CN111187723A - 大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，主要包括以下步骤：菌种制备，一级液体菌种的制备，二级液体菌种的制备，生产培养基配制、接种、培养，菌丝体和胞外多糖的收集，菌丝体采用离心法或过滤法进行收集，离心所得上清液或过滤法获得的滤液，经减压浓缩后，用醇沉法分离多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉。本发明采用大盖小皮伞液体培养生产方式，具有快速、高效且简便的优点，液体培养所得的产物较为简单，更易于提取、分离及纯化，可实现大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的量产，以达到满足市场需求的目的，解决野生资源难收集、量少等问题。

Description

大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法。
背景技术
小皮伞属(Marasmius)是一类具有一定药用价格的大型真菌，其中最著名的是安络小皮伞(Marasmiellus androsaceus)，这是一种传统的药用真菌，也是安络痛的主要原料，具有通经活络，活血止痛的作用，用于坐骨神经痛，三叉神经痛，风湿性关节痛等。我国民间常用它的菌丝来治疗跌打损伤、骨折、坐骨神经痛、偏头痛、风湿关节痛等。经现代药理试验证实，安络小皮伞多糖是安络小皮伞的重要活性成分之一，具有改善免疫抗性、预防肿瘤及消除自由基等多种功能。安络小皮伞的菌丝体内含有的糖类等活性成分可以作为食品和保健品的添加成分，对提高人体的免疫力和延缓人体衰老有较好的作用。
大盖小皮伞(Marasmius maximus)与安络小皮伞均隶属于口蘑科(Tricholomataceae)，小皮伞属(Marasmius)，春季或夏秋季林中腐枝落叶层上，散生、群生或有时近丛生，较为常见。发明人所在团队以自然状态下的大盖小皮伞为材料进行菌种分离，进行其人工培养研究，并进行了抗氧化活性分析，研究结果表明，大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖均具有抗氧化活性作用，大盖小皮伞水提物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率达90%以上。利用秀丽隐杆线虫作为模式生物进行的抗氧化实验和寿命实验结果显示，大盖小皮伞菌丝体水提物及胞外多糖对秀丽隐杆线虫有一定的抗氧化作用，且随着样品浓度的提高，抗氧化能力越强；水提物对线虫的寿命延长也有一定的促进作用，样品浓度越高，线虫的存活时间越久，存活率也会提高。而成分测定结果显示，大盖小皮伞菌丝体含有丰富的活性成分，包括：黄酮、多酚、多糖等。可见，大盖小皮伞可作为抗氧化剂的生物原料，具有较大的经济价值和一定的科学意义。尽管大盖小皮伞在野生条件下较为常见，但由于其个体偏小，不易分离，而且单纯靠人工采摘是难以满足市场需求的，同时，过度的采摘也会造成野生资源的破坏。
发明内容
本发明针对背景技术中的不足，提供了一种大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，通过本发明可实现大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的量产，并将两者进行有效的提取、分离和纯化。
为实现上述目的，本发明技术解决方案如下：
大盖小皮伞(Marasmiusmaximus)菌种：该菌株分离来自大盖小皮伞野生子实体，利用组织分离法，挑取子实体少量菌丝，接种至PDA培养基上，菌种经检查确保无其他杂菌后，用于培养生产，所得的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019228，保藏日期为：2019年4月3日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。
大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种制备：将大盖小皮伞菌种接种在PDA试管培养基上，于20-25℃下暗培养10-15天后，置于4℃左右的冰箱中保存备用；
（2）一级液体菌种的制备：将生长好的斜面试管菌种接至一级液体培养基，一级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B1 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解至容器装量的20%-60%，pH 5.5-7.5，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作一级液体菌种；
（3）二级液体菌种的制备：将一级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至二级液体培养基，二级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B1 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解，pH5.5-7.5，容器装量及其他的培养条件同一级液体菌种，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，用作二级液体菌种；
（4）生产培养基接种培养：将以上二级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至生产用液体培养基，生产用液体培养基的配方根据液体培养目标产物而定，容器装量为20%-60%，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，即可用于产物收集处理；
