CZ300387B6

CZ300387B6 - Použití bakterií Lactobacillus

Info

Publication number: CZ300387B6
Application number: CZ20000023A
Authority: CZ
Inventors: Brassart@Dominique; Vey@Elisabeth
Original assignee: Societe Des Produits Nestle S. A.
Priority date: 1997-07-05
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2009-05-06
Also published as: DE69802413T3; NO322188B1; CA2294099C; RU2214258C2; HUP0003995A2; KR20010015563A; TR200000021T2; ES2168785T3; BR9810547A; DE69802413T2; HUP0003995A3; MY122501A; EP1003532A1; JP2002507997A; NO996214D0; ES2168785T5; AR013175A1; HK1029737A1; US20020127211A1; EP1003532B2

Abstract

Použití probiotických baktrerií Lactobacillus pri výrobe enterální nutricní smesi pro lécení nebo prevenci nedostatku vápníku, horcíku a/nebo zinku. Nutricní smes obsahující bakterie Lactobacillus se enterálne podává savci. Tato nutricní smes je vhodná pro lécení nebo prevenci u osob s nedostatkem minerálu nebo pro kompenzaci fyziologického nedostatku zpusobeného dietou chudou na minerály nebo pro uspokojení vetších fyziologických požadavku na minerály u mladých detí, tehotných žen, kojících žen a starších osob.

Description

(57) Anotace:

Použití probiotických baktrerií Lactobacillus při výrobě enterální nutriční směsi pro léčení nebo prevenci nedostatku vápníku, hořčíku a/nebo zinku. Nutriční směs obsahující bakterie Lactobacillus se enterálně podává savci. Tato nutriční směs je vhodná pro léčení nebo prevenci u osob s nedostatkem minerálů nebo pro kompenzaci fyziologického nedostatku způsobeného dietou chudou na minerály nebo pro uspokojení ' větších fyziologických požadavků na minerály u mladých dětí, těhotných žen, kojících žen a starších osob.

Použití bakterií Lactobacillus

Oblast techniky

Vynález se týká použití probiotických bakterií Lactobacillus při výrobě enterální nutriční směsi pro léčení nebo prevenci nedostatku vápníku, hořčíku a/nebo zinku.

Dosavadní stav techniky

Minerály jsou klíčové prvky v hlavních fyziologických procesech. Vápník má například životní důležitost pro tvorbu kostí a zubů, kontrakci svalů a syntézu hormonů. Vápník je také nezbytným sekundárním přenašečem u většiny jevů aktivace buněk.

Minerály, jejichž primárním zdrojem je dieta, jsou asimilovány tělem tak, že dojde k překročení střevní slizniee a potom průchodu do krevního řečiště. Stupeň asimilace (nebo absorpce) minerálů tělem závisí ve skutečnosti jak na jejich rozpustnosti ve střevním prostředí a na schopnosti střevních buněk asimilovat minerály, tak i na jejich přenosu do krevního řečiště (R. Wasserman a další, v Minerál Absorption in the Monogastric Gl Trac. Advances in Experimental Medicine and Biology, 249, 45 - 65, Plenům Press, N. Y., 1989).

Místo, účinnost a mechanismy absorpce vápníku podél celého střeva byly studovány mnoho let u krys a kuřat (BronnerF., J. Nutr., 122, 641 -643, 1992; Schachter D,, Am. J. PhysioL, 196,

357-362, 1959). Pro zřejmé etické a technické důvody byly u člověka tyto studie omezeny (Hylender E. a další, Scand. J. Gastroenterol., 25, 705, 1990) a bylo prováděno pouze velmi málo studií in vitro (Elsherydah A. a další, Gastroenteroíogy, 109, 876, 1995; Dehet J. J., Am. J. Physiol., 244, C303, 1983; Feher J. J., Cell Calcium, Π), 189, 1989).

Jedním z nejrozšířeněj i studovaných hledisek absorpce minerálů je biologická dostupnost minerálů v závislosti na složení denní diety (Bronner F., J. Nutr., 123, 797, 1993). Mnoho minerálů, které mají vysokou biologickou dostupnost, je však také nestabilních a tyto minerály jsou nevhodné v dietě. Navíc má pouhé doplnění diety větším množstvím minerálů často nepříznivý vliv na organoleptické vlastnosti diety.

Možné řešení tohoto problému je umožnit zlepšení absorpce minerálů z diety. Bylo však prováděno jen málo studií týkajících se způsobů umožnění zvýšení absorpce minerálů z diety a výsledky nebyly vždy v souladu.

