BRPI0611493A2 - lactobacilos probióticos felinos - Google Patents

Abstract

De acordo com a presente invenção, é apresentada uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico, do gênero Lactobaclili, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando uma atividade probiática em animais. São apresentados, também, métodos de uso e composições compreendendo os Lactobací lii da presente invenção.

Description

"LACTOBACILOS PROBIÓTICOS FELINOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo demicroorganismos probióticos, mais especificamente a bactériasformadoras de ácido láctico probióticas felinas, bem comométodos para o uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os mecanismos de defesa para proteção do tratogastrointestinal (GI) de mamíferos contra a colonização porbactérias são altamente complexos. 0 trato GI da maioria dosmamíferos é colonizado por microflora nativa e pormicroorganismos patogênicos invasivos. Em um estado saudável,essas microfloras concorrentes encontram-se em um estado deequilíbrio. A modificação do equilíbrio da microfloraintestinal pode causar ou evitar diversos transtornosgastrointestinais, tanto em seres humanos como em outrasespécies de mamíferos, como animais de estimação, inclusivegatos, cães e coelhos. 0 bem-estar de animais de estimação estáestreitamente relacionado à alimentação e à saúdegastrointestinal, e a manutenção do equilíbrio da microfloraintestinal nesses animais pode resultar em animais de estimaçãomais saudáveis.

0 número e a composição da microflora intestinaltendem a ser estáveis, embora idade e dieta possam modificá-los.

A acidez gástrica, a bílis, o peristaltismo intestinal e aimunidade local são fatores considerados importantes naregulação da flora bacteriana presente no intestino delgado deseres humanos e diversos outros mamíferos. Freqüentemente, ostranstornos gastrointestinais em animais de estimação,inclusive aqueles encontrados em felinos, estão ligados àproliferação bacteriana e à produção de enterotoxinas porbactérias patogênicas. Esses fatores perturbam o equilíbrio damicroflora intestinal e podem promover inflamação e respostasimunológicas aberrantes.

Ao longo dos últimos anos, pesquisas começaram arevelar algumas valiosas cepas de bactérias, e seu uso potencialcomo agentes probióticos. Os probióticos são consideradospreparações de bactérias, sejam estas viáveis ou mortas, tendoconstituintes como proteínas ou carboidratos, ou fraçõespurificadas de fermentos bacterianos, que promovem a saúde dosmamíferos ao preservar a microflora natural no trato GI, e aoreforçar os controles normais contra respostas imunológicasaberrantes.

Acredita-se que as bactérias probióticas sejam maiseficazes quando derivadas da espécie que se pretende tratar, oude espécies com parentesco próximo a esta. Portanto, existe umanecessidade por cepas probióticas derivadas de animais deestimação, para serem utilizadas para animais de estimação, quesejam diferentes daquelas derivadas de seres humanos.

O documento WO 01/90311 apresenta microorganismosprobióticos isolados a partir de amostras fecais obtidas apartir de gatos, as quais têm atividade probiótica. No entanto,essas bactérias foram obtidas a partir de amostras fecais, epodem não ser parte da microflora intestinal natural presentena porção superior do trato gastrointestinal.Conseqüentemente, existe uma necessidade pelaobtenção de cepas de bactérias, mediante isolamento a partir damicroflora intestinal natural presente na porção superior dotrato gastrointestinal, que sejam particularmente adaptadaspara gatos, e que tenham sido selecionadas por suas propriedadesprobióticas e capacidade para sobreviver o processamento,incorporando essas cepas a composições que são adequadas a seu uso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, são apresentadascepas de bactérias formadoras de ácido láctico do gêneroLactobacilli, obtenível mediante isolamento a partir de tratogastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando umaatividade probiótica em animais. As cepas de bactériasformadoras de ácido láctico são selecionadas, de preferência,dentre as espécies Lactobacillus salivarius, Lactobacillusanimalis, Laetobaeillus reuteri, Laetobaeillus aeidophilus,Lactobacillus johnsonni Laetobaeillus brevis, Laetobaeillusbulgarieus, Laetobaeillus casei, Laetobaeillus eellobiosus,Laetobaeillus eurvatus, Laetobaeillus d,elbruekii,Laetobaeillus fermentum, Laetobaeillus helvetieus,Laetobaeillus laetis ou Laetobaeillus plantarum.

Em uma modalidade preferencial, a cepa de bactériasformadoras de ácido láctico é selecionada do grupo consistindoem Lactobaeilli com uma seqüência de polinucleotídeo de 16s a23s que tem mais de 94% de homologia com a SEQ. ID N0 1, maisde 93% de homologia com a SEQ. ID N0 2 ou mais de 98% de homologiacom a SEQ. ID n° 3.Em uma outra modalidade preferencial, a cepa debactérias formadoras de ácido láctico é selecionada do grupoconsistindo em Lactobacillus salivarius ss salicinius NCIMB41287 (AHF 122A), Lactobacillus animalis NCIMB 41288 (AHF223C), Lactobacillus reuteri NCIMB 41289 (AHF 5119), ou umamutação das mesmas.

Além disso, a presente invenção refere-se ao uso dasbactérias formadoras de ácido láctico, obteníveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecadoe lavado, para a manutenção e melhoria da saúde do animal deestimação, bem como composições compreendendo as ditas bactériasformadoras de ácido .,láct ico.

Estes e outros aspectos, bem como características evantagens da presente invenção, ficarão aparentes aos elementosversados na técnica a partir da leitura da presente descrição

SEQÜÊNCIAS

SEQ. ID N0 1 - seqüência de nucleotídeo do espaçadorintergênico 16s-23s de Lactobacillus salivarius subsp.Salicinius, NCIMB 41287

SEQ. ID N0 2 - seqüência de nucleotídeo do espaçadorintergênico 16s-23s de Laetobaeillus animalis, NCIMB 41288

SEQ. ID N0 3 - seqüência de nucleotídeo do espaçadorintergênico 16s-23s de Laetobaeillus reuteri, NCIMB 41289

SEQ. ID N0 4 - seqüência iniciadora 16s-23s de PCR dolado esquerdo para análise de seqüência.

SEQ. ID N0 5 - seqüência iniciadora 16s-23s de PCR dolado direito para análise de seqüência.

NÚMEROS DE DEPÓSITO DAS BACTÉRIASA Tabela abaixo indica as espécies de Lactobacilluse seu número da cepa, para cepas que são exemplos da presenteinvenção. As cepas bacterianas estão depositadas junto ao"National Collections of Industrial Food and Marine Bactéria"(NCIMB), Aberdeen, Reino Unido.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Todos os pesos, medidas e concentrações na presenteinvenção são medidos a 25 0C na composição em sua totalidade,exceto onde indicado em contrário.

Exceto onde indicado em contrário, todas asporcentagens das composições aqui mencionadas são porcentagensem peso, e todas as razões são razões em peso.

Exceto onde indicado em contrário, todos os pesosmoleculares são pesos moleculares médios ponderais.

Exceto onde indicado em contrário, o conteúdo de todasas fontes de literatura mencionadas neste texto estão aquiincorporadas em sua totalidade, por referência.

Exceto onde são apresentados exemplos específicos devalores reais medidos, os valores numéricos aqui mencionadosdevem ser considerados como sendo qualificados pela expressãocerca cie.No âmbito da descrição apresentada a seguir, aabreviação UFC ("unidade formadora de colônia") indica o númerode células bacterianas revelado por contagens microbiológicasem placas de ágar, como é de entendimento comum na técnica.

Para uso na presente invenção, o termo "mutantes dosmesmos" inclui cepas bacterianas derivadas compreendendomutações de DNA em outras seqüências de DNA do genoma bacteriano,excluindo-se a seqüência intergênica 16s-23s.

Para uso na presente invenção, o termo "mutações deDNA" inclui mutações naturais ou induzidas compreendendo aomenos alterações de base única, inclusive deleções, inserções,transversões e outras modificações de DNA conhecidas pelosversados na técnica, inclusive modificação genéticaintroduzida em um nucléotídeo ou seqüência de aminoácidosoriginal (pai), mantendo-se ao menos 50% de homologia com aseqüência-pai.

De preferência, a seqüência compreendendo amutação ou mutações de DNA tem ao menos 60%, com maispreferência ao menos 75% e, com mais preferência ainda, 85% dehomologia com a seqüência-pai. Para uso na presente invenção,a seqüência de "homologia" pode ser determinada mediante o usode técnicas-padrão conhecidas pelos versados na técnica. Porexemplo, a homologia pode ser determinada mediante o uso doalgoritmo de homologia "BLAST" disponível publicamente onlineem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

Para uso na presente invenção, o termo "modificaçãogenética" inclui a introdução de seqüências de DNA exógenas e/ouendógenas no genoma de um organismo, seja por meio de inserçãono genoma do dito organismo, seja por meio de vetores, inclusiveDNA de plasmídios ou bacteriófagos, conforme é de conhecimentodo versado na técnica, sendo que a dita seqüência de DNA tem umcomprimento de ao menos duas bases de ácido desoxirribonucléico.

Para uso na presente invenção, o termo "animal deestimação" significa um animal doméstico. De preferência,"animal de estimação" significa animais domésticos como felinos(gatos), caninos (cães), coelhos, furões, cavalos, vacas ousimilares. Commais preferência, "animal de estimação" significaum gato doméstico.