（5）菌丝体的提取及纯化：培养至菌丝球充满全部培养基时，中止培养，采用离心法或过滤法收集菌丝体，菌丝体用水冲洗2-3次，将残余的培养基清除干净，在50-80oC下烘干菌丝，菌丝体产率12-15 g/L；
（6）胞外多糖的提取及纯化：步骤（5）中离心所得上清液或过滤法获得的滤液，经减压浓缩后，用醇沉法分离多糖，加入4倍体积的无水乙醇，使终浓度为75%或以上，4oC下静置过夜，采用离心法收集多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、乳糖、羧甲基纤维素钠或柠檬酸中的一种。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、牛肉浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨或无机氮中的一种。
优选的，所述步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨。
优选的，所述步骤（4）中的生产用液体培养基的配方同一级液体培养基配方；其中，当生产培养的主要目标产物为胞外多糖时，碳源为非淀粉类物质。
优选的，所述步骤（2）、（3）和（4）中的接种量为5%-10%。
优选的，所述步骤（2）、（3）和（4）中的培养温度为25-30℃。
优选的，所述步骤（2）、（3）和（4）中的摇床转速为120-150r/min。
相对于现有技术，本发明有益效果如下：
本发明采用大盖小皮伞液体培养生产方式，具有快速、高效且简便的优点，液体培养所得的产物较为简单，更易于提取、分离及纯化，可实现大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的量产，以达到满足市场需求的目的，解决野生资源难收集、量少等问题，以及避免因过度的人工采摘而造成野生资源的破坏的麻烦。大盖小皮伞菌丝体含有丰富的活性成分，包括黄酮、多酚、多糖等，可作为抗氧化剂的生物原料，具有较大的经济价值和一定的科学意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为本发明在采用不同碳源的情况下大盖小皮伞液体培养菌丝体产量示意图；
图2为本发明在采用不同氮源的情况下大盖小皮伞液体培养菌丝体产量示意图；
图中：CK-C：不加碳源；L：乳糖；C：柠檬酸；CMC：羧甲基纤维素钠；SS：可溶性淀粉；CS：玉米淀粉（市售）；DE:糊精；glu：葡萄糖；CK-N：不加氮源；BEP：牛肉浸粉；BE：牛肉浸膏；P：蛋白胨；YE：酵母浸膏；SP：大豆蛋白胨；NS:(NH4)2SO4。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
以500毫升的三角瓶作发酵容器为例，进行大盖小皮伞菌丝体的液体培养。
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25oC下暗培养15天，把生长好的斜面菌种接至一级液体培养基中，具体配方如下：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，维生素B1 0.02 g，以上原料用水溶解，用水定容至1L，用盐酸或氢氧化钠将pH调节至6.5，用500 mL的三角瓶分装，每瓶装量为250 mL，25oC下，振荡培养，摇床转速为120 rpm，培养8天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2-3毫米，用作一级菌种。
将以上一级菌种按接种量10%（V/V）的比例，接种至二级液体培养基（配方为：碳源2%，蛋白胨0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.002%，以上原料用水溶解，再用盐酸、氢氧化钠将pH调节至6.5），其中，碳源分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和糊精，用500毫升的三角瓶进行分装，装入液体培养基体积为250毫升，25 oC下，振荡培养，摇床转速为120 rpm，培养4天，至菌丝球充满全部培养基，采用过滤法收集菌丝球，在50oC下烘干菌丝体，对菌丝体进行称重。
由图1（不同碳源对大盖小皮伞液体培养菌丝体产量的影响）所示，在其他培养条件相同的情况下，二级液体培养基中以不添加碳源的培养基为空白对照组，不同碳源的培养基产生的大盖小皮伞菌丝体产率不同，以玉米淀粉作为碳源时，大盖小皮伞菌丝产量最高，产量为10.65 g/L；其次是葡萄糖，产量为9.51 g/L；糊精和可溶性淀粉分别为碳源时产量均为9.30 g/L；乳糖为碳源时，产量为3.44 g/L；羧甲基纤维素钠为碳源时产量与空白对照接近，分别为1.97 g/L和1.78 g/L；而柠檬酸作为碳源时，大盖小皮伞的菌丝产量低于空白组，产量仅为0.85 g/L；当二级液体培养基中不加碳源时，大盖小皮伞菌丝产量为1.78g/L。
实施例2
以500毫升的三角瓶作发酵容器为例，进行大盖小皮伞菌丝体的液体培养。
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25oC下暗培养15天，把生长好的斜面菌种接至一级液体培养基中，配方如下：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，维生素B1 0.02 g，以上原料用水溶解，用水定容至1L，用盐酸或氢氧化钠将pH调节至6.5。用500mL的三角瓶分装，每瓶装量为250 mL，25oC下，振荡培养，摇床转速为120 rpm，培养8天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2-3毫米，用作一级菌种。