Rasic a další uváděli, že minerály obsažené v mléčných výrobcích jsou lépe asimilovány, jestliže jsou tyto výrobky kvašené. Tento vliv se připisuje přítomnosti kyselin v kvašených (fermentovaných) mléčných výrobcích (XP002052238: Fermented Fresh Milk Product, díl 1, str. 114-115, 1978).

Před nedávném také Yaeshima a další ukázali zvýšení absorpce vápníku z diety syrovátky obohacené vápníkem u krys, jestliže se konzumuje kombinace otigosacharidů a bakterií Bifidobacteria (XP002052237: Bulletin of the International Dairy Fermentation, No. 313, 1996).

Kot a další však ukázali, že Lactobacillus acidophilus přirozeně přijímá Fe² a oxiduje ho na

Fe\ což je nerozpustná forma, která je obtížněji asimilovatelná (J. Agric. Food Chem., 43, 1276-1282, 1995).

Proto stále existuje potřeba nalézt způsoby umožnění zvýšení absorpce minerálů přítomných v dietě.

- 1 CZ 300387 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález tedy poskytuje použití probiotických bakterií Lactobacillus při výrobě enterální nutriční směsi pro léčení nebo prevenci nedostatku vápníku, hořčíku a/nebo zinku.

Na modelu in vitro bylo překvapivě zjištěno, že probíotické bakterie Lactobacillus jsou schopny přímo umožnit nebo zlepšit absorpci minerálů vápníku, hořčíku a/nebo zinku lidskými střevními buňkami. Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, předpokládá se, že tento jev je spojen s indukcí okyselení mikroprostředí v okolí střevních buněk a bakterií ve styku se střevními buňkami. Při navození okyselení se mohou účastnit jak bakterie, tak i střevní buňky. Toto místní okyselení může potom hrát důležitou úlohu při solubilizaci minerálů a tím i schopnosti těla tyto minerály asimilovat.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález použití bakterií Lactobacillus při výrobě enterálního nutričního prostředku pro umožnění absorpce nebo zlepšení absorpce minerálů u savce. Enterální nutriční prostředek může být použit pro léčení nebo prevenci stavů s nedostatkem minerálů.

Vynález se týká enterálního podávání výživného prostředku obsahujícího bakterie Lactobacillus pro umožnění nebo zlepšení absorpce minerálů přítomných v běžné denní dietě. Jako příklady minerálů je možno uvést vápník, hořčík, železo a/nebo zinek. Přijímání bakterií Lactobacillus zvyšuje biologickou dostupnost minerálů aje možno říci, že minerály, které často nejsou příliš rozpustné ve střevě, jsou snadněji dostupné střevním buňkám.

Může být použito jakéhokoliv potravinářského kmene bakterií Lactobacillus. Je například možno použít následujících kmenů Lactobacillus·. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorous, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri a Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, zvláště L. casei subsp. casei a L. casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus delbruckii, zvláště L. delbruckii subsp. lactis, L. delbruckii subsp. helveticus a L. delbruckii subsp. bulgaricus, a Lauconostoc mesenteroides, zvláště L. mesenteroides subsp. cremoris, například viz Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, díl 2, 1 086; Fujisawa a další, Int. Syst, Bact., 42, 487-^191, 1992.

Bakterie Lactobacillus mohou být schopny adheze na střevní buňky, ale této adheze nemusí být schopny. Výhodné jsou však takové bakterie Lactobacillus, které umožní s výhodou navázat alespoň 50 bakterií, zvláště alespoň 80 bakterií na 100 střevních buněk. Pro volbu takového adherentního typu bakterie může být kultura bakterií rozetřena na konfluentní kulturu imortalizované linie epiteliálních buněk střeva ((EP 0802257), potom se konfluentní kultura omyje a zjišťuje se počet bakterií navázaných na buňky.

Zvláště zajímavé jsou probíotické kmeny Lactobacillus. Některé kmeny jsou ve skutečnosti schopny adheze na lidské střevní buňky, odstraňování patogenních bakterií přítomných na lid45 ských střevních buňkách a působení na lidský imunitní systém tím, že umožňují silnější reakci na napadení zvnějšku (imunomodulační kapacita), například zvýšením schopnosti fagocytózy granulocytů odvozených z lidské krve (J. of Dairy Science, 78, 491-197, 1995; imunomodulační kapacita kmene LA-1; kteiý byl uložen firmou Nestec SA podle Budapešťské dohody vCollection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM), 25 rue docteur Roux, 75724 Paris, 30. června

1 992, pod depozitním číslem CNCM 1-1225). Tento kmen se popisuje v EP 0577904.