CEPAS DE LACTOBACILLI FORMADORAS DE ÁCIDO LÁCTICO

O primeiro aspecto da presente invenção compreendeuma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gêneroLactobacilli, obtenível mediante isolamento a partir de tratogastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando umaatividade probiótica em animais. Os probióticos consistem emmicroorganismos viáveis ou mortos, composições processadas demicroorganismos, seus constituintes como proteínas oucarboidratos, ou frações purificadas de fermentos bacterianos,que afetam de modo benéfico um hospedeiro. 0 uso geral debactérias probióticas se dá sob a forma de células viáveis. Noentanto, isso pode ser estendido a células não-viáveis, comoculturas mortas ou composições contendo fatores benéficosexpressos pelas bactérias probióticas. Isso pode incluirmicroorganismos mortos por meios térmicos, por exposição a umpH alterado, ou submetidos a pressão. Para o propósito dapresente invenção, o termo "probióticos" destina-se a incluir,ainda, os metabólitos gerados pelos microorganismos da presenteinvenção durante a fermentação, caso estes não sejamseparadamente indicados. Esses metabólitos podem ser liberadono meio de fermentação, ou podem ser armazenados no interior domicroorganismo. Para uso na presente invenção, o termo"probiótico" inclui, também, bactérias, homogenatosbacterianos, proteínas bacterianas, extratos bacterianos,sobrenadantes de fermento bacteriano e misturas desses itens,os quais exercem funções benéficas ao animal hospedeiro, quandoadministrados em uma dose terapêutica.

Descobriu-se que as bactérias formadoras de ácidoláctico do gênero Lactobacilli, obteníveis mediante isolamentodireto a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavado demamíferos, são aderentes ao trato GI em seguida à alimentaçãocom células bacterianas viáveis, e apresentam, também, uma açãoimunomodulatória significativa quando fornecidas aos animaissob suas formas viáveis, não-viáveis ou fracionadas. Sem se aterà teoria, acredita-se que os Lactobacilli obteníveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal ressecado e lavadomantenham estreita associação com os tecidos mucososintestinais. Sem se ater à teoria, acredita-se que isso resultena geração, pelos Lactobaeilli probióticos da presenteinvenção, de respostas alternativas no hospedeiro, as quaisresultam em sua ação probiótica. Descobriu-se que as bactériasprobióticas obteníveis mediante isolamento a partir de tratogastrointestinal ressecado e lavado podem modular o sistemaimune do hospedeiro por meio de interação direta com o epitéliomucoso e com as células imunes do hospedeiro. Essaimunomodulação, em conjunto com o mecanismo tradicional de açãoassociado às bactérias probióticas, isto é, a prevenção daaderência de patógenos aos intestinos, mediante oclusão ecompetição por nutrientes, faz dos Lactobacilli da presenteinvenção organismos probiõticos altamente eficazes.

Os Lactobacilli da presente invenção, obteníveismediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felinoressecado e lavado, apresentam atividade microbicida in vitrocontra diversas cepas/espécies bacterianas patogênicas. Sem seater à teoria, acredita-se que essa atividade microbicida invitro indique o potencial de atividade probiótica in vivo emanimais, de preferência animais de estimação, como gatos.

As bactérias formadoras de ácido láctico da presente invençãoapresentam, de preferência, atividade microbicida in vitrocontra Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes,Listeria innoeua ou Eseherieia eoli, com mais preferência umacombinação dessas cepas e, com mais preferência ainda, todasessas cepas.

Sem se ater à teoria, acredita-se que a atividademicrobicida das bactérias formadoras de ácido láctico dapresente invenção pode ser o resultado de várias açõesdiferentes realizadas pelas ditas bactérias. Foi sugeridoanteriormente, na técnica, que diversas cepas de bactériasisoladas a partir de amostras fecais exercem seu efeitoprobiótico no trato gastrointestinal, após seu consumo oral aoimpedir, mediante oclusão, a fixação de organismos patogênicosà mucosa intestinal. Isto exige o consumo oral de célulasbacterianas "vivas" ou viáveis, para que uma colônia de bactériasse estabeleça nos intestinos. No entanto, acredita-se que theos Laetobacilli da presente invenção, obteníveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal canino ressecadoe lavado, embora exerçam algum efeito probiótico medianteoclusão se fornecidos sob uma forma viável, possam oferecer umefeito probiótico substancial em suas formas tanto viáveis comonão-viáveis devido à produção, durante a fermentação in vitro,de uma ou mais substâncias que ou matam os microorganismospatogênicos ou inibem sua proliferação, e/ou que alteram aimunocompetência do animal hospedeiro. Essa forma de atividadeprobiótica é desejável, já que as bactérias da presente invençãopodem ser fornecidas sob a forma de culturas viáveis ounão-viáveis, ou como produtos de fermentação purificados e,ainda assim, proporcionar um efeito terapêutico benéfico aoanimal hospedeiro.

De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção são capazes de manter suaviabilidade após trânsito pelo trato GI. Isso é desejável, paraque as culturas de bactérias vivas possam ser administradas porvia oral, e para que ocorra a colonização dos após o trânsitoatravés do esôfago e do estômago. A colonização dos intestinospelas bactérias formadoras de ácido láctico da presenteinvenção é desejável para proporcionar ao hospedeirobenefícios probióticos de longo prazo. A dosagem oral decélulas não-viáveis ou isolados purificados das mesmas induzbenefícios temporários mas, como as bactérias não são viáveis,não são capazes de se proliferar e proporcionar, de maneiracontínua, um efeito probiótico in si tu. Como resultado, istopode exigir que o hospedeiro receba doses regularmente, de modoa manter os benefícios de saúde. Em contraste, as célulasviáveis capazes de sobreviver ao trânsito gástrico em sua formaviável e, subseqüentemente, colonizar os intestinos medianteadesão à mucosa intestinal e proliferação sobre a mesma, sãocapazes de proporcionar de maneira contínua os efeitosprobióticos in si tu.

Portanto, é preferencial que as bactérias formadorasde ácido láctico da presente invenção mantenham sua viabilidadeapós a suspensão em um meio com pH 2, 5 durante 1 hora. Para usona presente invenção, o termo "manter a viabilidade" significaque ao menos 25% das bactérias inicialmente em suspensão no meiode teste são viáveis, usando-se o método de contagem em placasconhecido pelos versados na técnica. De preferência, o termo"manter a viabilidade" significa que ao menos 50% das bactériasinicialmente em suspensão são viáveis. É desejável que asbactérias formadoras de ácido láctico da presente invençãomantenham sua viabilidade após a exposição a um baixo pH, jáque isso imita a exposição aos sucos gástricos no estômago eno intestino superior in vivo, após a consumo oral por animais.

Além disso, é preferencial que as bactérias formadorasde ácido láctico da presente invenção apresentem uma proliferaçãode ao menos 33% quando na presença de ao menos 0,5% de saisbiliares de gato. A proliferação, para uso na presente invenção,é descrita com mais detalhes no Exemplo 3. Com mais preferência,as bactérias da presente invenção apresentam uma proliferação deao menos 33% quando na presença de ao menos 1% de sais biliaresde felino. Com mais preferência ainda, as bactérias da presenteinvenção apresentam uma proliferação de 100% na presença de 0,5%de sais biliares de gato. Sem se ater à teoria, acredita-se queas bactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção quesejam capazes de manter a viabilidade na presença de ao menos 0, 5%de sais biliares de gato, sejam capazes de sobreviver às condiçõespresentes nos intestinos. Acredita-se que isso seja um resultadoda adição de bílis de gato ao meio de cultura, reproduzindo ascondições do intestino.

Além disso, é preferencial que as bactérias formadorasde ácido láctico da presente invenção apresentem adesãosignificativa a células epiteliais de intestino in vitro. Parauso na presente invenção, o termo "adesão significativa"significa que ao menos 1% do número total de bactérias formadorasde ácido láctico co-incubadas com as células epiteliais in vitroaderem às ditas células. Com mais preferência, ao menos 5% dascélulas bacterianas co-incubadas aderem às células in vitro. Semse ater à teoria, acredita-se que a aderência a células epiteliaisde intestino in vitro seja uma indicação da capacidade dasbactérias formadoras de ácido láctico para colonizar o trato GIde um animal in vivo.

De preferência, a cepa de bactérias formadoras deácido láctico de acordo com a presente invenção é de uma espécieselecionada do grupo consistindo em Lactobacillus salivarius,Lactobacillus animalis, Lactobacillus reuteri, Laetobaeillusaeidophilus, Laetobaeillus johnsonni Laetobaeillus brevis,Laetobaeillus bulgaricus, Laetobaeillus casei, Laetobaeilluseellobiosus, Laetobaeillus curva tus, Laetobaeillus delbruekii,Laetobaeillus fermentum, Laetobaeillus helveticus,Laetobaeillus lactis ou Laetobaeillus plantarum. Depreferência, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico éselecionada do grupo consistindo em Lactobacillus salivarius,Lactobacillus animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillusaeidophilus ou Laetobaeillus johnsonni.

