CN110893195A - 一种具有缓解肠道炎症功能的副干酪乳杆菌et-22 - Google Patents
一种具有缓解肠道炎症功能的副干酪乳杆菌et-22 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有缓解肠道炎症功能的副干酪乳杆菌ET‑22。本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET‑22菌株在制备用于预防和/或治疗肠道炎症的组合物中的用途。本发明提供的副干酪乳杆菌ET‑22菌株能够显著抑制炎症因子IL‑6和TNF‑α和提高抑炎因子IL‑10产生,具备缓解肠道炎症的作用。本发明提供的副干酪乳杆菌ET‑22菌株能够用于制备预防和/或治疗肠道炎症的食品、保健品和药品,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品领域。具体而言,本发明涉及一种副干酪乳杆菌和含有所述副干酪乳杆菌的组合物及其用途。本发明的副干酪乳杆菌益生菌可以缓解肠道炎症。
背景技术
随着环境因素、饮食、生活习惯等对肠道菌群微环境的影响,肠炎的发病率也逐年上升,肠炎已经成为影响全球人类健康的重要疾病之一。目前已有大量研究表明,肠道细胞的氧化损伤,粘膜受损、感染肠道上皮细胞、释放毒素等有害物质、致使肠道上皮细胞损伤死亡,肠道上皮通透性增强、致病菌等透过损伤的肠道粘膜屏障、进入组织内部,引发系列的免疫应答,导致巨噬细胞产生大量的细胞因子,过度刺激T细胞,产生促炎因子,使上皮细胞发生炎症反应。
肠炎传统的治疗方法可分为现代医学治疗和中药治疗方法。随着科学技术的发展,通过体外补充益生菌的也成为了降低肠道炎症的重要方法。益生菌作为肠道内源性和免疫性防御屏障,能够拮抗致病菌,具有安全、可控、有效、副作用小的特点,是治疗肠炎的理想方法。益生菌可通过竞争营养性物质、竞争共同受体抑制致病菌定殖、或者通过产生细菌素直接抑制致病菌,也可以通过产生抗毒素蛋白酶等隔绝致病菌及其毒素。益生菌可以通过维持肠道正常菌群,加强粘膜屏障作用,抑制炎症信号的暴露免疫系统对失衡的免疫应答进行调整,抑制宿主粘膜损伤。此外,世界肠胃组织(WGO)全球指南中已指出将益生菌制剂作为炎症性肠病药物。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本申请提供了一种副干酪乳杆菌及其用途。本菌株单菌即具有抑制炎症因子(例如IL-6、TNF-α),促进抑炎因子(例如IL-10)产生,降低肠道的炎性损伤。
在一些实施方案中,本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株,保藏编号CGMCC No.15077,保藏于中国典型培养物保藏中心以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在一些实施方案中,本发明提供一种培养物,其包所述的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株。在一些实施方案中,所述培养物还可以包括适当的乳酸菌培养基,包括固体培养基和液体培养基,例如MRS培养基。在一些实施方案中,所述培养物包括副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株的冷冻干燥培养物。
在一些实施方案中,本发明提供一种含乳酸菌菌株的组合物,其包含:
副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株,保藏于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC No.15077;以及赋形剂、稀释剂和/或载体,其中所述组合物为食品组合物、药物组合物或保健品组合物。
在一些实施方案中,所述组合物为用于预防和/或治疗肠炎(包括例如缓解肠道炎症)的组合物。
在一些实施方案中,所述组合物可以为适合使用的任何组合物形式,例如可以为食品(包括饮料)组合物、药物组合物或保健品组合物。在一些实施方案中,所述食品组合物、药物组合物或保健品组合物为口服组合物,例如用于预防和/或治疗肠炎(包括例如缓解肠道炎症)的食品组合物、药物组合物或保健品组合物。在一些实施方案中,含有本发明乳酸菌菌株的组合物具有预防和/或治疗肠炎(包括例如缓解肠道炎症)的作用,且以食品、保健品或药物组合物的形式存在。
在一些实施方案中,所述组合物可以为食品组合物,并且所述食品没有特别限制,可以为任何适当食品,包括例如乳制品、脂肪制品、饮料(冷饮、酒精饮料、碳酸饮料、乳饮料、果汁饮料、茶、咖啡、营养饮料等)、调味品、水果、蔬菜、豆类、食用菌、藻类、坚果、可可制品、糖果、粮食制品、焙烤食品、肉制品、水产品、和蛋制品等。
在一些实施方案中,所述组合物可以为药物组合物,包括例如用于预防和/或治疗肠道炎症(包括例如缓解肠道炎症)的组合物。