将以上一级菌种按接种量10%（V/V）的比例，接种至液体培养基（配方为：玉米淀粉2%，氮源0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.002%，以上原料用水溶解，再用盐酸、氢氧化钠将pH调节至6.5。其中，氮源分别选用蛋白胨、牛肉浸膏、胰蛋白、牛肉浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨等，用500毫升的三角瓶进行分装，装入液体培养基体积为250 mL，25oC下，振荡培养，摇床转速为120 rpm，培养4天，至菌丝球充满全部培养基，采用过滤法收集菌丝球，在50 oC下烘干菌丝体，对菌丝体进行称重。
由图2（不同氮源对大盖小皮伞液体培养菌丝体产量的影响）所示，在其他培养条件相同的情况下，以二级液体培养基中以不添加氮源的培养基为空白对照组，不同氮源的培养基产生的大盖小皮伞菌丝体产率不同，当蛋白胨作为氮源时，菌丝产量最高，产量为10.5 g/L；其次是牛肉浸膏，产量为10.2 g/L；牛肉浸粉为氮源时，产量为9.81 g/L；酵母浸膏为氮源时，产量为9.71 g/L；大豆蛋白胨为氮源时，产量为8.52 g/L；当(NH4)2SO4作为氮源时，菌丝产量最少且低于空白对照（4.01 g/L），产量仅为1.79 g/L，故无机氮(NH4)2SO4不适宜作为氮源用于大盖小皮伞的菌丝体培养。
实施例3
以500毫升的三角瓶作发酵容器为例，进行大盖小皮伞菌丝体的液体培养。
根据实施例1和实施例2中碳源、氮源等单因素试验的结果，可以得知玉米淀粉、蛋白胨分别作为最佳碳源、氮源，最利于菌丝体的生产，产量最高。依据这些条件配置液体培养基：玉米淀粉15 g/L，蛋白胨5 g/L，维生素B1 0.02 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L。对温度、摇床转速和液体种的接种量进行正交试验计划，优化这三个培养条件的最佳参数。正交设计试验见表1及表2。
表1 大盖小皮伞液体培养条件正交试验各因素水平表
水平 温度℃ 转速r/min 接种量%（V/V）
1 20 120 1
2 25 150 5
3 30 180 10
表2 L9（34）正交试验设计表
实验号 温度℃ 转速r/min 接种量%（V/V）
1 1 1 1
2 1 2 2
3 1 3 3
4 2 1 2
5 2 2 3
6 2 3 1
7 3 1 3
8 3 2 1
9 3 3 2
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25 oC下暗培养15天，把生长好的斜面菌种接至一级液体培养基中，配方如下：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，维生素B1 0.02 g，以上原料用水溶解，用水定容至1L，用盐酸或氢氧化钠将pH调节至7.0。用500mL的三角瓶分装，每瓶装量为250 mL，25 oC下，振荡培养，摇床转速为120 rpm，培养8天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2-3毫米，用作一级菌种。
将以上一级菌种按正交设计试验的表2中各试验号的接种量进行接种，接种至生产用液体培养基，生产用液体培养基配方为：玉米淀粉1.5%，氮源0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.002%，以上原料用水溶解，再用盐酸、氢氧化钠将pH调节至7.0。用500毫升的三角瓶进行分装，装入液体培养基体积为250 mL，按照正交设计试验表2中各试验号的条件进行培养，培养4天，采用过滤法收集菌丝球，在50 oC下烘干菌丝体，对菌丝体进行称重。采用直观分析法进行数据分析，优化得各因素的最佳参数。
通过正交设计试验优化得，温度、转速、接种量三个因素的最佳参数分别为：30℃，120 r/min，接种量为10%（V/V）。从极差R的大小来看，对大盖小皮伞菌丝体产量的影响大小顺序是温度＞接种量＞转速（表3）。
表3 L9（34）正交设计试验结果及分析
实验号 温度（℃） 转速（r/min） 接种量%（V/V） 菌丝体干重（g/L）
1 1 1 1 5.01
2 1 2 2 8.26
3 1 3 3 7.62
4 2 1 2 4.86
5 2 2 3 6.60
6 2 3 1 5.90
7 3 1 3 8.57
8 3 2 1 7.59
9 3 3 2 8.18
K1 20.89 17.72 18.5
K2 17.36 22.45 21.3
K3 24.34 21.7 22.79
k1 6.96 6.15 6.17
k2 5.79 7.48 7.1
k3 8.11 7.23 7.6
R 2.32 1.33 1.43
最优水平 3 1 3
实施例4
以500毫升三角瓶和5升的小型发酵罐作发酵容器为例，进行大盖小皮伞菌丝体的液体培养。
斜面菌种、一级液体菌种和二级液体菌种的培养：采用实例1相同的方法步骤和相同的培养基配方和培养条件。
将二级液体菌种按10%（V/V）的比例，接种至生产液体培养基（可溶性淀粉1.5%，酵母浸膏0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.002%，pH 7.0），发酵罐装入液体培养基体积为2.5 L。25 oC下，搅拌速度为150 rpm，通气量为10 L/min，培养72小时，至菌丝球充满全部培养基，采用离心法收集菌丝球。在50oC下烘干菌丝体，菌丝体产率13 g/L。至此，大盖小皮伞的菌丝体培养和收集工作全部完成，可用作产品加工。
实施例5
以500毫升三角瓶作发酵容器为例，同时进行大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的液体培养。
将斜面菌种接种在PDA培养基上，25oC下暗培养15天，把生长好的斜面菌种接至一级液体培养基中，配方如下：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，维生素B1 0.02 g，以上原料用水溶解，用水定容至1L，用盐酸或氢氧化钠将pH调节至6.0。用500mL的三角瓶分装，每瓶装量为250 mL，25oC下，振荡培养，摇床转速为150 rpm，培养7天，菌丝球充满液体培养基，用作一级菌种。