A seqüência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s éconhecida pelos versados na técnica como a seqüência de DNA, nogenoma bacteriano, que pode ser usada para identificardiferentes espécies e cepas de bactérias. Essa seqüência depolinucleotídeo intergênico pode ser determinada pelo métododetalhado abaixo, no exemplo 4.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção,a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico é selecionada dogrupo consistindo em Lactobaeilli com uma seqüência depolinucleotídeo de 16s a 23s que tem mais de 94% de homologia coma SEQ. ID N0 I7 mais de 93% de homologia com a SEQ. ID N0 2 oumais de 98% de homologia com a SEQ. ID n° 3 . Com mais preferência,a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico é selecionada dogrupo consistindo em Lactobacilli com uma seqüência depolinucleotídeo 16s-23s tendo mais de 98% de homologia com SEQ.ID N0 1, SEQ. ID N0 2 ou SEQ. ID N0 3. Com mais preferência ainda,a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com apresente invenção é selecionada do grupo consistindo emLactobaeilli com uma seqüência de polinucleotídeo 16s-23sselecionada de SEQ. ID N0 1, SEQ. ID N0 2 ou SEQ. ID N0 3. Commais preferência ainda, a cepa de bactérias formadoras de ácidoláctico de acordo com a presente invenção é selecionada do grupoconsistindo em Laetobaeillus salivarius ss salieinius NCIMB41287 (AHF 122A) , Laetobaeillus animalis NCIMB 41288 (AHF 223C) ,Lactobacillus reuteri NCIMB 41289 (AHF 5119) , ou uma mutação dasmesmas.

A cepa de bactérias formadoras de ácido láctico dogênero Lactobacilli, obtenível mediante isolamento a partir detrato gastrointestinal canino ressecado e lavado, pode ser usadopara proporcionar benefícios probióticos em seguida ao consumovia oral em animais, de preferência animais de estimação ou sereshumanos. Esses benefícios probióticos geralmente mantêm oumelhoram a saúde geral do animal. Os elementos não-limitadoresde saúde e fisiologia animal que são beneficiados, sejaterapeuticamente pelo alívio de sintomas, ou profilaticamentepela prevenção de doenças, incluem transtornos inflamatórios,imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome dointestino irritável, câncer (particularmente aqueles dossistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica, diarréiaassociada ao uso de antibióticos, apendicite, transtornosautoimunes, esclerose múltipla, mal de Alzheimer, amiloidose,artrite reumatóide, artrite, mobilidade das articulações,diabetes mellitus, resistência â insulina, infecçõesbacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doençaperiodontal, doença urogenital, trauma associado a cirurgia,doença metastática induzida por cirurgia, sepse, perda de peso,ganho de peso, acúmulo excessivo de tecido adiposo, anorexia,controle de febre, caquexia, cura de ferimentos, úlceras,infecção da barreira intestinal, alergia, asma, transtornosrespiratórios, transtornos circulatórios, doença cardíacacoronariana, anemia, transtornos do sistema de coagulaçãosangüínea, doença renal, transtornos do sistema nervosocentral, doença hepática, isquemia, transtornos nutricionais,osteoporose, transtornos endócrinos e transtornos da epiderme.São preferenciais o tratamento do trato gastrointestinal,inclusive tratamento ou prevenção de diarréia, a regulação dosistema imune, de preferência tratamento ou prevenção de doençaautoimune e inflamação, a manutenção ou melhoria da saúde da pelee/ou da pelagem, de preferência tratamento ou prevenção dedoença atópica da pele, a melhoria ou redução dos efeitos doenvelhecimento, inclusive consciência mental e níveis deatividade, a prevenção de transtornos associados ao eixohipotalâmico-hipofisário-adrenal, e a melhoria da saúde dasarticulações, de modo a otimizar a mobilidade.

0 tratamento dos transtornos apresentados acima podeser medido mediante o uso de técnicas conhecidas pelos versadosna técnica. Por exemplo, transtornos inflamatórios, inclusivedoença autoimune e inflamação, podem ser detectados emonitorados utilizando-se testes de função imune in vivo, comoblastogênese de linfócitos, atividade de células "NaturalKiller", resposta de anticorpos a vacinas, hipersensibilidadede tipo retardado e combinações desses itens. Esses métodos sãobrevemente descritos na presente invenção, mas bem conhecidospelos versados na técnica.

1. Blastogênese de linfócitos: Este ensaio mede a respostaproliferativa in vitro de linfócitos isolados a partir desangue integral fresco obtido de animais de teste e decontrole para diversos mitogênios, e é uma medida da funçãogeral das células TeB. Em resumo, as célulasmononucleares do sangue periférico (PBMC, ou "peripheralblood mononucleocytes") são isolados a partir de sangueintegral por meio de métodos Ficoll-Hypague decentrifugação por densidade, conhecidos pelos versados natécnica. As PBMCs isoladas são lavadas duas vezes em meiocelular RPMI 1640 suplementado com HEPES, L-glutamina epenicilina/estreptomicina. As células lavadas sãoressuspensas em RPMI 1640 e contadas, e a densidade decélulas é adequadamente ajustada. As 2xl05 células sãoexpostas a uma gama de concentrações (de 0,1 μg/mL a100 //g/mL) de diversos mitogênios, exemplos dos quaisincluem mitogênio de caruru-de-cacho (Gibco),fitoemaglutinina (Gibco) e concanavalina A (Sigma), emtriplicata, durante 72 horas a 37 0C e 5% de CO2 com 10%de soro fetal bovino (Sigma). A 54 horas, as células sãopulsadas com 1 μCi 3H-timidina e coletadas, e as contagensde cintilação são lidas em um TopCount NXT a 72 horas.

Atividade de células "Natural Killer": Conforme descrito emUS 6 . 310 . 090, este ensaio mede a atividade efetora in vitrode células "natural killer" (NK) isoladas a partir de sangueintegral fresco de animais de teste e de controle. Ascélulas "natural killer" (NK) são um componente da funçãoimune inata de um mamífero. As células de adenocarcinomade tiróide felino são usadas como células-alvo na avaliaçãoda atividade citotóxica de células NK. Foi anteriormentedemonstrado que essa linhagem de células é suscetível àmorte por células NK felinas. As células-alvo foramcultivadas em um frasco T75 com 2 0 mL de meio mínimoessencial (MEM; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, EUA.),suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 100U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Quandoconfluentes, as células-alvo foram tripsinizadas, lavadas3 vezes e ressuspensas a 5xl05 células/mL em meio completo(RPMI-1640 + 10% FCS + 100 U/mL de penicilina + 100 μg/mL deestreptomicina) . Triplicatas de alíquotas de 100 μΐ dascélulas-alvo foram pipetadas em placas com 96 cavidades defundo em U (Costar, Cambridge, Massachussetsi EUA) eincubadas durante 8 horas para permitir a aderência dascélulas. Os linfócitos (células efetoras, 100 //L) isoladospor meio de separação Ficoll-Hypaque (conforme descritoacima) foram, então, adicionados às células-alvo para seobter uma razão entre células efetoras e células alvo (E:A)de 10:1. Após 10 horas de incubação a 37 °C, foramadicionados 2 0 ^L de um substrato contendo 5 μg de brometode 3 -(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio(MTT) . A mistura foi incubada durante 4 horas a 37 0C, apósos quais o MTT não-metabolizado foi removido por aspiração.Os cristais de formazan foram dissolvidos mediante a adiçãode 200 /xL de etanol a 95%. A densidade óptica (DO) foimedida em 570 nm, utilizando-se um leitor de microplacas.

A porcentagem de morte celular específica para célula NKfoi calculada conforme exposto a seguir:

Citotoxicidade específica (%) = 100 χ {l - [(DO de células-alvoe células efetoras - DO de células efetoras)/(DO decélulas-alvo)]}Resposta de anticorpos a vacinas: Os indivíduos de testereceberam um conjunto (até 5) de vacinas após ao menos 12semanas de alimentação probiótica ou de controle. Asvacinas podem ser uma mistura de vacinas novas eredundantes. Alguns exemplos não-limitadores de conjuntosde vacina que podem ser usado incluem misturas de vacinaspreparadas por Fort Dodge Animal Health. Alguns exemplosnão-limitadores de vacinas adequadas ao uso na presenteinvenção incluem cinomose felina, adenovírus,coronavxrus, parainfluenza, e parvovírus. A história devacinação do indivíduo determinará as vacinas a seremutilizadas. As quantidades, no sangue, de anticorposespecíficos para as vacinas administradas são medidasdurante 3 semanas, sendo comparadas a duração e aintensidade da resposta nos grupos com alimentação decontrole e probiótica.

Hipersensibilidade de tipo retardado: Um método in vivonão-invasivo para avaliação do estado do sistema imune.Este teste compreende uma injeção intradérmica domitogênio policlonal f itoemaglutinina (PHA) em combinaçãocom eritrócitos de ovelha, uma vacina multivalente,histamina (100 μΙ. de fosfato de histamina a 0,0275 g/L,Greer, Lenoir, NC) , ou PBS (100 μL de solução salinatamponada com fosfato a 8,5 g/L, Sigma). A respostaimunológica ao antígeno é registrada como espessura dadobra de pele, usando calibres, em intervalos de tempo de0, 24, 48 e 72 horas após a injeção. Umaumento na espessurada dobra de pele indica uma maior resposta dehipersensibilidade, que deve diminuir mediante otratamento com as bactérias da presente invenção.

