bp Ladder Marker。
图3、随机引物为OPH16扩增的差异性片段中，1000bp左右的差异性片段经过胶回收后PCR扩增的结果，从左向右的孔道依次为100bp Ladder Marker、CGMCC5.699、诱变菌株、诱变菌株、空白。
图4、随机引物为OPG07扩增的差异性片段中，500bp左右的差异性片段经过胶回收后PCR扩增的结果，从左向右的孔道依次为100bp Ladder Marker、CGMCC 5.699、诱变菌株、空白。
图5、随机引物为OPG07扩增的差异性片段中，1500bp性片段经过胶回收后PCR扩增的结果，从左向右的孔道依次为100bp Ladder Marker、CGMCC 5.699、诱变菌株、空白。
图6、响应面法优化菌丝体中多糖提取条件3D图；(a)Y＝f(X1，X2)(b) Y＝f(X1，X3)(c)Y＝f(X2，X3)的响应面及等高线图。
图7、响应面法优化菌丝体中腺苷提取条件3D图；(a)Y＝f(X1，X2)(b)Y＝f(X1，X3)(c)Y＝f(X2，X3)的响应面及等高线图。
具体实施方法
实施例1：北冬虫夏草突变株的诱变和选育方法
(1)北冬虫夏草的诱变
将保藏号为CGMCC 5.699北冬虫夏草菌株，接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养5天，向斜面试管中注入无菌生理盐水1.5mL，振荡后用无菌脱脂棉过滤，稀释成浓度为3×107个/mL的孢子悬液。在培养皿中加入亚硝基胍10mg及0.5mL丙酮后，用无菌磷酸缓冲液9mL(pH＝6.0)，待亚硝基胍充分溶解后，加入孢子悬液1mL，进行诱变。诱变10min后，取菌悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，至浓度为3×104个/mL，PDA培养基平板培养4天后，将菌株于96孔板保存。用灭菌的牙签将96孔板中菌株挑到PDA培养基的平板上，每板20个菌落，26℃恒温培养箱中培养3天；将生长较迅速的菌落，再次挑到PDA培养基中，每板10株左右，26℃恒温培养箱中培养3天；将生长较迅速的菌落挑到盛有北冬虫夏草培养基的摇瓶中复苏5天；将菌株传代培养，在盛有100mL北冬虫夏草培养基的250mL锥形瓶中，接种北冬虫夏草2mL，26℃恒温摇床中培养84h。将诱变得到的突变菌株保存于48孔板中，离心菌丝体，5000rpm，离心10min，水洗一次，菌丝体铺于平板冻干，冻干粉末称重，粉碎，过60目筛。
(2)四种有效成分的提取及含量的测定
依照本发明的优化后的北冬虫夏草菌丝体腺苷及多糖的提取工艺条件提取腺苷及虫草多糖。采用蒽铜-硫酸法测定总糖含量；用全自动凯氏定氮仪测定虫草菌丝体中蛋白总量；采用HPLC法测定虫草菌丝体中腺苷含量；利用分光光度法测定甘露醇含量。
(3)高产突变体的筛选和鉴定
从诱变的北冬虫夏草突变体中，筛选出菌丝体干重和四种有效成分含量明显提高的优质菌株(见表1)，然后进行传代培养，每隔一代测定菌株干重及四种有效成分含量，测量方法同步骤(2)。共培养14代。从中筛选八株突变体，均具有稳定遗传特征。
采用苯酚-氯仿法提取北冬虫夏草诱变菌株和野生型原出发菌株的总DNA。以总 DNA为模板，分别以10聚核苷酸随机引物对其进行PCR扩增反应，每个引物至少重复两次PCR反应，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，每个引物至少重复两次PCR反应。从扩增结果中筛选出条带清晰，重复性良好，并具有差异性条带的随机引物2个(见表2)。切下北冬虫夏草诱变菌株和原出发菌株的差异性条带和空白条带(见图1-图2)，凝胶回收差异性条带后，利用与RAPD相同的扩增体系和扩增引物进行二次PCR扩增(见图3-图5)。
表2随机引物序列及其扩增结果
经RAPD反应后，30个随机引物中有1个引物不产生任何条带，有4个引物不扩增条带不清晰或重复性较差，筛选到两个引物能够扩增出差异性条带，共得到6个差异性片段。经二次PCR鉴定，其中有3个差异性片段依然具有差异性，可认为北冬虫夏草诱变菌株和野生型原出发菌株相比较，确实发生了DNA水平上的改变，是-株不同于原出发菌株的北冬虫夏草诱变菌株。
实施例2：
北冬虫夏草诱变菌株菌丝体中多糖提取条件的优化
(1)菌丝体多糖的超声提取方法