将以上一级菌种按接种量8%（V/V）的比例，接种至液体培养基（配方为：葡萄糖2%，氮源0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.002%，以上原料用水溶解，再用盐酸、氢氧化钠将pH调节至6.5。其中，氮源分别选用蛋白胨、牛肉浸膏、胰蛋白、牛肉浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨等，用500毫升的三角瓶进行分装，装入液体培养基体积为250 mL，25oC下，振荡培养，摇床转速为150 rpm，培养4天，至菌丝球充满全部培养基，采用离心法收集菌丝球和上清液，在50 oC下烘干菌丝体，对菌丝体进行称重，菌丝体产量为12 g/L。上清液中加入4倍体积的无水乙醇，使乙醇的终浓度为75%或以上，4oC下静置过夜。采用离心法收集多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉，胞外多糖的产率为0.89 g/L。
产品分析：
本发明的产品大盖小皮伞菌丝体含有营养成分及多种有效成分，可作为食品应用。以下是对其进行成分分析的结果：
分析检测结果一
分析项目 含量（％）
粗蛋白 26.1
粗脂肪 14.19
总灰分 8.74
分析检测结果二
分析项目 含量（mg/g）
黄酮 2.5
多酚 1.5
多糖 7.92
经成分测定结果可知，大盖小皮伞菌丝体含有丰富的活性成分，包括：黄酮、多酚、多糖等。可见，大盖小皮伞可作为抗氧化剂的生物原料，具有较大的经济价值和一定的科学意义。

Claims (9)

1.大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，包括以下步骤：
（1）菌种制备：将大盖小皮伞菌种接种在PDA试管培养基上，于20-25℃下暗培养10-15天后，置于4℃左右的冰箱中保存备用；
（2）一级液体菌种的制备：将生长好的斜面试管菌种接至一级液体培养基，一级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B1 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解至容器装量的20%-60%，pH 5.5-7.5，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满液体培养基，即可用作一级液体菌种；
（3）二级液体菌种的制备：将一级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至二级液体培养基，二级液体培养基配方中各组分的重量百分比为：碳源1%-3%、氮源0.2%-1%、磷酸二氢钾0.05%-0.1%、硫酸镁0.05%和维生素B1 0.002%-0.005%，各组分用于水溶解，pH5.5-7.5，容器装量及其他的培养条件同一级液体菌种，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，用作二级液体菌种；
（4）生产培养基接种培养：将以上二级液体菌种按接种量5%-15%（V/V）的比例，接种至生产用液体培养基，生产用液体培养基的配方根据液体培养目标产物而定，容器装量为20%-60%，于20-32℃下，振荡培养，摇床转速为120-200 r/min，培养4-10天，至菌丝球充满全部培养基，即可用于产物收集处理；
（5）菌丝体的提取及纯化：培养至菌丝球充满全部培养基时，中止培养，采用离心法或过滤法收集菌丝体，菌丝体用水冲洗2-3次，将残余的培养基清除干净，在50-80oC下烘干菌丝，菌丝体产率12-15 g/L；
（6）胞外多糖的提取及纯化：步骤（5）中离心所得上清液或过滤法获得的滤液，经减压浓缩后，用醇沉法分离多糖，加入4倍体积的无水乙醇，使终浓度为75%或以上，4oC下静置过夜，采用离心法收集多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉。
2.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、乳糖、羧甲基纤维素钠或柠檬酸中的一种。
3.如权利要求2所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的碳源为玉米淀粉。
4.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、牛肉浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨或无机氮中的一种。
5.如权利要求4所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的氮源为蛋白胨。
6.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的生产用液体培养基的配方同一级液体培养基配方；其中，当生产培养的主要目标产物为胞外多糖时，碳源为非淀粉类物质。
7.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）和（4）中的接种量为5%-10%。
8.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）和（4）中的培养温度为25-30℃。
9.如权利要求1所述的大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）和（4）中的摇床转速为120-150r/min。
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