Métodos adicionais para a determinação do efeito dasbactérias Lactobacilli da presente invenção são descritos em US6.133.323 e US 6.310.090.

Além disso, a melhoria quanto aos efeitos doenvelhecimento pode ser determinada mediante o uso deabsorptometria de dupla emissão de raios X ou tomografiacomputadorizada para medir a composição corporal, inclusivemassa corporal gorda, massa corporal magra e conteúdo mineralósseo. De modo similar, esse método pode ser usado paradeterminar alterações de anatomia como perda de peso oudensidade óssea em indivíduos, após infecção.

Os Lactobacilli da presente invenção também podem serusados em um método para redução dos níveis de estresse emanimais de estimação. As concentrações sangüíneas de hormôniosde estresse, inclusive epinefrína, norepinefrina, dopamina,cortisol e proteína C-reativa e outras proteínas de fase agudapodem ser medidas para determinar os níveis de estresse e suaredução ou manutenção. Esses hormônios são reconhecidosbiomarcadores de estresse, e podem ser prontamente medidosmediante o uso de técnicas conhecidas pelos versados na técnica.

Adicionalmente, a medição direta do tamanho adrenal como ummarcador in vivo da atividade do eixohipotalâmico-hipofisário-adrenal pode ser feita por meio deimagens de tomografia computadorizada.

Além disso, a manutenção ou a melhoria da saúde dapele e/ou da pelagem de animais de estimação, inclusive dedoença atópica da pele, pode ser medida mediante o uso deavaliações de pele e pelagem conduzidas por dois indivíduostreinados. Exemplos de critérios examinados durante essasavaliações incluem:

a) índice de queda de pêlos: Um índice de queda de pêlos éatribuído a cada indivíduo de teste mediante a coleta depêlos produzidos durante uma sessão de escovaçãopadronizada. Os pêlos são retidos e pesados, e osindivíduos de controle e de teste são comparados.

b) Avaliações subjetivas de pele/pelagem: Examinadorestreinados avaliam subjetivamente as condições de pele epelagem, mediante a determinação de queda de pêlos, caspa,brilho, uniformidade, maciez e densidade.

c) Avaliação funcional da pele: A função de barreira da pelepode ser avaliada mediante a esfregação da superfície dapele com uma gaze encharcada em acetona. Essa técnicaperturba, de maneira eficaz, a função de barreira da peleao remover da camada córnea camadas celulares individuais,juntamente com as frações de lipídio a estas associadas.

A perturbação da barreira é quantificada por meio damedição do aumento na perda transepidérmica de água (PTEA)e do grau de vermelhidão do local ofendido, mediante o usode métodos conhecidos pelos versados na técnica. Aspontuações para vermelhidão (eritema) são obtidas medianteo uso do sistema de câmera e iluminação anteriormentedescrito. Os registros de PTEA e as pontuações devermelhidão são obtidos imediatamente antes e depois daperturbação, bem como nos pontos finais às cinco e às 24horas, para avaliar as propriedades de proteção e cura dapele.

0 tratamento ou prevenção de diarréia em animais deestimação pode ser medido utilizando-se um método de pontuaçãodas fezes. A pontuação das fezes pode ser registradadiariamente, de acordo com as seguintes diretrizes, sendo osgrupos de controle e de teste comparados antes e depois daalimentação com as bactérias, de acordo com a presente invenção.

Pontuação: 5 Extremamente seca

Estas fezes são duras e não aderem a superfícies.

Estas fezes rolam quando empurradas. Não são produzidasindentações quando estas fezes são apanhadas. Estas fezes sãofreqüentemente defecadas em grupos de unidades individuais, emvez de uma unidade completa. Estas fezes mantêm seu formatooriginal após a coleta.

Pontuação: 4 Firme (fezes ideais)

Estas fezes são firmes, bem formadas e cilíndricas.Estas fezes não se rompem facilmente quando apanhadas. Estasfezes podem deixar resíduos sobre superfícies e luvas. Estasfezes são freqüentemente defecadas como uma só unidade. Estasfezes mantêm seu formato original após a coleta.

Pontuação: 3 Mole, com formato

Estas fezes são moles, no entanto têm formatosdefinidos. Estas fezes se rompem facilmente e, definitivamente,deixam resíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezesfreqüentemente perdem seu formato original após a coleta. Estasfezes freqüentemente se apresentam em conjunto com outrapontuação, mas podem compreender a totalidade da amostra.Pontuação: 2 Mole, sem formato

Estas fezes são moles e não apresentam formatocilíndrico. 0 formato freqüentemente associado a um "tipo 2" éaquele conhecido como "excremento de vaca". Estas fezes perdemo formato original quando coletadas, e definitivamente deixamresíduos sobre superfícies e luvas. Estas fezes freqüentementese apresentam em conjunto com outra pontuação, mas podemcompreender a totalidade da amostra. Estas amostras podem seespalhar por uma área de vários centímetros.

Pontuação: 1 Líquida

As fezes com esta pontuação sempre parecerãolíquidas, e pode ou não haver a presença de matéria particulada.Estas fezes são freqüentemente defecadas em grupos de montes,em vez de uma unidade completa. Muco está freqüentementepresente nas amostras deste tipo. As amostras deste tipo de fezessão de coleta muito difícil, e sempre deixa resíduos emsuperfícies e luvas. Estas amostras podem se espalhar por umaárea de vários centímetros.

Além disso, são registradas outras observações,inclusive: presença de sangue, de objetos estranhos ou de muconas fezes.

Além disso, o tratamento de infecção gastrointestinalem animais de estimação pode compreender a otimização daecologia microbiana dos mesmos. A otimização da ecologiamicrobiana em animais de estimação compreende, de preferência,a redução dos teores de bactérias patogênicas nas fezes dosmesmos. Os teores de bactérias patogênicas presentes nas fezesde animais de estimação podem ser enumerados mediante o uso dométodo padrão de contagem em placa, conhecido pelos versados natécnica. Com mais preferência, as bactérias patogênicas sãoselecionadas a partir do grupo consistindo em Clostridia,Escherichia, Salmonella, bacteroides e combinações das mesmas.

Alguns exemplos não-limitadores de cepas de bactériaspatogênicas adequadas incluem C. perfringens, C. difficile,Eschericia coli, Salmonella typhimurium e combinações destas.

0 método de uso das bactérias da presente invençãopode incluir, também, o tratamento profilático ou terapêuticodo trato urinário de mamíferos, de preferência animais deestimação. Alguns exemplos rião-limitadores de tratamentos dotrato urinário incluem tratamento ou prevenção de infecções dotrato urinário, tratamento ou prevenção de doenças renais,inclusive pedras no trato urinário, tratamento ou prevenção deinfecções na bexiga, e similares. Sem se ater à teoria,acredita-se que as bactérias Lactobacilli da presente invençãosão úteis na prevenção dessas doenças como resultado de suacapacidade para degradar o ácido oxálico, conforme demonstradoin vitro. 0 ácido oxálico é um subproduto do metabolismo urinárioque pode formar precipitados insolúveis, os quais resultam eminfecções nos rins, na bexiga e em outras partes do tratourinário. Ao degradar o ácido oxálico e, portanto,potencialmente evitar sua precipitação e acúmulo no tratourinário, as bactérias da presente invenção podem tratar eprevenir infecções e outras doenças do trato urinário. Adegradação do ácido oxálico pode ser medida in vitro medianteo uso do kit para testes de ácido oxálico cat # 755699, disponívelcomercialmente junto à Boehringer Mannheim/R-Biopharm.Os Lactobacilli da presente invenção podem ser usadosem um método para a melhoria ou manutenção da saúde de animaisde estimação, compreendendo a melhoria da digestão de fibras.

A melhoria da digestão de fibras é desejável, pois promove aproliferação das ditas bactérias probióticas, bem como damicroflora endógena benéfica, o que auxilia na supressão dealgumas bactérias potencialmente patogênicas. Além disso, umadiminuição na quantidade de metabólitos tóxicos e enzimasnocivas que resultam da fermentação colônica foi documentada emseres humanos (Tomomatsu, H. "Health effects ofoligosaccharides", (1994) Food Technol, 48, 61-65) . A digestãode fibras pode ser determinada mediante o uso do método descritoem Vickers et al. (2001), "Comparison of fermentation of selectedfructooligosaccharides and other fiber substrates by felinecolonic microflora", Am. J. Vet. Res. 61 (4), 609-615, excetopelo fato de que em vez de inocular usando amostras fecaisdiluídas, cada experimento utilizou culturas puras das cepasbacterianas em questão.

As cepas probióticas felinas da presente invençãopodem ser usadas para reduzir o odor das fezes e da urina e,concomitantemente, na caixa de areia, mediante a redução daprodução de compostos, nas fezes e na urina, que causam odor.