Je například možno použít probiotického kmene Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1225. Tento kmen byl nedávno jinak zatříděn mezí bakterie Lactobacillus johnsonii podle nové taxonomie navržené autory Fujisawa a další, což je nyní skupina směrodatná v oblasti taxonomie acidofíl55 nich laktobacilů (Int. J. Syst. Bact., 42, 487-791, 1992). Dostupné jsou také jiné probíotické

-2CZ 300387 B6 bakterie, jako například bakterie popisované v EP 0199535 (Gorbach a další), US 5 296 221 (Mitsuoka a další), US 556785 (Institut Pasteur) nebo US 5 591 428 (Probi AB).

Nutriční prostředky s výhodou obsahují dostatečné množství živých bakterií Lactobacillus pro umožnění absorpce minerálů střevními buňkami, například alespoň 10⁶cfu/ml, zvláště 10⁷10¹¹ cfu/ml, s výhodou 10 8 - 10 cfu/ml, kde cfu znamená počet životaschopných bakterií („colony forming unit“).

Nutriční prostředek může také obsahovat podle potřeby další bakterie; například další probiotické io bakterie.

Nutriční prostředek může také obsahovat vhodný zdroj proteinů; například zdroj živočišného nebo rostlinného proteinu. Vhodné zdroje proteinů jsou mléčné proteiny, sojové proteiny, rýžové proteiny, proteiny syrovátky, čirokové proteiny apod. Proteiny mohou být v neupravené nebo hydrolyzované formě.

Nutriční prostředek může také obsahovat vhodný zdroj uhlohydrátů; například sacharózu, fruktózu, glukózu, maltodextrin apod.

Nutriční prostředek může také obsahovat vhodný zdroj lipidů; například vhodný zdroj živočišného nebo rostlinného lipidu. Mezi vhodné zdroje lipidů patří mléčné tuky, slunečnicový olej, řepkový olej, olivový olej, světlicový olej apod.

Nutriční prostředek může být také obohacen minerály a vitaminy. Zvláště výhodné je obohacovat nutriční prostředek vápníkem.

Nutriční prostředky mohou být upraveny ve formě potravinářských směsí vhodných pro člověka nebo zvířata. Vhodné potravinářské prostředky mohou být ve formě kapalin, prášků a pevných látek. Nutriční prostředek může být fermentovaný pro získání dostatečného množství bakterií

Lactobacillus. Fermentované prostředky založené na mléce jsou tedy zvláště vhodné. Termín mléko se přitom netýká pouze živočišných druhů mléka, ale také látek běžně nazývaných rostlinná mléka, tedy extrakty upravených nebo neupravených rostlinných materiálů jako jsou luštěniny (sója, cizma, čočka apod.) nebo olejoviny (řepka, sója, sezam, bavlník apod.), kde tyto extrakty obsahují proteiny v roztoku nebo ve formě koloidní suspenze, která je chemicky koagulovatelná kyselou fermentaci a/nebo teplem. Je také možné ošetřovat tato rostlinná mléka teplem podobně jako živočišná mléka. Je také možné ošetření těchto mlék pro ně specifickými způsoby, jako je odbarvení, deodorace a ošetření pro potlačení nežádoucích chutí. Konečně slovo mléko také označuje směsi živočišných mlék a rostlinných mlék.

Je také možno do nutričního prostředku v průběhu jeho přípravy podle potřeby přidávat, do tohoto prostředku přimíchat nebo tento prostředek potahovat vhodným množstvím kultury bakterií Lactobacillus v kapalné, koncentrované suché nebo zapouzdřené formě.

Bylo zjištěno, že zapouzdření bakterií Lactobacillus do mikropouzder (mikroenkapsulace) má terapeutické výhody. Mikroenkapsulace za prvé podstatně zlepšuje přežívání bakterií Lactobacillus, a proto počet živých bakterií Lactobacillus, které se dostanou do střeva. Ještě důležitější je, že se bakterie Lactobacillus postupně uvolňují do střeva, což umožňuje prodloužené působení bakterií Lactobacillus na absorpci minerálů střevními buňkami,

Pro enkapsulací se s výhodou bakterie Lactobacillus lyofilizují nebo suší rozprašovacím způsobem (EP 0818529) a potom se přidají do gelu, který se například skládá ze ztužené mastné kyseliny, alginátu sodného, polymerované hydroxypropylmethylcelulózy nebo polymerovaného polyvinylpyrrolidonu. Pro uskutečňování tohoto způsobu se zařazuje odkazem spis FR 2 443 247.