在一些实施方案中,所述组合物可以为保健品组合物,包括例如特定保健功能组合物、营养功能组合物、功能标识组合物、和浓缩营养品组合物。
在一些实施方案中,特定保健功能组合物是含有影响生理功能成分的组合物,可以适用于特定保健用途进行标识。营养功能组合物是指用于补充营养成分的组合物,其可以标识营养成分。功能标识组合物是标识了具有科学依据的相关功能性的组合物。
在一些实施方案中,本发明的组合物可以制备为非药物(如食品、保健品)或药物。在一些实施方案中,本发明的组合物包括任何适当剂型的药物。例如,适用于悬浮剂、乳胶剂、糖浆剂等口服剂型。
本实施方式的药物组合物中,可以自由选择含有一种或两种以上赋形剂、稀释剂和/或载体,包括例如药学上可接受的添加剂等。在一些实施方案中,赋形剂、稀释剂和/或载体包括例如乳化剂、着色剂、调味剂、香料、稳定剂、增溶剂、悬浮剂等。
在一些实施方案中,该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。在本文中,益生菌可以指使用活的微生物,其能够添加到组合物如食品(如牛奶、乳酪)、药品(如胶囊、片剂、丸剂、粉剂等)等中,保持活性并且对摄取含有所述益生菌的组合物的对象发挥其生理学作用。在一些实施方案中,本发明的菌株可以作为益生菌添加到组合物中。
在一些实施方案中,本发明提供副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株用于制备组合物的用途,所述组合物用于预防和/或治疗肠道炎症(包括例如缓解肠道炎症)。在一些实施方案中,所述组合物为食品组合物、药物组合物或保健品组合物。在一些实施方案中,所述组合物为口服组合物。
在一些实施方案中,所述组合物含乳酸菌菌株的数量没有特别限制,只要其能够发挥相应调节功能即可。在一些实施方案中,所述乳酸菌菌株数量可以为102CFU以上,例如103CFU以上,104CFU以上,105CFU以上,106CFU以上,107CFU以上,108CFU以上,109CFU以上,1010以上,1011CFU以上,或更高。
在一些实施方案中,已经发现副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株与不含所述菌株的对照相比具有预防和/或治疗肠道炎症(包括例如缓解肠道炎症)的作用。在一些实施方案中,副干酪乳酸杆菌ET-22菌株与不含所述菌株的对照(或含有其他菌株的对照)相比能够促进抑炎因子(例如IL-10)产生(例如提高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多倍)和/或抑制炎症因子(例如IL-6和/或TNF-α)产生(例如抑制10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多),和/或降低肠炎组织损伤作用(例如降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)。在一些实施方案中,副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株可以制备用于预防和/或治疗肠道炎症(包括例如缓解肠道炎症)的组合物和/或试剂盒。在一些实施方案中,所述预防和/或治疗肠道炎症的组合物和/或试剂盒还可以包括其它适当的预防和/或治疗肠道炎症(包括例如缓解肠道炎症)的物质。
在一些实施方案中,本发明提供制备组合物如食品组合物、药物组合物或保健品组合物的方法,所述方法包括将副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株加入到组合物中。
在一些实施方案中,本申请提供以下项目描述的发明,但不限于此。
1.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于预防和/或治疗肠道炎症的组合物中的用途。
2.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于降低炎症因子的组合物中的用途。
3.项目2所述的用途,其中所述炎症因子包括IL-6和TNF-α中的至少一种。
4.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于促进抑炎因子的组合物中的用途。
5.项目4所述的用途,其中所述抑炎因子包括IL-10。
6.项目1-5任一项所述的用途,其中所述组合物为食品组合物、药物组合物或保健品组合物。
7.项目6所述的用途,其中所述组合物为食品组合物,包括例如乳制品、脂肪制品、饮料、水果、蔬菜、豆类、食用菌、藻类、坚果、可可制品、糖果、粮食制品、焙烤食品、肉制品、水产品、调味品、和蛋制品等。