Alguns exemplos não-limitadores de compostos causadores de odorincluem amônia, indóis, fenõis, aminas, ácidos graxos de cadeiaramificada e compostos voláteis contendo enxofre. Sem se ater àteoria, acredita-se que a redução dos teores desses compostos nasfezes ou na urina de um animal de estimação reduz o odor associadoàs mesmas. Além disso, para animais de estimação que usem caixade areia, há uma diminuição concomitante no odor da caixa deareia.

O método de uso das bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção tipicamente envolve o consumo oralpelo animal. 0 consumo oral pode ocorrer como parte da ingestãodietária normal, ou sob a forma de um suplemento à mesma. 0 consumooral tipicamente ocorre ao menos uma vez por mês, de preferênciaao menos uma vez por semana e, com mais preferência, ao menos umavez por dia. As bactérias formadoras de ácido láctico da presenteinvenção podem ser administradas ao animal de estimação em umaquantidade terapeuticamente eficaz para manter ou melhorar asaúde do animal, de preferência um animal de estimação. Para usona presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz", no que se refere às bactérias formadoras de ácidoláctico, significa aquela quantidade de bactérias que ésuficiente para proporcionar o efeito ou benefício desejado a umanimal hospedeiro precisando de tratamento, porém baixa osuficiente para evitar efeitos adversos como toxicidade,irritação ou resposta alérgica, proporcionalmente a uma relaçãorisco/benefício razoável quando usada do modo indicado napresente invenção. A "quantidade terapeuticamente eficaz"específica irá variar conforme fatores como a condição específicasendo tratada, as condições físicas do usuário, a duração dotratamento, a natureza da terapia simultânea (caso haja) , a formade dosagem específica a ser utilizada, o veículo empregado, asolubilidade da forma de dosagem, e o regime de dosagem específico.De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico são fornecidas ao animal de estimação em uma dose na faixade 1, 0E+04 a 1, OE+14 ufc por dia e, com mais preferência, na faixade l,0E+06 a 1,0E+12 ufc por dia. A composição pode conter, depreferência, ao menos 0,001% de bactérias formadoras de ácidoláctico do gênero Lactobacilli, na faixa de l,0E+04 a1,0E+12 ufc/g, obteníveis mediante isolamento a partir de tratoGI felino ressecado e lavado. As bactérias formadoras de ácidoláctico podem ser administradas ao animal em sua forma viável,sob a forma de células mortas, ou como destilados, isolados ououtras frações dos produtos de fermentação das bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção, ou qualquermistura desses materiais.

De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico, ou uma fração purificada ou isolada das mesmas, sãousadas para preparar uma composição destinada a manter oumelhorar a saúde de um animal. Conforme indicado acima, acomposição pode ser parte da ingestão dietária normal, ou podeser um suplemento. Nos casos em que a composição faz parte daingestão dietária normal, esta pode estar sob a forma de umalimento seco para animais, como biscoitos ou ração, um alimentoà base de grãos processados, um alimento úmido para animais,iogurtes, molhos, itens mascáveis, petiscos e similares.

Essas composições podem compreender outroscomponentes. Outros componentes são benéficos para inclusãonas composições usadas na presente invenção, mas são opcionaispara os propósitos da invenção. Por exemplo, as composiçõesalimentícias são, de preferência, nutricionalmentebalanceadas. Em uma modalidade, as composições alimentíciaspodem compreender, com base na matéria seca, de cerca de 20%a cerca de 50% e, de preferência, de cerca de 22% a cerca de40% de proteína bruta, em peso da composição alimentícia. 0material de proteína bruta pode compreender qualquer materialtendo um teor de proteínas de ao menos cerca de 15% em peso,sendo que alguns exemplos não-limitadores destes incluemproteínas vegetais como feijão soja, caroço de algodão eamendoim, e proteínas animais como caseína, albumina e tecidocárneo.

Alguns exemplos não-limitadores de tecido cárneo útilà presente invenção incluem carne fresca e farinhas secas ouprocessadas, como farinha de peixe, farinha de aves, farinhade carne, farinha de ossos e similares. Outros tipos de fontesadequadas de proteína bruta incluem glúten de trigo ou de milho,e proteínas extraídas de fontes microbianas, como levedura.

Além disso, as composições alimentícias podemcompreender, com base na matéria seca, de cerca de 5% a cerca de35% e, de preferência, de cerca de 10% a cerca de 30% de gordura,em peso da composição alimentícia. Além disso, as composiçõesalimentícias compreendendo as bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção podem, também, compreender de cercade 4% a cerca de 25% de fibra dietária total. As composições podem,também, compreender múltiplas fontes de amido, conforme descritoem W099/51108.

As composições da presente invenção podem conter,ainda, uma fonte de carboidrato. São fontes ilustrativas osgrãos ou cereais como arroz, milho, milo, sorgo, cevada,alfafa, trigo e similares. Além disso, as composições tambémpodem conter outros materiais, como soro de leite seco e outrossubprodutos lácteos.

As composições compreendendo as bactérias da presenteinvenção podem, também, compreender um prebiótico. 0 termo"prebiótico"inclui substâncias ou compostos que são fermentadospela flora intestinal do animal de estimação e,conseqüentemente, promovem a proliferação ou o desenvolvimentode bactérias formadoras de ácido láctico no tratogastrointestinal do dito animal, em detrimento de bactériaspatogênicas. 0 resultado dessa fermentação é uma liberação deácidos graxos, em particular ácidos graxos de cadeia curta, nocólon. Isto tem o feito de reduzir o valor de pH no cólon. Algunsexemplos não-limitadores de prebióticos adequados incluemoligossacarídeos, como inulina e seus produtos de hidróliseconhecidos como frutooligosacarídeos, galactooligosacarídeos,xilooligossacarídeos, ou oligoderivados de amido. Osprebióticos podem ser fornecidos sob qualquer forma adequada.Por exemplo, o prebiótico pode ser fornecido sob a forma dematerial de origem vegetal contendo essas fibras. Os materiaisde origem vegetal adequados incluem aspargo, alcachofras,cebolas, trigo ou chicória, bem como resíduos desses materiaisde origem vegetal. Alternativamente, a fibra prebiótica pode serfornecida sob a forma de um extrato de inulina, sendo adequados,por exemplo, os extratos de chicória. Os extratos de inulinaadequados podem ser obtidos junto à Orafti SA de Tirlemont 3300,Bélgica, sob a marca registrada "Raftiline". Por exemplo, ainulina pode ser fornecida sob a forma de Raftiline (g) ST, queé um pó branco fino que contém de cerca de 90% a cerca de 94%,em peso, de inulina, até cerca de 4%, em peso, de glicose efrutose, e de cerca de 4% a 9%, em peso, de sacarose.Alternativamente, a fibra pode estar sob a forma de umfrutooligossacarídeo como aquele obtido junto à Orafti SA deTirlemont 3300, Bélgica, sob a marca registrada "Raftilose". Porexemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma de Raftilose(g) P95. De outro modo, os frutooligosacarídeos podem serobtidos pela hidrólise da inulina por meio de métodosenzimáticos, ou mediante o uso de microorganismos.

Para alimentos secos para animal de estimação, umprocesso adequado é a cocção com extrusão, embora assamento eoutros processos adequados possam ser usados. Quando cozido comextrusão, o alimento seco para animais de estimação é geralmentefornecido sob a forma de uma ração. Se for usado um prebiótico,este pode ser misturado, antes do processamento, aos demaisingredientes do alimento seco para animais de estimação.

Um processo adequado é descrito no Pedido de Patente Européia N00850569 . Se for usado um microorganismo probiótico, é melhor queeste seja aplicado como um revestimento ou um recheio no alimentoseco para animais de estimação. Umprocesso adequado é descritona publicação de patente européia número EP 0 862 863.

Para alimentos úmidos, os processos descritos naspatentes U.S. N0 4.781.939 e 5.132.137 podem ser usados paraproduzir produtos cárneos simulados. Outros procedimentos paraa produção de produtos em pedaços também podem ser usados como,por exemplo, cozimento em um forno a vapor. Alternativamente,produtos em filão podem ser produzidos mediante a emulsificaçãode um material cárneo adequado para produzir uma emulsão decarne, adicionando-se um agente gelificante adequado eaquecendo-se a dita emulsão de carne, antes de acondicionar amesma em latas ou outros recipientes. As composiçõesalimentícias úmidas típicas podem compreender de cerca de 5% acerca de 15% de proteína, de cerca de 1% a cerca de 10% de gordura,e de cerca de 1% a cerca de 7% de fibras. Exemplos não-limitadoresde ingredientes que podem ser usados em composições alimentíciasúmidas incluem frango, peru, carne bovina, pescado branco, caldode frango, caldo de peru, caldo de carne bovina, fígado defrango, quirela de arroz, grits de milho, farinha de peixe, ovos,polpa de beterraba, cloreto, farelo de linhaça, cordeiro,subprodutos de carne bovina, subprodutos de frango e misturasdesses itens.

Em outra modalidade, as composições de suplementocomo biscoitos, itens mascáveis e outros petiscos podemcompreender, com base na matéria seca, de cerca de 20% a cercade 60% de proteína, ou de cerca de 22% a cerca de 40% de proteína,em peso da composição de suplemento. Como outro exemplo, ascomposições de suplemento podem compreender, com base na matériaseca, de cerca de 5% a cerca de 35% de gordura, ou de cerca de10% a cerca de 30% de gordura, em peso da composição desuplemento. As composições alimentícias e de suplementodestinadas ao uso por felinos são de conhecimento comum na técnica.