-3CZ 300387 B6

Nutriční prostředky nemusí nutně obsahovat uhlohydráty nezbytné pro aktivní kvašení působením bakterií Lactobacillus ve střevním prostředí. Naopak, umožnění absorpce minerálů je nezávislé na fermentační aktivitě bakterií Lactobacillus, ale zdá se, že je spíše důsledkem přímého styku mezi bakteriemi Lactobacillus a střevními buňkami. Tato skutečnost indukuje podle před5 pokladů okyselení mikroprostředí a tím umožňuje lepší rozpouštění minerálů.

Může vsak být žádoucí umožnit obnovení rozmnožování bakterií Lactobacillus ve střevním prostředí, aby se prodloužil účinek usnadněné absorpce minerálů. To může být dosaženo přidáním vláken, která umožňují specifické rozmnožování bakterií Lactobacillus ve střevním prostředí, do nutričního prostředku. Tato vlákna jsou rozpustná a fermentovatelná.

Uvedená vlákna mohou být zvolena například z rostlinných pektinů, chito-, frukto-, gentio-, galakto-, isomalto-, manno- nebo xylooligosacharidů nebo oligosacharidů ze sóji, viz například Playne a další, Bulletin of the IDF 313, Group B42, Annual Session of Septemter 95, Vídeň.

Výhodné pektiny jsou polymery kyseliny a-l,4_D-galakturonové s molekulovou hmotností řádově 10 až 400 kDa, které mohou být vyčištěny z materiálů karotky nebo rajčat, jak se například uvádí v JP 60164432. Výhodné galaktooligosacharidy obsahují sacharidovou část, která se skládá z dvou až pěti opakujících se jednotek struktury [-a-EMjlu-(->4)-p-rM3al-( 1 -^-6)-] (Yakult Honsa Co., Japonsko). Výhodné fruktooligosacharidy jsou inulinoligofruktózy extrahované zčekanky, které mohou obsahovat například 1 až 9 opakujících se jednotek struktury [-βD-Fru-(l->2)-B-D-Fru-(l-»2)-] (WO 94/12541; Raffinerie Tirlemontoise S. A., Belgie), nebo oligosacharidy syntetizované ze sacharózových jednotek, které mohou například obsahovat sacharidovou část složenou z 2 až 9 opakujících se jednotek struktury [-a-D-Glu-( 1—>2)—β—E>—

Fru-(l->2)-] (Meiji Seika Kasiha Co., Japonsko). Výhodné maltooligosacharidy obsahují sacharidovou část složenou z 2 až 7 opakujících se jednotek struktury [-α-D—Gal-( 1 —>4)-] (Nihon Shokuhin Kako Co., Japonsko). Výhodné isomaltózy obsahují sacharidovou část složenou z 2 až 6 opakujících se jednotek struktury [-a-D-<jlu-(l-»6)-] (Showa Sangyo Co., Japonsko). Výhodné gentiooligosacharidy obsahují sacharidovou část složenou z 2 až 5 opakujících se jednotek struktury [-β-ΕΜ31υ-(1->6)-] (Nihon Shokuhin Kako Co,, Japonsko). Konečně, výhodné xylooligosacharidy obsahují sacharidovou část složenou například z 2 až 9 opakujících se jednotek struktury [-β-xy 1-(1 ->4}-] (Suntory Co., Japonsko).

Množství vláken v nutričním prostředku závisí na jejich schopnosti podporovat vývoj bakterií

Lactobacillus, Obecné pravidlo je, že nutriční prostředek může obsahovat od 1 do 50 % hmotnostních těchto vláken, vztaženo na sušinu. Koncentrace bakterií Lactobacillus může být alespoň 10³ cfu bakterií Lactobacillus na gram vláken, s výhodou 10⁴ až 10⁷ cfu/g vláken.

Další výhodou vláken je to, že zpomalují průchod střevem. Tak je tomu zvláště v případě velkého množství vláken, tj. řádově 20 až 50 % hmotnostních z prostředku. Bakterie Lactobacillus se postupně odstraňují působením střevní pasáže a tímto opatřením se umožní prodloužení prospěšného působení bakterií Lactobacillus na absorpci minerálů střevem.