8.项目6所述的用途,其中所述组合物为药物组合物,所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。
9.项目6所述的用途,其中所述组合物为保健品组合物,包括例如特定保健功能组合物、营养功能组合物、功能标识组合物、和浓缩营养品组合物。
10.项目1-9任一项所述的用途,其中所述组合物含乳酸菌菌株的数量为102CFU以上,例如103CFU以上,104CFU以上,105CFU以上,106CFU以上,107CFU以上,108CFU以上,109CFU以上,1010以上,1011CFU以上。
本发明提供的菌株可以用于治疗和预防肠道炎症,包括例如缓解肠道炎症,具体包括例如:
(1)促进抑炎因子(例如IL-10)产生;
(2)抑制炎症因子(例如IL-6和/或TNF-α)产生;和/或
(3)降低肠炎组织损伤作用。
附图说明
图1显示了副干酪乳杆菌ET-22对小鼠肠道IL-6的影响,其中分别显示了对照组,模型组,ET-22实验组1(1x 107),ET-22实验组2(1x 108),和ET-22实验组3(1x 109)的影响。
图2显示了副干酪乳杆菌ET-22对小鼠肠道IL-10的影响,其中分别显示了对照组,模型组,ET-22实验组1(1x 107),ET-22实验组2(1x 108),和ET-22实验组3(1x 109)的影响。
图3显示了副干酪乳杆菌ET-22对小鼠肠道TNF-α的影响,其中分别显示了对照组,模型组,ET-22实验组1(1x 107),ET-22实验组2(1x 108),和ET-22实验组3(1x 109)的影响。
图4显示了病理组织切片,其中分别显示了对照组,模型组,ET-22实验组1(1x107),ET-22实验组2(1x 108),和ET-22实验组3(1x 109)的病理组织切片。
图5显示了组织损伤评分,其中分别显示了模型组,ET-22实验组1(1x 107),ET-22实验组2(1x 108),和ET-22实验组3(1x 109)的组织损伤评分。
【生物材料保藏】
本发明的副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株保藏于:
中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏日期为2017年12月18日、保藏编号CGMCC No.15077;该保藏单位的地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
除非另外专门定义,本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
本发明所述的乳酸菌菌株的冷冻干燥培养物已保藏于中国典型培养物保藏中心以及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏的详细资料如下表所示:
乳酸菌菌株的保藏资料
菌株名 | 分类 | 保藏编号 | 保藏日期 |
ET-22 | 副干酪乳酸杆菌 | CGMCC 15077 | 2017年12月18日 |
乳酸菌菌株的形态学以及一般性质
根据16S rDNA序列分析以及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。上述菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于下表:
乳酸菌菌株的形态学及一般性质特征
本菌株的发酵条件为:
MRS液体培养基:蛋白胨,10.0g;牛肉膏,10.0g;酵母浸粉,5.0g;葡萄糖,20.0g;磷酸氢二钾,5.0g;柠檬酸氢二铵,2.0g;乙酸钠,5.0g;七水合硫酸镁,0.5g;四水合硫酸锰,0.2g;吐温80,1.0g;琼脂15.0g;蒸馏水1000mL。调整pH至6.2~6.4之间,121℃灭菌15分钟。
L.paracasei ET-22为微好氧菌,兼性厌氧环境生长较佳,产乳酸,具有耐酸性,可耐受pH值2.5的酸性环境及耐0.4%的胆盐环境4小时,嗜中温菌,生长温度范围在15~45℃,最适生长温度在37℃左右。
实施例
1试验材料
健康BABL/c雄性小鼠,购自北京华阜康生物科技有限责任公司。饲养于中国疾病预防控制中心动物房,维持室温(25±2℃),相对湿度(55±2)%,12h/12h昼夜交替光照,自由进食和饮水。
2.实验方法:
2.1动物分组及处理
健康BABL/c雄性小鼠70只,鼠龄6~8周,体重20~22g,依据体重,利用随机数字,分为5组,每组14只。每组分两笼饲养,每笼7只,使用苦味酸编号,普通饲料适应性喂养5天。具体分组及样品量见表1。以灌胃方式干预小鼠,灌胃体积为0.4ml/20g。干预周期为14天。
表1实验分组
5组小鼠,除对照组外,其余4组需要进行DSS诱导的实验性结肠炎模型的建立。在实验过程第8天,配制5.0%的DSS水溶液替代饮水,自由饮用7天,正常组饮用蒸馏水。每日观察小鼠体征变化。