Os alimentos para animal de estimação podem conteroutros agentes ativos, como ácidos graxos de cadeia longa ezinco. Os ácidos graxos de cadeia longa adequados incluem ácidoalfa-linoléico, ácido gama-linolênico, ácido linoléico, ácidoeicosapentanóico e ácido docosaexanóico. Os óleos de peixe sãouma fonte adequada de ácidos eicosapentanóicos e ácidodocosaexanóico.

0 óleo de borragem, o óleo de semente de groselhanegra e o óleo de prímula são fontes adequadas de ácidogama-linolênico. Os óleos de cártamo, os óleos de girassol, osóleos de milho e os óleos de soja são fontes adequadas de ácidolinoléico. Esses óleos também podem ser usados nos substratospara revestimento mencionados acima. 0 zinco pode ser fornecidode diversas formas adequadas, por exemplo como sulfato de zincoou óxido de zinco. Além disso, muitos ingredientes comumenteusados em alimentos para animal de estimação são fontes deácidos graxos e de zinco. Tem sido observado que a combinaçãode chicória, como uma fonte de prebiótico, com um óleo rico emácido linoléico, como o óleo de soja, proporciona benefíciosinesperados, que sugerem um efeito sinérgico.

Nos casos em que a composição está sob a forma de ummolho, esta compreende, de preferência, ao menos 10% de umcaldo, sendo que alguns exemplos não-limitadores destesincluem caldos de vegetais, de carne bovina, de frango ou depresunto. As composições de molho típicas podem compreender decerca de 0,5% a cerca de 5% de proteína bruta, de cerca de 2%a cerca de 5% de gordura bruta, e de cerca de 1% a cerca de 5% de fibras.

Alguns outros exemplos não-limitadores desuplementos adequados ao uso na presente invenção incluem pós,suspensões de óleo, suspensões à base de leite e queijos, ecomposições à base de manteiga de cacau bem como pílulas oucápsulas. Nos casos em que a composição está sob a forma de umapílula, agentes de ligação adequados são necessários para mantera pílula sob uma forma sólida e comprimida. Alguns exemplosnão-limitadores de agentes de ligação adequados incluem as gomasnaturais como goma xantana, pectinas, lecitinas, alginatos eoutras conhecidas pelos versados na técnica. Nos casos em quea composição está sob a forma de uma cápsula, esta é depreferência encapsulada mediante o uso de tecnologiasconhecidas pelos versados na técnica. Alguns exemplosnão-limitadores de materiais de encapsulação adequados incluemálcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP),alginatos e gelatina. As composições à base de iogurte podemcompreender de cerca de 1% a cerca de 5% de proteína, de cercade 10% a cerca de 20% de carboidrato, de cerca de 1% a cerca de5% de fibra, de cerca de 1% a cerca de 5% de gordura e de cercade 50% a cerca de 90% de um veículo líquido, como leite.

Exemplos

Esses exemplos são fornecidos para ilustrar ainvenção, e não se destinam a limitar, em nenhum aspecto, oescopo da mesma.

Exemplo 1: isolamento de bactérias formadoras deácido láctico a partir de trato gastrointestinalfelino

Amostras de intestinos de felino foram obtidas apartir de gatos saudáveis apresentados a veterinários locaispara eutanásia iniciada e aprovada pelos donos dos animais.Todos os animais estavam saudáveis e isentos de doenças. Foramdissecados o cólon, o cólon médio, o ceco e o íleo de cada gato,de maneira a expor a mucosa.

Os sobrenadantes foram removidos após agitação dotecido mucoso (em vórtice durante 1 minuto) e homogeneizaçãomecânica do tecido. Cada sobrenadante foi colocado em uma placade ágar do tipo de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar. Estas foramincubadas anaerobicamente, mediante o uso de um sistemaAnerocult GasPak, durante 4 8 horas a 37 °C. As colônias isoladasa partir das placas foram reaplicadas por esfregaço em MRS, enovamente cultivadas anaerobicamente sob as mesmas condições.

As colônias isoladas foram reaplicadas por esfregaço mais 4vezes, com a finalidade de purificar uma cepa única. Foramavaliadas a morfologia e a aparência microscópica da colônia.

Os isolados adequados foram testados quanto a reação de Gram eatividade de catalase. A identificação de bastonetesGram-positivos, catalase-negativos, foi realizada medianteteste de API (API 5OCHL, BioMerieux) . As células colhidas foramlavadas duas vezes com um tampão de fosfato (pH 6,5) a 0,05 Me cisteína HCl (500 mg/L) , sendo a lavagem seguida de sonicação.

Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação. Ossobrenadantes foram incubados com NaF (6 mg/mL) e Na iodoacetato(10 mg/mL) durante 3 0 minutos a 37 °C.A reação foi interrompidamediante incubação com hidroxilamina HCl (pH 6,5) durante 10minutos à temperatura ambiente. 0 desenvolvimento de cor foimonitorado em seguida à adição de HCl (4M) , FeCl3. 6H20 (5% (p/v)em 0, IM HCl) e frutose-6-fosfato (sal de Na). A formação deacetil fosfato a partir de frutose-6-fosfato foi evidenciadapela cor avermelhada formada pelo quelato férrico de seuhidroximato.

Exemplo 2: triagem quanto à atividade microbicida

Cada uma das cepas de bactérias formadoras de ácidoláctico foi incubada anaerobicamente em caldo MRS. 2 μΐι de cadacultura foram aplicados em pontos sobre placas de ágar MRS, asquais foram incubadas anaerobicamente de um dia para outro.Salmonella typhimurium e E. Coli enteropatogênica (ExPEC) forampré-cultivadas de um dia para outro, e 100 ml foram inoculadosem agar fundido (1% v/v). Essa cultura indicadora foi vertidasobre a superfície das placas de MRS inoculadas. Após incubaçãode um dia para outro, as zonas de inibição em redor da colôniaprobiótica foram medidas. Todos os experimentos foramrealizados em duplicata, em três ocasiões separadas. Além disso,a incorporação do tampão de 2% de betaglicerofosfato ao ágarpossibilitou determinar a contribuição da produção de ácido àinibição in vitro de patógenos que foi observada.

Os dados apresentados na Tabela 2 demonstramclaramente que as cepas de bactérias formadoras de ácido lácticoda presente invenção, obteníveis mediante isolamento a partirde trato GI felino ressecado e lavado, têm significativaatividade microbicida in vitro, indicadora de uma potencialatividade probiótica.

Tabela 2

<table>table see original document page 35</column></row><table>Exemplo 3: medições in vitro de sobrevivência e colonização

Tolerância a pH

As células bacterianas foram colhidas de culturasincubadas de um dia para outro, lavadas duas vezes em tampão defosfato (pH 6,5) e ressuspensas em caldo de MRS/TPY ajustado comIM HCl até pH 2,5. As células foram incubadas anaerobicamentea 37 °C, e sua sobrevivência foi medida a intervalos de 0, 30,60, 120, 240 e 360 minutos, mediante o uso do método de contagemem placas conhecido pelos versados na técnica. A Tabela 3sumariza esses dados por cepa.

Tabela 3

Sobrevivência de cepas em um ambiente de baixo pH (pH 2,5). Todosos dados são mostrados em Iog UFC.

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Resistência à bílis

As cepas bacterianas foram aplicadas por esfregaçosobre ágar MRS suplementado com bílis de porco (Sigma) a 0,5%,1% e 5% (p/v) . As placas foram incubadas a 37 0C sob condiçõesanaeróbicas, e a proliferação foi registrada após 48 horas. Aproliferação foi comparada com placas de controle por umobservador experiente, e a proliferação das colônias foidescrita como:

Negativa (0) - nenhuma proliferação,+ (1) - proliferação translúcida nebulosa (menos de33% das placas de controle com 0% de bílis),

+ + (2) - proliferação definida, porém não tão boa comonas placas de controle (mais de 33%, porém menos que 66%);

+++ (3) - proliferação equivalente à das placas decontrole (>66%).

Uma vez que a proliferação das colônias na presença desais biliares é comparada às placas de controle, os descritoresde proliferação recebem valores numéricos de 0, 1, 2 ou 3 (-, +,++ ou +++, respectivamente) e são, então, expressos como umaporcentagem, em que 3 representa 100%.

A Tabela 4 demonstra que a Bifidobacterium da presenteinvenção claramente apresenta uma resistência a sais biliares,sendo capaz de se proliferar e formar colônias em níveis de aomenos 66%, na maioria dos casos, quando exposta a 0,5% de saisbiliares de porco.

Tabela 4

Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílis de porco

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Além disso, para avaliar quaisquer diferenças nacapacidade das cepas para colonizar o trato GI de gatos, as cepasbacterianas foram aplicadas por esfregaço sobre ágar MRSsuplementado com bílis felina a 0,5%, 1% e 2% (peso/volume) . Abílis felina foi obtida a partir de gatos que foram submetidosa endoscopia em um ambiente clínico durante um procedimentonão-terminal. As placas foram incubadas a 37 0C sob condiçõesanaeróbicas, e a proliferação foi registrada após 48 horas. Aproliferação foi comparada com placas de controle por umobservador experiente, e a proliferação das colônias foidescrita como:

Negativa (0) - nenhuma proliferação,+ (1) - proliferação translúcida nebulosa (menos de33% de placas de controle com 0% de bílis),

+ + (2) - proliferação definida, porém não tão boa comonas placas de controle (mais de 33%, porém menos que 66%);

+++ (3) - proliferação equivalente à das placas decontrole (>66%) .