Nutriční prostředky mohou být ve formě jakékoli enterálně podávané potraviny. Například nutriční prostředek může být ve formě kvašeného mléka (EP 0577904), dětské výživy (EP 0827697), nezrajících sýrů (PCT/EP 97/06947), zrajících sýrů, zmrzliny (WO 98/09535), oplatky plněné zmrzlinou (EP 704164; EP 666031), suchého salámu a/nebo paštiky (EP 689769).

Nutriční prostředky mohou být také ve vhodné formě pro lidi, kteří netolerují mléčné výrobky.

Tyto nutriční prostředky nebudou obsahovat alergenní mléčné deriváty. Například pro děti alergické na proteiny mléka může být nutriční prostředek sestaven tak, aby obsahoval hypoalergenní mléčné deriváty. Tyto mléčné deriváty mohou být v souladu s evropskou direktivou 94/4/EC, která uvádí, že v hypoalergenním mléku by měly být alergenní proteiny imunologicky detekovatelné v alespoň stokrát menší míře než je tomu u nehydrolyzováného mléka (OíT. J. Europ.

-4CZ 300387 B6

Comm,, NoL49/12, dodatek bod 5,a, 1996; Fritsché a další, Int. Arch. Aller. and Appl. Imm., 93, 289-293, 1990).

Nutriční prostředky jsou zvláště vhodné pro léčení nebo prevenci u lidí s nedostatkem minerálů 5 nebo pro kompenzaci fyziologických nedostatků způsobených dietou chudou na minerály nebo pro uspokojení hlavních fyziologických požadavků na minerály u dětí, těhotných žen, kojících žen a starých osob.

io Přehled obrázků na výkresech

Provedení vynálezu se popisují na příkladech, ve kterých jsou odkazy na následující obrázky:

Obr. 1 znázorňuje bazální absorpci vápníku střevními buňkami Caco-2 v nepřítomnosti bakterií 15 Lactobacillus·, obr. 2 ukazuje vliv koncentrace přibližně 6,7 x 10⁷ cfu/ml různých kmenů bakterií Lactobacillus na absorpci vápníku střevními buňkami Caco-2;

obr. 3 ukazuje vliv koncentrace přibližně 3,4 x 10⁸ cfu/ml různých kmenů bakterií Lactobacillus na absorpci vápníku střevními buňkami Caco-2.

Vynález je nyní podrobněji popisován na konkrétních příkladech. Uvedená procenta jsou hmotnostní, pokud není uvedeno jinak. Tyto příklady jsou pouze pro ilustraci a nemají vynález omezo25 vat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

- Materiály: ⁴⁵CaCl₂ je od firmy Amersham, barvivo Lucifer Yellow od firmy Sigma, kolagen I od firmy Centrix Pharmaceuticals, PBS, HEPES a složky média pro kultivaci buněk od firmy

Gibco a nosiče pro kultivaci od firmy Falcon.

- Buněčná kultura: Lidská buněčná linie Caco-2 je izolována z adenokarcinomu tlustého střeva a je získána z American Type Culture Collection (pasáž 41). Buňkami jsou založeny kultury v množství 4 x IO⁴ buněk/cm² v DMEM s obsahem 4,5 g/l glukózy, 20 % hmotnostních teplem inaktivovaného fetálního telecího séra, 1 mg/ml fungizonu, 100 U/ml směsi penicilin/streptomycin, 200 μ g/ml gentamycinu a 1 % hmotnostní neesenciálních aminokyselin. Buňky se obvyklým způsobem trypsinizují a opět umístí v kultuře 1:20. Buňky použité při experimentech s transportem vápníku se umístí do kultury 1 x 10⁵ buněk/cm² v permeabilních částicích, které byly předem potaženy vrstvou kolagenu I s koncentrací 50 pg/ml. Ve všech případech se buňky pěstují při koncentraci 10 % CO₂/90 % vzduchu v inkubátoru při 37 °C a médium se vyměňuje každé dva dny.

- Životaschopnost buněk Caco-2: Pro vyloučení možnosti, že zesílení absorpce vápníku střevními buňkami v přítomností bakterií Lactobacillus je způsobeno poškozením buněk, část každého so vzorku pro měření vápníku byla použita pro test na hexosaminidázovou aktivitu (Landegren a další, J. Immunol. Method, 67, 379-378, 1984). Tento kolorimetrický test umožňuje kvantifikovat lyžování a/nebo smrt buněk měřením hexosaminidázové aktivity, která se uvolní do supematantu zcytosolu poškozených buněk. Výsledky ukazují, že ve všech experimentech je hexosaminidázová aktivita v přítomnosti bakterií Lactobacillus ekvivalentní.