2.2结肠长度及重量测定
干预结束后,小鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,离心分离血清。分离小鼠结肠,以PBS冲洗多次后,测量长度,剪切2/3存于离心管中,-80℃保存。1/3储存于10%福尔马林溶液中固定备用。
2.3结肠组织病理学观察及评分
结肠放入福尔马林溶液固定后,依次经过脱水、浸蜡、包埋、切片、捞片和烤片,脱蜡复水,HE染色,最后显微镜观察组织形态学。
采用Fedorak组织学积分标准进行组织学评分。组织学伤损评分标准如下表所示。
表2组织学损伤评分标准
2.4血清中细胞因子测定
按照ELISA试剂盒(ThermoFisher,Rat ELISA Kit)说明书对小鼠结肠中细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α含量进行测定。
2.5统计分析方法
实验数据表示为Mean±S.E.M.数据采用PRISM version 5.0(GraphPad,SanDiego,CA,USA)进行统计。组间差异采用one-way ANOVA跟随Tukery’s multiplecomparison test的方法进行统计。P<0.05时具有显著的统计学差异。
3.实验结果与分析
3.1小鼠体重变化
对小鼠0天、7天、14天体重进行统计,结果如下表。
表3小鼠体重变化
注:*与对照组比较,差异具有显著性。
0天时,小鼠体重组间比较无显著性差异(p<0.05);表明实验开始时小鼠状态一致,可排除小鼠体重不同造成的实验差异。给予样品7天后,各组小鼠体重均增加,组间比较无显著性差异(p<0.05),表明短时间样品干预对小鼠的体重增长无影响。5%DSS代替饮水7天后,模型组小鼠体重均显著降低(p<0.05),而对照组体重无显著性变化(p>0.05),同时参考小鼠状态观察结果,表示模型组造模成功。造模后,模型组和各干预组小鼠体重均显著降低,表明虽然经样品干预,但在DSS造成肠道损伤的前提下,小鼠体重依然减少。造模后,各干预组小鼠体重显著低于对照组(p<0.05),与模型组比较无显著性差异(p>0.05)。表明样品对于经DSS造模小鼠体重的干预作用有限。
3.2DSS诱导小鼠结肠炎症特征观察
0-7天,各组小鼠毛色光滑,精神活跃,反应灵活,正常进食,无腹泻及血便,大便呈球形或条形;经过7天造模,模型组与干预组小鼠均经过5.0%的DSS诱导形成了实验性结肠炎模型。分别观察个实验组小鼠在造模其的体征变化,结果如下:
表4小鼠体征观察
小鼠肠道炎症症状观察结果表明,各样品对DSS造模小鼠的干预作用表现在以下几个方面:(1)实验结束小鼠血便只数减少;(2)小鼠出现血便的时间与模型组比较推迟1~2天。因此次造模以5%DSS代替饮水,可能因为小鼠对DSS的摄入量与耐受程度不同,小鼠的死亡未随着剂量而变化。
3.3各组小鼠脾脏重量
与对照组比较,模型组小鼠脾脏指数均显著高于对照组(p<0.05),表明5%DSS可刺激小鼠脾脏淋巴细胞和巨噬细胞的增殖,刺激机体发挥细胞免疫和体液免疫的作用。ET-22实验组在脾脏指数上具有降低的趋势,表明ET-22实验组具有减少机体炎性反应的功能。
表5小鼠脾脏重量/指数
注:*与对照组比较,差异具有显著性。
3.4检测指标
3.4.1小鼠结肠长度检测结果
小鼠结肠长度结果如表6所示,造模后,模型组小鼠结肠长度显著低于对照组(p<0.05),;样品干预后,各组小鼠结肠长度与模型组比较无显著性差异(p>0.05),说明本实验中对小鼠结肠长度其主要作用的为5%DSS,样品短期干预对小鼠结肠长度无显著影响。
表6小鼠结肠长度测量结果
注:*与对照组比较,差异具有显著性
3.4.2结肠IL-6检测结果
结肠IL-6变化结果如图1所示,与对照组比较,模型组小鼠结肠IL-6显著高于对照组(p<0.05),表明小鼠DSS干预可以起小鼠肠道炎症反应的增加,表现为炎性因子IL-6的增高。与模型组比较,ET-22实验组1、ET-22实验组2小鼠结肠IL-6低于模型组,其中,ET-22实验组2降低幅度具有显著性(p<0.05)。表明ET-22可减少小鼠肠道炎症反应,表现为炎性因子IL-6的减少。
3.4.3结肠IL-10检测结果
结肠IL-10变化结果如图2所示,与对照组比较,模型组结肠IL-10虽上升(p>0.05),表明造模具有导致肠道抗炎因子IL-10分泌增加的趋势。与模型组比较,ET-22实验组1、ET-22实验组3小鼠结肠IL-10均有所增高,其中ET-22实验组3与模型组相比,增幅具有显著差异(p<0.05),表明益生菌ET-22具有促进肠道抗炎细胞产生抗炎因子IL-10的作用。
3.4.4结肠TNF-α检测结果
结肠TNF-α变化结果如图3所示,与模型组比较,ET-22实验组1-3结肠TNF-α均有下降趋势,说明益生菌ET-22可减少肠道炎症反应,减少结肠炎性因子TNF-α的分泌。