Uma vez que a proliferação das colônias na presença desais biliares é comparada às placas de controle, os descritoresde proliferação recebem valores numéricos de 0, 1, 2 ou 3 (-, +,++ ou +++, respectivamente) e são, então, expressos como umaporcentagem, em que 3 representa 100%.

A Tabela 5 demonstra que a Bifidobacterium da presenteinvenção claramente apresenta uma resistência a sais biliaresde felinos, sendo capaz de se proliferar e formar colônias emníveis de ao menos 66%, na maioria dos casos, quando exposta a0,5% de sais biliares de porco.

Tabela 5

Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílis felina

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>

Adesão a células epiteliais intestinais

A linhagem de células epiteliais humanas HT-29 foiusada para avaliar as propriedades de adesão das cepasselecionadas. As células epiteliais foram cultivadas de modorotineiro, sob a forma de camada única em frascos de 75 cm2 paracultura de tecidos, a 37 0C em uma atmosfera umidifiçada contendo5% de CO2 em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) contendo10% de soro fetal de bezerro (FCS), penicilina/estreptomicina,glutamina e fungizona. Para fins do experimento, as célulasepiteliais foram semeadas a uma concentração de 5 χ IO5 células/mL(3 mL de volume total) por cavidade, em placas de cultura com 6cavidades (Sarstedt). Após incubação durante 7 dias, parapermitir diferenciação, as camadas únicas epiteliais foramlavadas com meio isento de antibióticos, contendo 10% de FCS. Assuspensões bacterianas mais/em DMEM isento de antibióticos foramadicionadas a cada cavidade, e as células foram incubadas durante90 minutos a 37 °C. Após a incubação, as camadas únicas foramlavadas três vezes com PBS. As células epiteliais foram lisadasem H2O desionizada, e o número de bactérias aderentes foi obtidomediante o uso do método de contagem em placas conhecido pelosversados na técnica. A adesão foi expressa como uma porcentagemdo número de bactérias inicialmente aplicadas à placa. 0Lactobacillus AHF122A apresentou um nível de adesão de 39,5%,enquanto o Lactobacillus AHF223C apresentou um nível de adesãode 13,9%. Já o Lactobacillus AHF5119 apresentou um nível de adesãode 36,7%.

Exemplo 4: seqüenciamento de polinucleotídeointergênico 16s-23s

Os isolados de Bifidobacterium felina foramcentrifugados em tubos de estoque, e os peletes resultantesforam lisados em 100 ^L de solução para extração e 2 5 μΐι desolução para preparação de tecidos (Sigma, kit XNAT2), eincubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. As amostrasforam, então, incubadas durante 5 minutos a 95 0C e, então, foramadicionados 100 /iL de solução para neutralização (kit XNAT2) .

A solução de DNA genômica foi, então, quantificada mediante ouso de um espectrofotômetro Nanodrop, e armazenada a 4 0C.

0 PCR foi realizado mediante o uso de iniciadores deespaçador intergênico (IGS), IGS L: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' eIGS R: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (Bridgidi et al. , 2000, SystemAppl. Microbiol., 23, 391-399 (2000)). As condições de cicloforam de 94 0C durante 3 minutos (1 ciclo), 94 0C durante 3 0segundos, 53 0C durante 3 0 segundos, e 72 0C durante 3 0 segundos(28 ciclos) . A reação de PCR continha 4 μΙ> (50 ng) de DNA,mistura de PCR (kit XNAT2), 0,4 μΜ de iniciador IGS LeR (MWGBiotech, Alemanha). As reações de PCR foram realizadas em umtermociclo Eppendorf . OsprodutosdePCR (10 μΐΟ foram passados,juntamente com um marcador para peso molecular (100 bp Ladder,Roche) por um gel a 2% de agarose manchado com EtBr em TAE, paradeterminar seu perfil de IGS.Os produtos de PCR da Bifidobacterium (banda única)foram purificados mediante o uso do kit de purificação PromegaWizard PCR.

Os produtos de PCR purificados foram seqüenciadosmediante o uso de seqüências iniciadoras (acima) para a regiãode espaçador intergênico. Os dados de seqüência foram, então,pesquisados contra a base de dados de nucleotídeos do NCBI, paradeterminar a identidade da cepa por homologia de nucleotídeos.

Em seguida ao seqüenciamento, as seqüências obtidapara as quatro cepas depositadas foram comparadas à base de dadosde seqüências "BLAST", disponível online emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para verificação dehomologia com outras seqüências bacterianas de 16s a 23sdepositadas. A similaridade mais próxima para AHF122A foiapresentada pela cepa Lactobacillus salívarius subsp.Salicinius (AB102859) , com um grau de homologia de 94%. Asimilaridade mais próxima para AHF223C foi apresentada porLactobacillus animalis, cepa LA51 (AY526615), com um grau dehomologia de 93%. A similaridade mais próxima para AHF5316 foiapresentada por Laetobaeillus reuteri DSM 20016 (AF080100) , comum grau de homologia de 98%.

Exemplo 5: exemplos de composição

Os Exemplos 1 a 4 são exemplos de composições de raçãoseca compreendendo os Lactobaeilli probióticos da presenteinvenção.

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Os Exemplos de 5 a 7 são exemplos de composições úmidasde alimento para animais de estimação compreendendo asLactobacilli probióticas da presente invenção.

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Os Exemplos de 8 a 10 são exemplos de composições desuplemento à base de iogurte compreendendo as Lactobacilliprobióticas da presente invenção.

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Todos os documentos citados na Descrição Detalhada daInvenção são, em parte relevante, aqui incorporados porreferência, e a citação de qualquer documento não deve serinterpretada como admissão de que este represente técnicaanterior com respeito à presente invenção.

Embora modalidades específicas da presente invençãotenham sido ilustradas e descritas, deve ficar óbvio aosversados na técnica que várias outras alterações e modificaçõespodem ser feitas sem que se desvie do caráter e âmbito dainvenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindicaçõesanexas todas essas alterações e modificações que se enquadramno escopo da presente invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Alimentary HealthThe IAMS CompanyBoileau, Thomas

Kiely, BarryMacSharry, JohnO1Mahony, LiamSunvold, Gregory

<120> Cepas de lactobacilos felinos

<130> P172P2&

<14O> Ainda não designada<141> 2005-06-21

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 269

<212> DNA

<213> Lactobacillus salivarius subsp. salicinius

<22 0 >

<221> miscelânea

<222> (13) . . (14)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (18) . . (18)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (21)..(21)

<223> η is a, c, g, or t

<22 0>

<221> miscelânea

<222 > (26) . . (26)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (28) .. (28)

<223> η is a, c, g, ort

<220><221>

miscelânea<222> (43)..(43)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (65)..(65)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (121) . . (122)

<223> η is a, c, g, or t<220>

<221> miscelânea

<222> (124)..(124)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (166) . . (166)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (225) . . (225)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (255) . . (255)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (267) . . (267)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 1

ttgcgggatc acnncctntc naaggnanaa ttacggaacc tgnacattta tcggatactt 60tgttnagttt tgagaggtca tatctctcaa gattttgttc tttgaaaact agatattgat 120nnanttctta aaaataaacc gagaacaccg cgttttaaag agtttnaaac aagaattata 180gttcttaatc gctaaactca taacctatta tcgttagata atatnaggtt aagttattaa 240gggcgtatgg tggangcctt ggccccnga 269

<210> 2

<211> 255

<212> DNA

<213> Lactobacillus animalis<220>

<221> miscelânea

<222> (2) . . (2)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (6) . . (6)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (12) . . (12)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (14) . . (14)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (24) . . (24)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (50) . . (50)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (52) . . (52)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (60) .. (60)

<223> nisa, c, g, ort

<220>

<221> miscelânea

<222> (114)..(115)

<223> nisa, c, g, ort

<220>

<221> miscelânea

<222> (117)..(117)

<223> nisa, c, g, ort

<220><221>

miscelânea<222> (120) .. (120)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (123) . . (123)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (186) . . (186)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (208) . . (208)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (232) . . (232)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (240) . . (240)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (249) . . (249)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (252) . . (252)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 2

cncctnactt ancnccattt atcntacgat aatggttatg agtttagcgn tnaaacattn 60atgttttaaa ctctttaaaa cgcggtgttc tcggttattt taattaacaa aganntnaan 120ganattatct agttttcaaa gaacaagttt gagagtagac ctctcaaaac taaacaaagt 180tcacgntaaa gtgcaggttt ccgaaatnat ccttagaaag gaggtgagcc ancagagaan 24 0ggaggtganc cngca 255

<210> 3

<211> 284

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri<220>

<221> miscelânea

<222> (121)..(121)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (265)..(265)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (268) . . (268)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (274)..(274)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (276)..(276)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 3

gggtctgctg gatcacctcc tttctaagga ataaaacgga acctacacat cgaagaaact 60

ttgtttagtt ttgaggggtt taccctcaga gcttgtactt tgaaaactaa atactatcgt 120

natttcttta ttaacaaaac aataaaccga gaacaccgcg ttatttgagt tttaattaac 180

gaattataat cgctaactca attaatcaga caatctttga ttgtttgggt taagttatga 240

agggcgcatg gtggatgcct tggcnccnga gccncnagac caga 284

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência do iniciador de PCR

<400> 4

gctggatcac ctcctttc 18

<210><211><212>

18DNA<213 > Artificial<220>

<223> Seqüência do iniciador de PCR<400> 5

ctggtgccaa ggcatcca 18

Claims (63)

1. Cepa de bactérias formadoras de ácido láctico, dogênero Lactobacilli, obtenível mediante isolamento a partir detrato gastrointestinal felino ressecado e lavado, caracterizadapelo fato de apresentar atividade probiótica.