-5CZ 300387 B6

- Permeabilita vrstvy buněk: integrita vrstvy vytvořené buňkami Caco-2 na konci jejich růstu a diferenciace se vyhodnocuje měřením transepiteliálního elektrického odporu (TEER) s použitím voltmetru/ohmmetru Millicell—ERS. Experimenty s absorpcí vápníku se provádějí, když tento odpor dosáhne alespoň 700 Ω x cm². Permeabilita vrstvy buněk v průběhu experimentů s absorpcí vápníku se vyhodnocuje měřením míry difúze (v procentech) barviva Lucifer Yellow, tedy molekuly, která neprostupuje buněčnou membránou.

- Transport vápníku: Buňky Caco-2 se kultivují na inzertech 3 až 5 týdnů. V den experimentu se vrstva buněk dvakrát promyje PBS a potom se do spodní části inzertu obsahující serosu (basolaterální pól buněk) přidá 2,5 ml nosného pufru (140 mm NaCI, 5,8 mm KC1), 0,34 mm NaH₂PO₄, 0,44 mm KH₂PO₄, 0,8 mm MgSO₄, 20 mm HEPES, 4 mm glutaminu, 25 mm glukózy, pH 7,4) doplněného 2,5 mm CaCl₂, zatímco do vrchní části inzertu obsahující intestinální lumen (apikální pól buněk) se přidá 1,5 ml nosného pufru doplněného 10 mm CaCl₂ a stopovým množstvím *⁵CaCl₂ a barviva Lucifer Yellow. Inzerty se potom umístí do inkubátoru při 37 °C a 50 μΐ vzorku v spodní a horní části se odebírají v pravidelných intervalech.

Radioaktivita obsažená v těchto vzorcích se vyhodnocuje počítáním impulzů kapalnou sci n ti lácí a umožňuje extrapolovat množství absorbovaného neznačeného CaCl₂. Bazální transport vápníku se vyjádří jako nmol vápníku transportovaný do spodního oddělení inzertu. Difúze barviva Lucifer yellow detekovaná spektrofluorometricky ve spodní části se vyjádří v procentech množství přidaného do horní části.

-Vliv bakterií Laetobaeillus: Kmeny Laetobaeillus johnsonii Lal (CNCM 1-1225), Lal7, La22, La31; Laetobaeillus acidophillus LalO, Lal8, La31; Laetobaeillus bulgaricus Lfí5, YL8; Laetobaeillus paracasei ST11; Laetobaeillus gasseri LGA7; Laetobaeillus reuteri LR7 a Streptococcus thermophihts Sfi20, YS4 (sbírka Nestec collection, Lausanne, Švýcarsko) se kultivují za anaerobních podmínek v médiu MRS pro Laetobaeillus nebo Ml7 pro Streptococcus dvakrát 24 h, promyjí PBS a před přidáním do horní části inzertů se resuspendují v nosném pufru. Poměr Caco-2 : bakterie je potom 1:100 podle testů (6,7 x 10⁷ nebo 3,4 x 10⁸ cfu/ml v horní části inzertů pro testy uvedené v obr. 2 a 3). Absorpce vápníku se vyhodnocuje podle výše uvedeného protokolu.

- Výsledky bazálního transportu vápníku: V inzertech byl vytvořen gradient vápníku přidáním

2,5 mm CaCl₂ do spodní části, což odpovídá normální koncentraci v lidské plazmě, a zvolené koncentraci 10 mm CaCl₂ v horní části, která odpovídá obsahu vápníku v potravinách. Jak je ukázáno výsledky reprezentativního experimentu na obr. 1, bazální absorpce vápníku buňkami Caco-2 s časem stoupá až do dosažení 600 nmol/inzert obsahující přibližně 3 x 10⁶ buněk po 4 h. Jako kontrola integrity vrstvy buněk v průběhu experimentu se provádělo měření difúze barviva Lucifer yellow, přičemž se ukázalo, že tato difúze je menší než 2 %.

- Měření vlivu bakterií Laetobaeillus: V obr, 2 a 3 je ukázáno, že absorpce vápníku buňkami Caco-2 významně stoupá v přítomnosti adherentních kmenů Laetobaeillus johnsonii kmeny Lal a La22, v přítomností neadherentních kmenů LalO a Lal8 Laetobaeillus acidophilus, a v přítomnosti kmenů L. paracasei (STÍ 1), L. gasseri (LGA7) a L. reuterii (LR7).