液体深层发酵获得北冬虫夏草诱变菌株菌丝体，冷冻干燥至恒重，粉碎，过60目筛。称取0.1g菌丝体干粉，按一定水料比加入一定量去离子水，水浴中超声波提取一定时间。提取液经12000rpm，4℃，离心10min，测定上清中总糖和还原糖的含量。采用蒽铜-硫酸法测定总糖含量；采用DNS法测定还原糖含量。总糖含量减去还原糖含量得到多糖含量。
(2)菌丝体多糖提取单因子实验
在提取过程中，利用单因子试验对影响多糖提取率的水料比、超声功率、提取时间三个主要因素进行考察。
提取时间对菌丝体多糖提取率的影响。在水料比40∶1，提取功率300w水浴中分别超声提取60、120、180、240、300、360、420、480、540、600s，然后测定菌丝体多糖提取率。
超声功率对菌丝体多糖提取率的影响。菌丝体干粉按水料比40∶1加入蒸馏水，分别于功率200、240、280、320、360、400、440、480、520W下水浴中超声波提取180s。不同超声功率下测定菌丝体多糖得率。
水料比对菌丝体多糖提取率的影响。菌丝体干粉分别按水料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、110∶1加入蒸馏水，超声功率440W，水浴中提取480s，测定菌丝体多糖提取率。
(3)菌丝体多糖提取中心组合实验
根据单因素探索的实验结果，以水料比、超声功率、提取时间三个因素为自变量，菌丝体多糖提取率为响应值，采用响应面分析法在三因素三水平上对菌丝体多糖提取过程进行优化，建立了影响多糖提取率的二次多项数学模型，依据回归分析结果，北冬虫夏草菌丝体多糖超声提取的最佳工艺条件为：提取时间8.4min，提取功率466W，液料比104∶1(mL∶g)。
实施例3：
北冬虫夏草诱变菌株菌丝体中腺苷提取条件的优化
(1)将液体深层发酵获得的北冬虫夏草菌丝体真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛用于实验。准确称取0.15g经预处理后的菌丝体，加蒸馏水在恒温水浴锅内浸提一定的时间。8000rpm，离心10min，分离上清液用于腺苷含量测定。根据2005版《中国药典》中介绍的方法，利用高效液相色谱法测定腺苷的含量。流动相为pH 6.5的磷酸盐缓冲液∶甲醇(体积比)＝85∶15。HPLC的测定条件为色谱柱：C-18，流速：1mL/min，检测波长：260nm，柱温：35℃，进样量：10μL。腺苷得率(W/W)＝腺苷质量(mg)/菌丝体质量(g)。
(2)菌丝体腺苷单因素提取实验
分别以不同的提取温度、料水比、提取时间作单因素实验，考察各单因素对腺苷得率的影响。
料水比对菌丝体腺苷得率的影响。菌丝体按料水比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分别加入蒸馏水，80℃水浴浸提2h，测定腺苷得率。
提取温度对菌丝体腺苷得率的影响。菌丝体按料水比1∶40加入蒸馏水，分别于提取温度20、30、40、50、60、70℃下水提2h。不同提取温度下测菌丝体腺苷得率。
提取时间对菌丝体腺苷得率的影响。在料水比1∶40、提取温度40℃条件下，分别浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3、4h，不同提取时间下得菌丝体腺苷得率。
(3)菌丝体腺苷提取的中心组合实验
采用响应面分析方法进行优化提取条件。根据单因素实验结果，以料水比、提取温度、提取时间三个因素为自变量，菌丝体腺苷得率为响应值，采用响应面分析法在三因素三水平上对菌丝体腺苷提取过程进行优化，以达到最大限度提取菌丝体腺苷的目的。依据回归分析结果，北冬虫夏草菌丝体腺苷水提的最佳工艺条件为：提取温度44℃，提取时间2.3h，液料比38∶1(mL∶g)。
Claims (2)
1.一种北冬虫夏草诱变菌株，其保藏号为：CGMCC NO.2909。
2.一种利用权利要求1所述北冬虫夏草菌株制备菌丝体多糖的方法，包括以下步骤完成：
1)采用摇瓶复苏培养保存于PDA斜面上的权利要求1所述的北冬虫夏草，传代后150rpm恒温摇床中培养3～5天，离心得菌丝体，将菌丝体冷冻干燥至恒重，粉碎，过60目筛，得菌丝体干粉；
2)称取0.1g菌丝体干粉，按液料比104∶1(mL∶g)加入去离子水，于功率466W条件下水浴中超声提取8.4min，将提取液离心后，分离得上清液，即得菌丝体多糖提取液。
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