2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ter a capacidade de sobreviver ecolonizar o trato gastrointestinal de um animal de estimação.

3. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de apresentar ao menos 33% deproliferação quando cultivada na presença de 0,5% de saisbiliares de felino.

4. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de ser capaz de manter sua viabilidadeapós 1 hora sob pH 2,5.

5. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser uma espécie selecionada do grupoconsistindo em Lactobacillus salivarius, Lactobacillusanimalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus aeidophilus,Laetobaeillus johnsonni, Laetobaeillus brevis, Laetobaeillusbulgarieus, Laetobaeillus casei, Laetobaeillus eellobiosus,Laetobaeillus eurvatus, Laetobaeillus delbruekii,Laetobaeillus fermentum, Laetobaeillus helvetieus,Laetobaeillus laetis, Laetobaeillus plantarum e misturas dasmesmas.

6. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DNA da região doespaçador 16s-23s tendo mais de 94% de homologia com SEQ. ID N0-1, mais de 93% de homologia com SEQ. ID N0 2, ou mais de 98% dehomologia com SEQ. ID N0 3.

7. Cepa, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DNA da região doespaçador 16s-23s selecionada dentre SEQ. ID N0 1, SEQ. ID N0-2 ou SEQ. ID N0 3.

8. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindoem Lactobacillus salivarius ss salicinius NCIMB 41287 (AHF-122A) , Lactobaclllus animalis NCIMB 41288 (AHF 223C) ,Lactobacillus reuteri NCIMB 41289 (AHF 5119), mutações dasmesmas e misturas das mesmas.

9. Cepa, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

10. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o animal de estimação é um gato.

11. Método para manter ou aprimorar a saúde de umanimal de estimação, caracterizado pelo fato de compreender aadministração oral de bactérias formadoras de ácido láctico dogênero Laetobaeilli, obteníveis mediante isolamento a partir detrato gastrointestinal felino ressecado e lavado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa é selecionada com base emsua capacidade para sobreviver e colonizar o tratogastrointestinal de animais de estimação.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de a cepa apresentar ao menos 33% deproliferação quando cultivada na presença de 0,5% de saisbiliares de felino.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de a cepa ser capaz de manter suaviabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de a cepa ser selecionada do grupoconsistindo em Lactobacillus salivarius, Lactobacillusanimalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus johnsonni, Lactobacillus brevis, Lactobacillusbulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus,Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruekii,Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus,Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum e misturas dasmesmas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DMA da região doespaçador 16s-23s tendo mais de 94% de homologia com SEQ. ID N0-1, mais de 93% de homologia com SEQ. ID N0 2, ou mais de 98% dehomologia com SEQ. ID N0 3.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DNA da região doespaçador 16s-23s selecionada dentre SEQ. ID N0 1, SEQ. ID N0-2 ou SEQ. ID N0 3.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de a dita cepa ser selecionada do grupoconsistindo em Lactobacíllus salivarius ss salicinius NCIMB 41287 (AHF 122A) , Lactobacíllus animalis MCIMB 41288 (AHF 223C) ,Lactobacíllus reuteri NCIMB 41289 (AHF 5119), mutações dasmesmas e misturas das mesmas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar à regulação ouaprimoramento do sistema imune de animais de estimação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doença autoimune em animais de estimação.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de inflamações em animais de estimação.

23. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar a manter ou aprimorar asaúde da pele e/ou da pelagem de animais de estimação.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doença atópica da pele em animais de estimação.

25. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar à melhoria ou redução dosefeitos do envelhecimento em animais de estimação.

26. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar a evitar a perda de pesodurante e após ocorrência de infecção em animais de estimação.

27. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de infecção gastrointestinal em animais de estimação.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de se destinar à otimização da ecologiamicrobiana de animais de estimação.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de compreender a redução dos teores debactérias patogênicas nas fezes de animais de estimação.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de as ditas bactérias patogênicas seremselecionadas a partir do grupo consistindo em Clostridia,Escherichia, Salmonella e misturas das mesmas.

31. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doenças do trato urinário em animais de estimação.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a dita doença do trato urináriocompreende infecção do trato urinário.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a dita doença do trato urináriocompreende pedras no trato urinário.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que os ditos Lactobacilli probióticosaumentam a degradação de ácido oxálico in vitro.

35. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de aumentar a digestão de fibras emanimais de estimação.

36. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracteri zado pelo fato de reduzir os níveis de estresse emanimais de estimação.

37. Método, de acordo, com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que os ditos níveis de estresse sãomedidos mediante a determinação dos teores de hormônios deestresse selecionados do grupo consistindo em epinefrina,norepinefrina, dopamina, cortisol, proteína C-reativa ecombinações desses itens.

38. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracteri zado pelo fato de a cepa ser fornecida como alimentoa um animal, em qualquer quantidade na faixa de Ι,ΟΕ+04 a 1,OE+12 UFC/animal por dia.

39. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao preparo de umacomposição destinada a manter ou aprimorar a saúde do animalde estimação.

40. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracteri zado pelo fato de que o animal de estimação é um gato.

41. Composição, caracterizada pelo fato decompreender uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico,do gênero Lactobacilli, obtenível mediante isolamento a partirde trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, comatividade probiótica, e um veículo.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a cepa é selecionada com base emsua capacidade para sobreviver e colonizar o tratogastrointestinal de animais de estimação.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de a cepa apresentar ao menos 33% deproliferação quando cultivada na presença de 0,5% de saisbiliares de felino.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de a cepa ser capaz de manter suaviabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de ser uma espécie selecionada do grupoconsistindo em Lactobacillus salivarius, Lactobacillusanimalis, Lactobacillus reuteri, Laetobaeillus aeidophilus,Lactobacillus johnsonni, Laetobaeillus brevis, Laetobaeillusbulgarieus, Laetobaeillus casei, Laetobaeillus eellobiosus,Laetobaeillus eurvatus, Laetobaeillus delbruekii,Laetobaeillus fermentum, Laetobaeillus helvetieus,Laetobaeillus laetis, Laetobaeillus plantarum e misturas dasmesmas.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DNA da região doespaçador 16s-23s tendo mais de 94% de homologia com SEQ. ID N0-1, mais de 93% de homologia com SEQ. ID N0 2, ou mais de 98% dehomologia com SEQ. ID N0 3.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 46,caracterizada pelo fato de que a cepa de bactérias formadorasde ácido láctico apresenta uma seqüência de DNA da região doespaçador 16s-23s selecionada dentre SEQ. ID N0 1, SEQ. ID N0-2 ou SEQ. ID N0 3.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindoem Lactobacillus salivarius ss salícínius NCIMB 41287 (AHF-122A) , Lactobacillus animalis NCIMB 41288 (AHF 223C),Lactobacillus reuteri NCIMB 41289 (AHF 5119), mutações dasmesmas e misturas das mesmas.

49. Composição, de acordo com a reivindicação 48,caracterizada pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que o animal de estimação ê um gato.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de ser um alimento para animais deestimação.

52. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de ser um alimento para gatos.

53. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de ser um alimento úmido para animaisou um alimento seco para animais.

54. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionada dogrupo consistindo em rações, itens mascáveis e biscoitos.

55. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de ser um suplemento alimentar paraanimais de estimação.

56. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um molho.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um iogurte, umqueijo ou outro produto lácteo.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionada apartir do grupo consistindo em cápsulas, tabletes e pílulas.

59. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de compreender ao menos 0,001% debactérias formadoras de ácido láctico na faixa de cerca de 1,0E+04 ufc/g a cerca de 1,0E+12 ufc/g.

60. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras de ácidoláctico estão sob a forma de células viáveis.

61. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras de ácidoláctico estão sob a forma de células não-viáveis, ou de fraçõesconstituintes ativas das mesmas.

62. Método para redução do odor associado a fezes ouurina de um animal de estimação, caracterizado pelo fato decompreender a administração oral de bactérias formadoras deácido láctico do gênero Lactobacilli, obteníveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecadoe lavado.

63 . Método para redução do odor associado à caixa deareia de um animal de estimação, caracterizado pelo fato decompreender a administração oral de bactérias formadoras deácido láctico do gênero Lactobacilli, obteníveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecadoe lavado.