Schopnost adherence bakterií na střevní buňky proto patrně přímo nekoreluje s jejich schopností zvyšovat absorpci vápníku stejnými buňkami. (J všech těchto experimentů je modulována difúze barviva Lucifer yellow podobným způsobem, ale zůstává zanedbatelná.

Pokles pH v horní části inzertů je pozorován i v případě, kdy jsou buňky Caco-2 v přítomnosti bakterií Laetobaeillus, bez ohledu na použitý kmen, kromě kmenu Sfi20 (tabulka 1). Proto není žádná korelace mezi zvýšením absorpce vápníku a tímto poklesem pH. Některé bakteriální kmeny schopné zvyšovat absorpci vápníku však nejsou schopné okyselovat v nepřítomnosti buněk Caco—2 experimentální prostředí. To znamená, že acidifikace v přítomnosti buněk Caco-2

-6CZ 300387 B6 a bakterií vyžaduje spolupráci mezi dvěma typy organismů a mohla by být způsobena buňkami Caco-2.

Tabulka 1

Vliv bakterií Lactobacillus na pH experimentálního prostředí v nepřítomnosti nebo v přítomnosti buněk Caco-2

Bakterie	Počet testů	pH bez Caco-2	pH s Caco-2
žádné	4	7 +/-0	7+/-0
La1	3	6,75 +/- 0,3	3,75 +/- 0,3
La10	3	4,65 +/- 0,3	4,15 +/- 0,3
La17	2	7 +/-0	3,5 +/- 0,7
La18	2	7 +/- 0	3,5 +/- 0,5
La22	2	7 +/- 0	3,25 +/-0,35
La29	2	4,25 +/-0,35	3,5 +/- 0
La31	2	7+/-0	3,75 +/- 0,35
Sfí20	1	7	7
YS4	1	5	4
Lfi5	1	4	3
YL8	1	4	3

Příklad 2

V tomto příkladu byl prováděn podobný test jako v příkladu 1 pro zjištění vlivu bakterií Lactobacillus na absorpci vápníku střevními buňkami v přítomnosti značeného inu linu (³H-Ínulin, Amersham; tracer prebiotic fibre). Výsledky potvrzují, že bakterie Lactobacillus zvyšují in vitro absorpci minerálů střevními buňkami.

Příklad 3

V tomto příkladu byl prováděn podobný test jako v příkladu 1 pro zjištění vlivu bakterií Lactoba25 cillus na absorpci hořčíku, železa a zinku střevními buňkami. Výsledky potvrzují, že bakterie

Lactobacillus zvyšují in vitro absorpci minerálů střevními buňkami.

-7CZ 300387 B6

Příklad 4

Enkapsulace bakterií mléčného kvašení

V tanku o objemu 100 I bylo připraveno 80 1 kultivačního média s následujícím složením v procentech hmotnostních:

Kvasntčný extrakt	0,25 %
T ryptikáza	1,00%
Fyton	0,50 %
Glukóza	1,50 %
L-cystein . HCI	0,05 %
K₂HPO₄	0,25 %
ZnSO₄	0,025 %
FeCI₃	stopy
Voda	do 100 %

io Zaočkování bylo provedeno s 1 1 kultury pěstované 20 h bakterií Lactobacillus johnsonii Lal (CNCM 1-1225). Médium se ínkubuje 12 h při 30 ^ŮC. Kultivační půda se centrifuguje a získá se 240 g buněk. Buňky se zředí 250 ml odstředěného mléka doplněného 7 % laktózy. Směs se zmrazí v kapalném dusíku. Lyofilizace se provádí při 40 °C přes noc. Připraví se 5 % disperze získaného prášku v hydrogenovaném rostlinném tuku s teplotou tání 42 °C zkapalněném při 45 °C.

Disperze se nastřikuje při 45 °C pod tlakem 0,4 MPa současně s kapalným dusíkem v množství 1 díl disperze na 5 dílů dusíku do horní části svislého válce o průměru 1,5 m a výšce 10 m. Válec je ve spodní části opatřen nádobou obsahující kapalný dusík, ve které se shromažďují mikrokuličky obsahující bakterie, jejichž průměr kolísá mezi 0,1 a 0,5 mm. MikrokuliČky se potom převedou do fluidního lože a na kuličky se rozstřikuje alkoholický roztok obsahující 8 % zein v tako20 vém množství, že se kolem kuliček vytvoří vrstva zeinu, která představuje 5 % hmotnosti mikrokuliček.