3.4.5病理学结果
3.4.5.1病理切片
病理学切片结果如图4所示,对照组小鼠的组织学观察可以看到完整的结肠上皮细胞,并可看到清晰的隐窝结构和杯状细胞。DSS诱导形成的模型组结肠炎小鼠的组织学观察,不能看到完整的结肠上皮细胞,同时出现隐窝不完全、杯状细胞损坏的现象,损坏面积均在50%以上,部分小鼠隐窝完全消失,杯状被完全破坏。另外还可以观察到小鼠炎性细胞浸润,如中性粒细胞和淋巴细胞等。小鼠经ET-22干预后DSS造模,出现了炎性细胞浸润、少部分隐窝消失,杯状细胞被破坏,其中,ET-22实验组1、ET-22实验组2干预后,具有减缓病变范围的趋势,大部分在50%范围内。
3.4.5.2对小鼠组织学伤损评分分析
组织学损伤评分结果如图5所示,与模型组比较,各组结肠组织学伤损评分均具有下降趋势,其中ET-22实验组1、ET-22实验组2组织学伤损评分均显著低于对模型组(p<0.05),说明副干酪乳杆菌ET-22对小鼠结肠损伤具有减轻小鼠结肠炎症症状的作用。
DSS诱导的结肠炎是实验性动物结肠炎模型最常见的方法,通常都是小鼠自由饮用7天左右即可形成实验性结肠炎模型。本试验采用5%DSS作为造模浓度,模型组未出现死亡,且小鼠在第3天开始出现便血情况,随时间延长,便血情况加重,便血只数增加,表明模型建立稳定性好。
ET-22各实验组小鼠出现血便的时间较模型组晚,小鼠血便只数较模型组少,症状较轻,直接表明益生菌的抗炎症反应作用。
IL-6为一种多功能的关键细胞因子,能够调节其他细胞因子的表达。在DSS诱导的实验性结肠炎的过程中,IL-6作为促炎因子,其表达水平的高低与结肠研中炎症程度的深浅有着密切的关系。缺乏IL-10的小鼠表现出严重的肠道炎症,且IL-10在动物结肠炎模型中表现良好的治疗效果。TNF-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子。本研究中,模型组小鼠结肠IL-6显著升高,而副干酪乳杆菌ET-22实验组能够降低结肠组织伤损评分,降低结肠IL-6含量,增加抗炎因子IL-10含量,表明副干酪乳杆菌ET-22具有预防和/或治疗肠道炎症的作用。
除非另有说明,本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”的修饰。因此,除非另有相反的说明,数值参数为近似值,并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明,一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。所附权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚,可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供,并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过所附权利要求书示出,说明书和实施例仅是示例性的。
Claims (10)
1.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于预防和/或治疗肠道炎症的组合物中的用途。
2.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于降低炎症因子的组合物中的用途。
3.权利要求2所述的用途,其中所述炎症因子包括IL-6和TNF-α中的至少一种。
4.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)ET-22菌株在制备用于促进抑炎因子的组合物中的用途。
5.权利要求4所述的用途,其中所述抑炎因子包括IL-10。
6.权利要求1-5任一项所述的用途,其中所述组合物为食品组合物、药物组合物或保健品组合物。
7.权利要求6所述的用途,其中所述组合物为食品组合物,包括例如乳制品、脂肪制品、饮料、水果、蔬菜、豆类、食用菌、藻类、坚果、可可制品、糖果、粮食制品、焙烤食品、肉制品、水产品、调味品、和蛋制品等。
8.权利要求6所述的用途,其中所述组合物为药物组合物,所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。
9.权利要求6所述的用途,其中所述组合物为保健品组合物,包括例如特定保健功能组合物、营养功能组合物、功能标识组合物、和浓缩营养品组合物。
10.权利要求1-9任一项所述的用途,其中所述组合物含乳酸菌菌株的数量为102CFU以上,例如103CFU以上,104CFU以上,105CFU以上,106CFU以上,107CFU以上,108CFU以上,109CFU以上,1010以上,1011CFU以上。
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