MikrokuliČky se potom přidávají do potravinářské směsi, která má umožnit absorpci minerálů střevními buňkami.

Příklad 5

Připraví se koncentrovaný základ zmrzliny mícháním přibližně 11 % hmotnostních mléčného tuku, 8,8 % hmotnostních mléčné sušiny (sušina neobsahující tuk), 25 % hmotnostních sacharózy, 5 % hmotnostních glukózového sirupu a 0,6 % hmotnostních stabilizátoru Emulstab®SE30 při 60 až 65 °C po dobu 20 min. Tento základ se homogenizuje při 72 až 75 °C a tlaku 21 MPa (2 stupně při 21/5 MPa), pasteruje se při 85 °C 22 s (pasterační zařízení AVP pasterizeur, Francie, Evreux, 400 l/h), ochladí se na 4 °C a do směsi se přidá 40 % mléka okyseleného bakte35 riemi Lactobacillus johnsonii La-1 (5 x 10⁸ cfu/ml) a bakteriemi Bifidobacterium longum Bil6 (3 x 10* cfu/ml). Směs tohoto koncentrovaného základu je uvedena v následující tabulce.

-8CZ 300387 B6

Složky	Složení (kg)	Obsah tuku (%)	Sušina bez tuku (%)	Sacharóza (%)	Suchý extrakt (%)
Smetana (35 %)	31,43	11,00	1,57		12,57
Práškové odstředěné mléko	7,60		7,30		7,30
Sacharóza	36,77			25,00	25,00
Glukózový sirup	5,27				5,00
Emulstab®SE30	0,67				0,63
Voda	18,26
Celkem: krémový základ	100,00	11,00	8,87	25,00	50,50
Krémový základ (60%)	60,00	6,60	5,32	15,00	30,30
Okyselené mléko (40 %)	40,00	1,40	4,68	-	6,08
Celkem: krémový základ + okyselené mléko	100,00	8,00	10,00	15,00	36,38

Po zrání krému 12 h při 5 °C se zmrazí na přírůstek objemu 95 % objemových (Crepaco freezer, 5 Francie, Evreux; 160 1 produktu/hod).

Připraví se těsto na oplatky obsahující 10% fruktooligosacharidu Raftilose®L30 (Raffínerie

Tirlemontoise S. A., BE), podle receptu uvedeného v následující tabulce. Po upečení se oplatka běžným způsobem tvaruje do kornoutu. Po ochlazení se vnitrní povrch kornoutů stříkáním potáhlo ne filmem tuku a potom se kornouty plní našlehaným zmrzlinovým krémem popsaným výše.

Na 11,5 g oplatky kornoutu se použije 130 ml našlehaného zmrzlinového krému (přibližně 65 g) a 5 g čokolády (nastříkaná na krém).

-9CZ 300387 B6

Složka	Hmotnost (g)	Dodavatel
Běžná pšeničná mouka 55	52
Škrob	0,2
Fruktooligosacharid	10	Rafii nerie Tirlemontoise
Raftiiose®L30		S. A., BE
Cukr	27,8
Tuk	8
Emulgátor	1,5
Sůl	0,5
Celkem: receptura oplatky	100

Tímto způsobem se dosáhne přítomnosti 1,1 g vláken a přibližně 10⁸ cfii/g bakterií Lactobacillus na kornout zmrzliny. Vlákna tak podporují asimilaci minerálů tím, že podporují specifický vývoj bakterií Lactobacillus ve střevním traktu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití probiotických bakterií Lactobacillus při výrobě enterální nutriční směsi pro léčení nebo prevenci nedostatku vápníku, hořčíku a/nebo zinku.
2. Použití podle nároku 1, kde bakteriemi Lactobacillus jsou bakterie Lactobacillus schopné adherence na střevní buňky.
3. Použití podle nároku 2, kde bakteriemi Lactobacillus je kmen Lactobacillus johnsonii CNCM 1-1225.
4. Použití podle nároku 1, kde enterální nutriční směs obsahuje 10⁷ až 10” cfu bakterií Lactobacillus.
5. Použití podle nároku 1, kde enterální nutriční směs obsahuje mléčné bílkoviny.
6. Použití podle nároku 5, kde enterální nutriční směsí je směs určená pro dětskou výživu, obsahující hypoalergenní hydrolyzáty mléčných bílkovin.
7. Použití podle nároku 1, kde enterální nutriční směs navíc obsahuje prebiotická vlákna.